SciELO - Scientific Electronic Library Online

 
vol.34 suppl.Seroprevalencia de Chlamydia pneumoniae en una población pediátrica de Costa RicaAmbigüedad genital author indexsubject indexarticles search
Home Pagealphabetic serial listing  

Services on Demand

Journal

Article

Indicators

Related links

  • Have no similar articlesSimilars in SciELO

Share


Revista Médica del Hospital Nacional de Niños Dr. Carlos Sáenz Herrera

Print version ISSN 1017-8546

Rev. méd. Hosp. Nac. Niños (Costa Rica) vol.34  suppl.0 San José Jan. 1999

 

Pruebas de sensibilidad antimicrobiana
Métodología de laboratorio
 
 
Dr. Marco Luis Herrera*
 
 
 
Consideraciones Generales
 

La prueba de sensibilidad antimicrobiana es una de las tantas armas con las que contamos en el laboratorio para ayudar a los profesionales en medicina controlar los procesos infecciosos que se desarrolla en los pacientes(4).

Pero para poder desarrollar todo el potencial con que se cuenta hay que cumplir con un requisito fundamental: es necesario lograr el aislamiento del agente productor del cuadro clínico mediante los cultivos correspondientes.

Hay un axioma que no pierde actualidad y sobre el que es indispensable insistir: Primero cultivar y luego medicar.
 
Antes de medicar (antibióticos) a un paciente, asegúrese de que ya se hayan recolectado las muestras para realizar los cultivos que requiere un buen diagnóstico. Esto asegurará hasta un máximo las posibilidades de aislar el agente etiológico.

Contando ya con dicho agente el laboratorio puede hacer uso de las diferentes técnicas que se han desarrollado para guiar de la mejor manera posible al médico, en la escogencia del antibiótico a emplear en el control del proceso infeccioso.

Como un comentario adicional, hay que recordar que muchas veces, lo que se observa in vitro no correspondiente a lo observado in vivo, razón por la cual, los señores clínicos deben poner especial atención en el seguimiento clínico de su paciente. La no concordancia entre los hallazgos en el laboratorio y la respuesta del paciente a la terapia antimicrobiana, tiene diferentes explicaciones, algunas de las cuales tienen relación con el comportamiento de los microorganismos y otras con el comportamiento individual de cada paciente.

Un ejemplo para el primer caso es la producción en el paciente de enzimas inducidas durante el curso de una terapia antimicrobiana, enzimas que tienen la propiedad de inactivar el antibiótico sólo en el paciente(9).

Por otra parte, siempre es conveniente revisar si realmente el paciente está ingiriendo el antibiótico como corresponde, si está siendo administrado en el plazo y en la concentración adecuada para ese paciente, sin olvidar la idiosincracia del mismo.

La razón fundamental de una prueba de sensibilidad es la de realizar una predicción a través de una prueba in vitro, observar la respuesta del paciente a un determinado antibiótico, la evolución de la infección y detectar una resistencia relevante del organismo que está causando este proceso infeccioso(4).

Hay aún muchos agentes microbianos para los cuales la escogencia de una terapia antimicrobiana continúa siendo empírica, porque estos agentes no han desarrollado resistencia contra los antibióticos(1).

Por esta razón, la prueba de sensibilidad adquiere una mayor importancia para algunas especies     bacterianas que no tienen una sensibilidad predecible. Ejemplos claros de este último tipo de microorganismos son: Staphylococcus sp., Enterococcus sp., Pseudomonas sp. y los miembros de la familia Enterobacteriaceae(4).

Otros organismos donde la prueba de sensibilidad, sobre todo en los últimos años, ha adquirido una gran importancia son: Streptococus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae y Mycobacterium tuberculosis(4).

Para efectuar las pruebas de sensibilidad, se cuenta con los siguientes métodos(4).

