Materiales y Métodos

Para investigar la dinámica de imbibición en el endocarpio, se utilizaron dos especies de nanche, Byrsonima crassifolia y Malpighia mexicana. Los experimentos se ralizaron en el Laboratorio de Análisis de Semillas y de Fisiología Vegetal, Ambiental y Biofísica de Botánica del Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo. Los frutos se despulparon friccionandolos en un tamíz metálico hasta eliminar la mayor pulpa posible, los endocarpios se enjuagaron con agua y se secaron a la sombra durante 48h, después se realizaron los siguientes experimentos: en el primero se pesaron 20 endocarpios individuales para cada tratamiento; de cada especie, 80 se escarificaron (con una tijera se les eliminó una porción de testa) y 80 se dejaron intactos, utilizandose cuatro repeticiones. Cada repetición se colocó en algodón dentro de cajas de Petri, se humedecieron con igual cantidad de agua destilada (25mL), sin inundar, se taparon y se colocaron en una cámara de germinación a 25°C, 90% de humedad relativa y 12h luz, adicionando agua constantemente. Con el uso de una balanza electro-analítica (Scientech ZSA 120), los endocarpios se pesaron cada cuatro horas por doce h, posteriormente cada doce h y luego en diferente tiempo, hasta que se obtuvieron pesos constantes o los endocarpios comenzaron a germinar.

En el segundo experimento se utilizaron cuatro repeticiones de 100 endocarpios para cada especie, cada repetición se envolvió en un saco de malla fina de tela, se etiquetaron y pesaron. Se sumergieron en un recipiente con 3L de agua destilada a temperatura ambiente, se colocó dentro del recipiente una bomba de aire para oxigenar el agua. Durante 12h, el peso se determinó cada hora usando una balanza electro-analítica (Scientech ZSA 120), posteriormente, se continuó pesando cada doce h y luego cada veinticuatro h hasta que los pesos se mantuvieron constantes ó disminuyeron. Adicionalmente se realizó un tercer experimento, donde se evaluaron embriones individuales y testa por separado, para ello se contaron cuatro repeticiones de 25 endocarpios de cada especie y con una tijera se abrieron. Sobre cajas de Petri se colocó algodón humedecido con 25mL de agua, se colocaron el o los embriones y a un lado la testa, se mantuvieron en una cámara de germinación a 25°C, 90% de humedad relativa y 12h luz, se humedecieron constantemente. El peso se realizó cada h, luego cada doce h, hasta que se observó peso constante o reducción del mismo.

Todos los experimentos se establecieron en un diseño completamente al azar. En el primero, de la combinación realizada resultaron 4 tratamientos (especies x endocarpios escarificados y completos), en el segundo 2 tratamientos (Malpighia mexicana x Byrsonima crassifolia) y el tercero con 2 tratamientos (Malpighia mexicana x Byrsonima crassifolia). La tasa de imbibición se calculó restando al peso de los endocarpios después de la imbibición el peso inicial, se obtuvieron porcentajes, se realizó análisis de varianza y comparación de medias (Tukey α=0.05) empleando el programa Statiscals Analysis System® (SAS) versión 9.11. Los gráficos se realizaron con el programa SigmaPlot 11.0.lnk.

Resultados

Primer experimento: La cinética registrada en los endocarpios de las dos especies, mostraron diferencias entre el tiempo y la cantidad de agua imbibibida (α=0.05) (Cuadro 1); donde, en las primeras 4h de absorción se alcanzó hasta 21,30 y 74,07 % en semillas completas; mientras que, en los endocarpios escarificados fue de 18,63 y 98,59%, cabe mencionar que son especies diferentes, lo que generó dichos resultados. Los endocarpios de Byrsonima crassifolia son de testa dura y leñosa, considerando éste factor se encontró que estadísticamente no hay diferencias significativas en que imbiban 8 ó 68h; sin embargo, hasta las 60h fue donde la absorción fue continua y, posteriormente se encontró disminución de peso hasta las 144h. Los endocarpios escarificados hasta las 12h presentaron imbibición continua, luego disminución y aumentos pero sin diferencias estadísticas; por otro lado, en endocarpios completos se alcanzó a observar una fase de la cinética del agua, y, en los escarificados dos, incluyendo a la tercera que originó la emergencia de la radícula de la plántula.

Malpighia mexicana presenta endocarpios fibrosos, donde se concentran altas cantidades de agua; los endocarpios completos imbibieron de manera continua durante 24h, luego se observó una pequeña pérdida que se recupero hasta las 60 h, indicando que es el tiempo adecuado para la imbibición, debido a que lapsos mayores ya no presentan diferencias significativas; la cinética de los endocarpios escarificados mostraron imbibición continua durante 60h, con 180, 30 % de agua, luego a las 120h una pérdida de 11.03%, observandose claramente las fases imbibitorias en ésta especie.