A.    Difusión en agar (Técnica de Bauer & Kirby)

B.     Dilución en agar

C.     Macrodilución en caldo

D.     Microdilución en caldo

E.     Epsilon test (E test)

F.     Métodos aumatizados

G.     Pruebas especiales.

Sin que importe el método a emplear, hay tres facetas o pasos que se deben considerar: el medio de cultivo a emplear, el antibiótico a utilizar y la cepa bacteriana a probar. Cualquiera que sea el método hay que controlar cada una de estas tres variables y cada una de ellas es importante a su manera.

Vamos a discutir en primer lugar lo concerniente al medio de cultivo.

Según el método a emplear y según el agente a estudiar, hay varios medios de cultivo que se pueden utilizar.

El más conocido es el Müeller-Hinton ya sea en agar o en caldo, el cual se emplea en los métodos de difusión y de dilución enagar; además, el reforzado con sangre de carnero al 5%, para la detección de la sensibilidad del Streptococus pneumoniae(1). Otro medio de cultivo usado en especial para la prueba de sensibilidad del Haemophilus influenzae es el HTM (Haemophilus Test Media). Para la Neisseria gonorrhoeae, puede utilizarse el medio de cultivo conocido como agar chocolate con una base de GC y enriquecido con Isovitalex al 2%(1).

Todos estos medios de cultivo deben ser preparados de la mejor manera posible, ajustando el pH, y asegurnádose de que la concentración del agar sea la correcta. En especial, para la técnica de la difusión en agar, estos parámetros deben ser aún más claramente controlados. Un agar muy suave, puede producir falsa sensibilidad y a su vez, un agar muy duro, puede producir una falsa resistencia, al incidir en un cambio en la velocidad y distancia de la difunsión del antibiótico(16).

También cambios en el pH, pueden producir falsa resistencia o falsa sensibilidad al incidir en la polaridad de los antibióticos. A la hora de preparar el medio de cultivo, este pH debe ser correctamente regulado.

Otro punto de gran importancia es la profundidad del agar, la cual debe ser exactamente de 4 mm. Un agar delgado, permite una mejor difusión de los antibióticos produciendo una falsa sensibilidad, pero también un agar con más de 4 mm de profundidad puede producir una disminución en la migración (difusión) del antibiótico con la consiguiente falsa resistencia.

Además, los medios de cultivo deben ser lo más frescos posible, con no más de 7 días de preparados y siempre deben ser guardados en bolsas plásticas selladas y a 4°C(16).

Cada vez que se va a preparar el medio de cultivo, hay que asegurarse que el polvo esté en buenas condiciones, sin cambios de color y de consistencia y por supuesto, que sea polvo (no hidratado).

En cuanto al antibiótico, las consideraciones son las siguientes:

Podemos tener cuatro tipos de posibilidades, discos de papel impreganados con una concentración conocida del antibiótico, pastillas con una concentración conocida del antibiótico, preparaciones farmacéuticas del antibiótico o tiras de plástico con una matriz propia y una gradiente decreciente del antibiótico determinado.

Lo importante es que estas diferentes presentaciones del antibiótico estén en la mejor condición posible, que se respete la cadena de frío, que no se humedezcan, y que realmente contengan la concentración del antibiótico que dice tener(16).

En cuanto a la cepa bacteriana, es indispensable que sea fresca (un periodo de incubación no mayor de 24 horas) y que haya sido crecida en un medio de cultivo no inhibitorio(16).

Siempre se debe ajustar la concentración del inóculo de la cepa a probar. Esto significa que debemos estandarizar dicho inóculo(16).

Esta estandarización puede realizarse utilizando el estándar de McFarlane o utilizando un nefelómetro. En ambos caos, la estandarización se hace hasta el estándar 0,5 de McFarlane(16).

Es conveniente, cada cierto tiempo, revisar el inóculo, haciendo un plateo y un conteo colonial con la finalidad de asegurarse de que se está preparando correctamente(16).

Para la preparación del inóculo lo más recomendable es usar aguar destilada estéril; también puede usarse solución salina al 0,4% o un caldo nutritivo(1, 16).
 

A-Disfusión en agar (Técnica de Bauer & Kirby)

La técnica de difusión en agar(16), es cualitativa y sus resultados se pueden interpretar únicamente como sensible, intermedio o resistente, y está diseñada específicamente para bacterias de crecimiento rápido domo los Staphylococcus sp. O los integrantes de la familia Enterobacteriaceae.

Esta técnica, el inóculo bacteriano llevado a una concentración igual a la del estándar 0,5 de McFarlane, se aplica sobre la superficie de una placa seca de agar Müeller-Hinton que tenga un pH entre 7, 2 y 7,4 medido a temperatura ambiente y una vez solidificado el medio de cultivo. La cepa se debe rayar sobre la superficie del medio de solidificado el medio de cultivo. La cepa se debe rayar sobre la superficie del medio de forma tal que se logre un crecimiento confluente(16). Una vez realizado esto, en un plazo no mayor de 15 minutos, se procede a colocar los discos o las pastillas con el antibiótico.

Si se emplean placas de petri de 100 mm de diámetro, el número máximo de discos a colocar es de 5(1,16).

Luego, la placa se incuba a 35ºC en aire ambiente y por un periodo no mayor a las 18 horas excepto para los aislamientos de Staphylococus sp y Enterococcus sp, para los cuales se recomienda una incubación de 24 horas, principalmente para lograr una mejor detección de la resistencia a la oxacilina y a la vancomicina(16).

Cada plato es observado en una luz indirecta y cada halo de inhibición es medido utilizando un caliper o en su defecto una regla graduada en la forma adecuada. En el caso de que no se presente un halo, no se debe reportar Omm, se debe reportar 6 mm, ya que ese es el diámetro del disco.

Los diámetros alrededor de cada disco son medidos y su interpretación se basa en guías publicadas cada cierto tiempo, por la NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) y el organismo es reportado como sensible, intermedio o resistente al antibiótico testado(1, 4, 7, 16).

Cada antibiótico tiene su halo de inhibición específico y éste depende del tamaño de la molécula del     antibiótico y su polaridad; de esta manera, un antibiótico con un peso molecular bajo como la penicilina, tendrá mucha capacidad para migrar, por lo tanto su halo, en el caso de una cepa sensible tendrá un diámetro muy amplio. En el caso de la vancomicina, que tiene una molécula muy grande y muy hidrofóbica, su halo de inhibición será muy pequeño. De esta manera, no se puede afirmar, que para una cepa determinada, ésta es más sensible a la penicilina que a la vancomicina, sólo porque el primero tenga un halo de inhibición mucho mayor(16).

La técnica de difución en agar, presenta varias ventajas como:

a.    es fácil de efectuar y de gran reproducibilidad

b.    bajo precio

c.    no requiere equipo especial

d.    sus resultados son fácilmente interpretados por los clínicos

e.    es muy flexible a la hora de escoger los antibióticos a probar(16).

Dentro de sus desventajas está el hecho de que brinda sólo información  cualitativa. Otra desvetaja y la más importante, es que esta técnica debe ser modificada para poderla emplear en organismos fastidiosos o de crecimiento lento(1, 16).

Organismos con Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoecae, Streptococcus pneumoniae y Moraxella catarrhalis, necesitan de una técnica de difusión modifica, modificación que se hace principalmente en el periodo de incubación, en el medio de cultivo a emplear, en la atmósfera de incubación y en la preparación del inóculo(1).

Para Haemophilus influenzae, lo recomendado es poner a crecer al organismo en un agar chocolate suplementado, preparar el inóculo en un caldo de Müeller-Hinton o solución salina estéril al 0,9%, realizar la prueba de sensibilidad sobre el agar HTM e incubarlo a 35ºC por 16 a 18 horas en una atmósfera de 5 a 7% de CO2(1).