Los endocarpios completos y escarificados de Byrsonima crassifolia imbibieron similar cantidad de agua (Fig. 1); pero a las 4h y de las 120h en adelante, los no escarificados presentaron entre 2 y 5% mayor imbibición, con respecto a los escarificados. El experimento se mantuvo hasta las 168h, tiempo en el que se detuvieron las mediciones debido al inicio de la protrusión de la radícula. Los endocarpios escarificados a las 60h iniciaron una reducción de la imbibición, aumentando a las 120h pero en menor peso a los no escarificados; en esta especie, la máxima absorción de agua fue de 36,04%, mientras que en Malpighia mexicana de 188,94%, cantidad equivalente a casi el doble de su peso.

Las dos especies presentaron mayor absorción de agua durante las primeras 4h después de establecido el experimento (Fig. 1). Malpighia mexicana presentó tasas relativamente altas en comparación con Byrsonima crassifolia. En Malpighia mexicana se observó que la imbibición fue continua, con picos de mayor absorción a las 24 y 60h, posteriormente se encontró una reducción, a las 120h inició una recuperación y con mayor aceleración a partir de las 144h. En las dos especies de nanche se presentó diferente cinética del agua; se observó que al inicio imbiben mayor cantidad, luego disminuye para después reiniciarse nuevamente.

Fig. 1 Dinámica de imbibición de agua en () () endocarpios completos y () () escarificados de Malpighia mexicana A. Juss. y Byrsonima crassifolia (L.) H. B. K., respectivamente. 

Segundo experimento: La cinética del lote de endocarpios sumergidos en el agua mostraron diferencias estadísticas entre el tiempo y la cantidad de agua imbibibida (α=0.05) (Cuadro 2); las dos especies alcanzaron la máxima imbibición a las 240h pero con descensos intermedios, donde Byrsonima crassifolia presentó una disminución y Malpighia mexicana dos, siendo a las 48h la primera y a las 120h la segunda, además de que ésta especie imbibió 3 veces más agua que Byrsonima crassifolia.

A medida que los endocarpios se mantuvieron sumergidos en el agua aumentó la imbibición; sin embargo, éste suceso es hasta cierto tiempo (Fig. 2). El lote de endocarpios de Byrsonima crassifolia presentó 30,59% de absorción inical, luego fue aumentando lentamente hasta las 96 h, donde hubo una reducción que se recuperó a los 5 días, manteniendose sólo un día y volvió a descender, luego a los 8 días iniciaron pequeños incrementos hasta los 13 días, donde hubo una disminución constante, posteriormente se realizaron observaciones a los embriones y se encontró el 100% muertos, el remojo prolongado causó esta situación, debido a que la imbibición excesiva provocó muerte por ósmosis de solutos hácia el exterior.

Fig. 2 Dinámica de imbibición, en lotes de 100 endocarpios sin escarificar de () Malpighia mexicana A. Juss. y () Byrsonima crassifolia (L.) H. B. K. 

El lote de Malpighia mexicana imbibió mayor cantidad de agua (Fig. 2). La respuesta fue similar a la cinética de imbibición realizada en los endocarpios individuales; sin embargo, aquí los endocarpios se mantuvieron en agua durante todo el experimento, ello permitió observar y medir con mayor exactitud. Se encontró que a los 60min del establecimiento, Malpighia mexicana imbibió el 96,32% de agua, posteriormente hasta las 11h aumentó su peso pero de forma discreta, continuando con una rápida absorción por 37h (hasta las 48h), donde inció un descenso y, a las 60h nuevamente se mantuvo constante, hasta las 84h, empezando a imbibir nuevamente, pero a las 96h descendió hasta los 8 dias, para posteriormente volver a absorber hasta los 11 días, donde comenzó una pérdida sin recuperación.

Tercer experimento: La cinética del agua en embriones y testa de las especies evaluadas registraron diferentes tasas de imbibición en poco tiempo (α=0.05) (Cuadro 3). El embrión de Byrsonima crassifolia en la primera hora imbibió 85,49% de agua en relación a su peso, no mostrandose aumentos superiores a éste en el tiempo, pero sí descensos con diferencias estadísticas; además, durante las 53h de evalución se encontraron tres fases con aumentos y disminuciones constantes, donde naturalmente había activación interna para el desarrollo del embrión, y la testa o barrera protectora del endocarpio absorbió hasta 39,72% de agua; Por otro lado, los embriones de Malpighia mexicana imbibieron 69,02% durante la primera hora de iniciado del experimento, luego disminuyó durante las 2 y 3h, con recuperación a las 5h pero sin diferencias estadísticas, excepto a las 53 h donde ya hubo mayor disminución y daño del embrión; la testa del endocarpio de ésta especie alcanzó valores de hasta 197,9 %, absorbiendo altos porcentajes, como resultado de su morfología.