Para Neisseria gonorrhoecae se debe utilizar agar base GC suplementado(4) y para Streptococcus pneumoniae agar sangre al 5% y que tenga Müeller-Hinton como base. Para ambos, la incubación debe ser un poco más prolongada que para H. Influenzae (20 a 24 horas), manteniendo el resto de condiciones igual (35ºC y 5 a 7% de CO2)(1).

Para estos agentes fastidiosos, existen guías propias de la NCCLS que se emplean para conocer si las cepas se reportan como sensible, intermedio o resistente(7).

En especial, para el caso del Streptococcus pneumoniae, lo recomendado es el empleo de un disco de oxacilina de 1 ug de potencia. Una vez incubado por 24 horas, si el halo encontrado es menor de 20 mm, la cepa se considera resistente y debe ser confirmado realizando una prueba más específica que nos informe hasta dónde llega esa concentración(1,16). Para esto se hace una CMI, ya sea por microtitulación o por la técnica del E test(1, 8).

Por el contrario, si el halo de inhibición es mayor de 20 mm, se considera que la cepa es sensible a la penicilina, con una concentración mínima inhibidoria menor de 0,006 ug/ml(1).
 

B-Método de Dilución en agar

Siendo la técnica de difusión en agar únicamente cualitativa, y teniendo en mente que en muchas oportunidades clínicas se hace necesario conocer con exactitud qué concentración de antibiótico es la necesaria para lograr controlar un proceso infeccioso dado, es evidente la necesidad de contar con metodología que solvente ese problema.

Se han desarrollado varios métodos en este campo como son las técnicas de la dilución en agar, la microtitulación y el E test(16). En éstas lo que se pretende es hacer un gradiente decreciente de la concentración de un antibiótico dado y probarlo contra un inóculo bacteriano estandarizado.

Al igual que la técnica de difusión, en las de dilución, hay que controlar el medio de cultivo, el inóculo bacteriano y el antibiótico.

De este tipo de técnicas podemos mencionar tres: la dilución es agar, la dilución en tubo y la microtitulación.

La dilución en tubo sigue siendo el estándar dorado de las pruebas de sensibilidad, o sea, es la técnica de referencia, aun cuando, ante todo presenta el problema de la contaminación y la dificultad para detectarla.(16)

En la técnica de la dilución en agar, se preparan tubos con la concentración definida de antibiótico y se le agrega a cada tubo una cantidad conocida del agar Müeller-Hinton, este tubo se homogeniza y se chorrea en una placa de Petri vacía con lo que se logra una placa de agar Müeller-Hinton con el antibiótico diluido a una concentración determinada(16).

Generalmente se inicia a una concentración de 128 ug/ml y se hacen diluciones dobles hasta obtener el gradiente decreciente en la concentración de antibiótico (64; 32; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,06 ug de droga activa)(16).

La escogencia de la concentración en la que se inicia el gradiente, depende del antibiótico y del tipo de cepa a probar.

Para inocular el medio de cultivo, se emplea un inoculador conocido como el inoculador de Steer. Este es una placa de metal de 32 pozos y una lámina de metal con 32 proyecciones que toman, cada una, 20 ul del inóculo estandarizado del agente y que se coloca sobre la superficie del agar con antibióticos. Adicional a esto, se inocula una placa de Müeller-Hinton sin antibiótico, que sirve como control positivo de crecimiento. La placa se incuba a 35ºC por 18 a 24 horas y se revisa el crecimiento, siempre contra el control positivo.

Si la cepa logra crecer en la superficie del medio de cultivo, se reporta como resistente a esa concentración del antibiótico. Si, por el contrario, no crece, se reporta como sensible a esa concentración de antibiótico.

Con esta técnica, se puede obtener la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI), la que se define como la mínima concentración de antibiótico que inhibe el crecimiento de una cepa bacteriana determinada(16).

Preparar toda una gradiente de medios de cultivo con una concentración decreciente de antibiótico, hace que esta técnica sea muy engorrosa por lo que en realidad se utilizan sólo dos diluciones, una arriba del punto de quiebra del antibiótico y otra debajo de este valor. El punto de quiebra es un valor matemático, que expresa un punto o concentración arriba del cual la cepa se debe interpretar como resistente al antibiótico(16).

Basándose en este criterio, al escogerse dos concentraciones, una abajo y otra arriba del punto de quiebra, si la cepa crece en las dos concentraciones es resistente, si crece sólo en la concentración bajo el punto de quiebra, la cepa es intermedia y sensible si no crece en ninguna.

A un utilizando sólo dos concentraciones, esta técnica exige mucho trabajo técnico y es lenta para la     interpretación de los resultados; por eso se ha empleado otra técnica derivada de ésta: la microtitulación(16).
 

C-Macrotitulación en tubo

Esta técnica se deriva de la anterior, pero no se utiliza por la cantidad de material que emplea, y porque presenta el grave problema de la dificultad para detectar contaminaciones del medio de cultivo, lo que podría producir una falsa resistencia.

Sin embargo, la técnica que se usa es la misma de la microdilución y la interpretación es la misma también(16).
 

D-Microtitulación

Aquí empleamos unas placas plásticas, estériles, con tapa, de 96 pozos y un fondo en U(16).

Cada placa permite realizar una CMI de un antibiótico a ocho cepas diferentes, o una CMI de una cepa contra ocho diferentes antibióticos.

El medio de cultivo empleado es Müeller-Hinton en caldo o el medio caldo HTM, si la cepa a estudiar es un Haemophilus sp.(16).

La cepa se prepara en las mismas condiciones de turbidez, pureza  y crecimiento de todas las pruebas de sensibilidad.

Para preparar las diferentes diluciones del antibiótico se parte de una solución madre que se debe diluir en las condiciones adecuadas para cada antibiótico. Esta solución madre es diferente para cada antibiótico y su escogencia depende del tipo de antibiótico y la cepa a probar.
 
Con esa técnica se pueden determinar dos diferentes valores: la CMI y la CMB(16).

La CMI ya la hemos definido como la mínima concentración de antibiótico que inhibe el crecimiento posible de un inóculo bacteriano estandarizado. La CMB es la mínima concentración de un antibiótico que mata el 99,9% de las bacterias de un inóculo inicial.

Esto nos indica lo necesario que es conocer con toda exactitud el número de ucf/ml del inóculo estandarizado.

El primer paso para proceder al montaje de una CMI/CMB utilizando la técnica de la microtitulación es colocar 50 ul del medio de cultivo en cada uno de los pozos de la placa a emplear(16). Luego se colocan 50 ul de la solución madre del antibiótico, teniendo en cuenta que estamos haciendo una dilución 1: 2, por o que si la solución madre tiene 512 ug/ml, en el primer pozo tendríamos una concentración real de 256 ug/ml, luego procedemos a realizar diluciones dobles hasta los pozos 10, dejando el 11 como control de crecimiento negativo y al pozo 12 de control positivo de crecimiento. El control positivo tiene medio de cultivo más el inóculo bacteriano y el control negativo tiene medio de cultivo y antibiótico, para un volumen final de 100 ul en ambos pozos(16).

En los pozos de 1 a 10 (con excepción de pozos 11 y 12), colocamos 50 ul de la solución madre (en este ejemplo de 512 ug/ml) en el primer pozo y realizamos diluciones dobles hasta el pozo 10 del cual eliminamos 50 ul, siempre para un volumen hasta el momento de 50 ul en cada pozo(16). Por último se colocan 50 ul del inóculo bacteriano estandarizado.