Los resultados de la Figura 3 muestran que el embrión de Byrsonima crassifolia absorbe agua en mayor cantidad que la testa. Se observó que cuatro horas después de iniciado el experimento, la testa presentó 39,08% de imbibición; comparando éstos resultados con los de la Figura 1, se observa que un endocarpio completo sin escarificación, en el mismo tiempo absorbe 18,09% menos que la testa; sin embargo, fue interesante observar que cuando se evaluó el embrión solo, después de la primera hora, absorbió 86,60% de su peso, después mantuvo un descenso; posteriormente, a las 3h nuevamente inicia un incremento hasta las 5h, y después se presenta un fuerte descenso de manera constante, situación que no se pudo observar en el experimento 1 y 2.

Fig. 3 Dinámica de imbibición en () () testa y () () embriones por separado, de Malpighia mexicana A. Juss. y Byrsonima crassifolia (L.) H. B. K.). 

Los embriones de Malpighia mexicana presentaron menor imbibición que los de Byrsonima crassifolia (Fig. 3); donde éstos, de Malpighia mexicana una hora después de iniciada la cinética de imbibición, absorbieron 67,13% de agua, seguido de un descenso continuó hasta las 3 h, posteriormente una recuperación hasta las 5h y luego descendieron sin recuperación; durante todo el tiempo de evaluación, en los embriones de las dos especies se encontró una situación semejante. En Malpighia mexicana, la testa imbibió más de 150%, con ascensos y descensos hasta alcanzar casi 200%, pero a las 29h inició un descenso continuó. En Byrsonima crassifolia 4 h después de iniciada la imbibición, el embrión más la testa absorbieron 105,12 %, cuando un endocarpio sin escarificar imbibe 20,99%, encontrandose una diferencia de 126,11 %, indicando que los endocarpios de ésta especie presentan baja permeabilidad.

La gráfica comparativa (Fig. 3) indica que la testa de Byrsonima crassifolia no mostró un incremento acelerado inicial del peso, como lo hicieron los embriones, ésta diferencia se debió a la intervención de la testa en el proceso de imbibición, este proceso en las semillas es un factor imprescindible para que se conozca si existe permeabilidad o no; en endocarpios completos de Byrsonima crassifolia, se encontró absorción de apenas un poco más de un tercio de su peso; pero en lotes, ésta misma especie imbibió más de la mitad de su peso. Malpighia mexicana por el tipo de testa fibrosa que presenta, absorbió mayores cantidades de agua que el propio embrion, pues al parecer en esta especie, que desarrolla en zonas tropicales y subtropicales, los embriones en vez de imbibir, liberaron solutos, reduciendo constantemente su peso, la lixiviación de contenidos celulares afectó negativamente los procesos, causando daños negativos. En esta investigación al no conocer a fondo las especies estudiadas se realizó la imbibición del embrión y de su cubierta por separado, encontrando que el embrión tanto de Byrsonima crassifolia y Malpighia mexicana absorbieron rápido y en cantidades cercanas, y la testa imbibió cantidades similares a las del endocarpio completo, interviniendo ésta fuertemente en la entrada de agua hácia el embrión.

Discusión

Cada endocarpio imbibió según el grado de dureza y permeabilidad, dado por la especie; siendo la disponibilidad del agua el principal factor para la cinética de imbibición. Investiaciones realizadas por ^{Azerêdo et al. (2005}), mencionan que la imbibición de agua a temperatura ambiente, durante 38h en endocarpios de acerola (Malpighia punicifolia) generan altos porcentajes de germinación; caso similar al de ésta investigación, donde el nanche rojo a las 36h había imbibido 150% de agua.

Las dos especies evaluadas respondieron a la imbibición luego de entrar en contacto con el agua, caso que coincide con los estudios realizados en Swietenia macrophylla, donde indican que durante la imbibición hay un incremento considerable en peso (^{Paiva, Lemos Filho & Oliveira, 2006}), y ^{Méndez Natera, Merazo y Montaño (2008}), observaron el mismo patrón de absorción rápida, luego una fase de detención y nuevamente un incremento aunque más lento, terminado por la protrusión de la radícula. Investigaciones realizadas con semillas de maíz indican diferentes fases de aumentos y descensos en las tasas de imbibición, lo que se debe a la activación del embrión para su desarrollo y transofrmación a plántula (^{Rangel Fajardo, Córdoba-Téllez, Cárdenas-Soriano, 2014}).