Resumiendo, en el primer pozo hemos puesto 50 ul de medio de cultivo, 50 ul de la solución madre de 512 ul, hemos sacado 50 ul y hemos colocado 50 ul del inóculo bacteriano. En este primer pozo la concentración del antibiótico, si iniciamos con la solución madre de 512 ul, sería de 128 ug, por consiguiente, el pozo 2 tendrá una concentración de 64 ug, el siguiente de 32, el siguiente de 16 y así hasta el pozo 10 que tendría una concentración final de 0,125 ug/ml.

La placa se incuba a 35ºC por 18 a 24 horas, cubierta, ya sea con la tapa de la placa o con un plástico adhesivo permeable al oxígeno.

Una vez lista la placa, se hace una serie de diluciones del inóculo, se realiza el plateo final en un medio de cultivo apropiado a la cepa y se incuba en las condiciones apropiadas hasta el otro día. Luego de este periodo de incubación, se cuentan las ufc, se multiplican por la dilución y se obtiene la concentración (ufc/ml) del inóculo empleado(16).

La interpretación es relativamente sencilla, la CMI se determina viendo en cuál pozo no hay crecimiento, usando como referencia el control positivo en el cual sí hay crecimiento. La CMI será la concentración del último pozo en el cual no hay crecimiento. Para obtener la CMB, de aquellos tubos en los que no se observe crecimiento, se extraen 10 ul y se inoculan en el medio de cultivo, se incuba y luego se cuentan las colonias que crecen y esto se refiere al conteo bacteriano del inóculo inicial. Generalmente la CMB es una o dos diluciones más alta que la CMI(16).

Por supuesto, esta técnica consume una gran cantidad de tiempo y trabajo, por lo que recientemente una casa comercial sueca, desarrolló una variación sustancial de esta técnica y la llama E test o Epsilon test(7, 16).
 

E-E test

Este método emplea una tira con una matriz plástica que tiene una concentración decreciente de un antibiótico determinado. El medio que se usa es agar sangre con sangre de caballo al 5% y con una base de Müeller-Hinton o puede utilizarse agar HTM o agar chocolate suplementado.

Aquí, se determina solamente la CMI y ésta se encuentra en la interfase de la elipse(7, 16). La lectura debe ser muy cuidadosa y puede hacerse con la ayuda de una lupa.

Se recomienda que, si la interfase cae entre dos puntos, se escoja la concentración más alta y también es muy importante la observación de pequeñas colonias presentes en las zonas de bajo crecimiento, lo que puede indicar resistencia o bajos niveles de ésta.

En E test ha venido a resolver una serie de problemas y a hacer más rápida y fácil la determinación de la CMI. Actualmente, se pueden adquirir tiras de E test para pruebas de sensibilidad de las bacterias tradicionales y de las especiales como organismos anaerobios, Campylobacter sp., Helicobacter pylory y Micobacterium tuberculosis.

Hay también, E test para sensibilidad de los organismos levaduriformes(7).

Nos faltan dos temas importantes, el primero de ellos es la discusión de los métodos automatizados y por último aquellos métodos llamados espaciales.
 

F-Métodos automatizados

En cuanto a los métodos automatizados(3), revisaremos solamente el único sistema con el cual se ha acumulado una amplia experiencia en el Hospital Nacional de Niños. Se trata del Sistema Automatizado Vitek de la casa comercial BioMerieux(13).

Este utiliza tarjetas de plástico transparente para la prueba de sensibilidad. Se trata de tarjetas de 30 pozos que llenan con el inóculo bacteriano estandarizado, mediante una bomba de vacío y luego las tarjetas son selladas herméticamente, se introducen a un incubador a 35ºC y cada 10 minutos el sistema hace una lectura y se mide la concentración del inóculo bacteriano. Cada tarjeta tiene un pozo control positivo de crecimiento y es este pozo donde se construye una curva normal de crecimiento bacteriano(13).

Cada uno de los pozos de antibióticos es referido al control positivo de crecimiento y la curva obtenida en cada uno a su vez, se controla la curva normal obtenida en el pozo de control positivo.