Los endocarpios se mostraron sensibles al exceso de agua, pues la permeabilidad considerada en Byrsonima crassifolia ayuda a que resista y en consecuencia la imbibición se lleve de manera lenta y continua; pero si en ningún momento se elimina el exceso de agua terminan muriendo, lo que indica que los endocarpios, cuando se exponen a humedad en exceso están propensos a sufrir lesiones, caso que también se observó en semillas de soya (^{Jitsuyana, Hagihara & Konno, 2014}).

Malpighia mexicana es una especie que tiene endocarpios con testa fibrosa, lo que conlleva a que al inicio de la imbibición gran parte del agua sea absorbida por la fribras externas que presenta; sin embargo, las dos especies evaluadas presentaron imbibición, con variación en el tiempo y de acuerdo a la especie en tres ocasiones se encontró aumento y disminución en el peso, de tal manera que en Malpighia mexicana se observaron con mayor exactitud las tres fases de incremento y decremento en la absorción de agua, como lo mencionan ^{Bewley y Black (1994}) y ^{Mei y Song (2008}); mientras que, en Byrsonima crassifolia al presentar una testa con baja porosidad, provocó que se encontraran incrementos pequeños pero constantes (^{Carvalho & Nascimento, 2008}).

Byrsonima crassifolia se caracteriza por presentar un endocarpio leñoso con surcos sinuosos y poros pequeños, y en cada uno hay tres embriones ocupando el 64,3%, y sólo el 35,7% es testa (^{Maldonado Peralta et al., 2014}), la dureza de ésta protege y permite el paso del agua en forma lenta, el embrión sin testa absorbe agua en casi el doble de su peso en poco tiempo, en seguida se observa disminución constante de peso, dando lugar a la activación de eventos internos fisiológicos y bioquímicos (^{Carvalho & Nakagawa, 2000}).

En endocarpios completos de acerola la imbibición de agua a temperatura ambiente, entre periodos de 38 a 48h proporcionó mejor viabilidad y vigor durante la germinación (^{Azerêdo et al., 2005}); sin embargo, semillas de Hymenaea courbaril L. respondieron mejor a la germinación cuando la imbibición fue por 24h que a 48h (^{Orozco-Cardona, Franco-Herrera & Taborda-Beltrán, 2010}). ^{Maldonado Peralta et al. (2016b}), investigaron embriones de Malpighia mexicana y Byrsonima crassifolia, y encontraron 90% de endocarpios viables vigorosos, y que Byrsonima crassifolia presenta latencia física provocada por la testa.

^{Moreno et al. (2006}) mencionan que la testa interviene fuertemente en el proceso de imbibición. ^{Bewley y Black (1994}), mencionan que la imbibición es la primera etapa de la germinación y la permeablidad que mostró la testa permitió observar que la absorción de agua es estable durante el proceso y se reduce por la influencia de la testa, esto en gran medida indica que la presencia de la testa en el endocarpio retrasa naturalmente el proceso de germinación y que en condiciones adversas de campo protege la descendencia; también indicaría que los endocarpios de Byrsonima crassifolia presentan latencia física (^{Maldonado Peralta et al., 2016b}), lo que ocasiona que la germinación y el crecimiento de la plántula se retrase (^{Carvalho & Nascimento, 2008}), y que si no existen condiciones de humedad y temperatura, solo se dañe el endocarpio o el embrión sin que llegue a germinar. Además, cuando se remueve la cubierta el agua entra directo, causando un daño irreparable en el sistema de las membranas embrionales (^{Castro, Bradford & Hilhosrt, 2004}; ^{Jara, 1996}).

Cuando se pretende realizar germinación, es necesario probar la viabilidad de las semillas, después utilizar tratamientos pre-imbibitorios o de escarificación, para ello existen aquellos que cuando se requieren aplicar en gran escala son efectivos (^{Piroli, Castillo, Vieira & Udenal, 2005}) pero difíciles o lentos (^{Oliveira, Davide & Moreira, 2003}), lo cual requiere buscar los que sean simples, económicos y que rompan latencia. Tanto para la imbibición como para la germinación, el tiempo se reduce considerablemente cuando se elimina la testa de los endocarpios, seguido por un mayor tiempo al sólo escarificar y aún mayor cuando se dejan éstos intactos (Yépez & Arboleda, 2009).

La tasa de imbibición para cada especie de nanche es diferente. El endocarpio completo de Byrsonima crassifolia imbibe tasas bajas comparadas con las de Malpighia mexicana, en la que se alcanzó una absorción casi dos veces mayores a su peso. La testa de Malpighia mexicana es la que absorbe mayor cantidad de agua, mientras que en Byrsonima crassifolia es el embrión; sin embargo la testa tiene gran influencia en el proceso de imbibición. Byrsonima crassifolia presentó latencia física, los embriones de las dos especies presentaron comportamiento similar en la imbibición.