Así pues, una cepa resistente, tendría una curva exacta o muy parecida a la normal, una cepa intermedia presentaría una curva mucho menos amplia y con un menor recuento bacteriano que el control; una cepa sensible, no tendría una curva, tendría una línea recta(13).

Es importante mencionar que una prueba de sensibilidad realizada en un sistema automatizado, proporciona un dato que se aproxima a una CMI ya que estos sistemas trabajan con 2 ó 4 diferentes concentraciones del antibiótico, por lo que se insiste en el hecho de que este dato es semicuantitativo. Aun así, este sistema ha venido a solventar una serie de problemas técnicos y en especial la reducción importante en el tiempo de incubación de la prueba. En la mayoría de los casos, la sensibilidad se reporta en tiempos tan bajos como 4 a 5 horas, tiempo que antes tomaba de 18 a 24 horas(3, 13).

Este sistema no puede emplearse para las pruebas de sensibilidad de las cepas fastidiosas; sin embargo, es esperable que en pocos años se pueda desarrollar un medio de cultivo que soporte el crecimiento de este tipo de cepas.

El sistema Vitek está hecho para las pruebas de sensibilidad de los organismos de crecimiento rápido y es aquí donde se ha sentido su impacto.

La casa comercial, ya tiene a disposición tarjetas para la prueba de sensibilidad de organismos anaeróbicos, pero no tenemos experiencia en este campo(13).
 

G-Pruebas especiales

Son técnicas que se utilizan con fines especiales y que se emplean en estudios de resistencia bacteriana en condiciones muy claramente definidas(9).

Los métodos a discutir son los siguientes: detección de la resistencia contra aminoglucósidos en los Enterococcus, detección de la resistencia de Enterococcus contra la vancomicina, detección de la resistencia a la oxacilina en Staphylococcus, detección de la B-lactamasa y determinación de la actividad bactericida(9).

Para el tratamiento de infecciones serias por Enterococcus, comúnmente se utiliza una combinación sinérgica entre la vancominina y un aminoglucósido que puede ser gentamicina o streptomicina.

En estos casos, se puede hacer una prueba para detectar la resistencia del Enterococcus a estos aminoglucósidos. Para ello hay tres métodos: el de difusión, el de dilución y la microtitulación(9). El más sencillo el de dilución donde se emplean placas de Petri con Müeller-Hinton suplementado con gentamicina (500 ug) o streptomicina (200 ug). Si hay crecimiento en estas placas, hay resistencia a esos antibióticos(9).

El sistema Vitek trae una tarjeta (TA) que tiene estos antibióticos, por lo que puede ser utilizada en casos de sinergismo entre la gentamicina y la streptomicina para el tratamiento de infecciones invasoras por Enterococcus(13).

En cuanto a la resistencia de los Enterococcus contra la vancomicina, hemos empleado un agar sangre con base de Müeller-Hinton y 6 ug/ml de medio de vancomicina. Este método lo hemos usado para la detección de este tipo de agentes a partir de las heces de niños costarricenses y manos del personal de salud, con resultados excelentes (en prensa).

La NCCLS, recomienda, para la detección de la resistencia de los Staphylococcus a la oxacilina, el uso de un Müelle-Hinton suplementado con cloruro de sodio al 4% y 6 ug de oxacilina por ml de medio cultivo(7, 9).

En el campo de la resistencia bacteriana mediada por enzimas, podemos mencionar varios tipos como por ejemplo las B-lactamasas, las B-lactamasas de efecto expandido o inducibles y algunas otras como son la cloranfenicol acetil tranferasa (CAT) o aminoglucósido acetil tranferasa (AAT)(6,9).

El método más sencillo para la detección de la B-lactamasa es el uso de la cefalosporina cromogénica o Cefinasa de la casa BBL, en la cual tenemos un disco impregnado con la cefalosporina y sólo se coloca una asada del organismo a testar y pocos minutos después se observa el cambio de color. Si la cepa produce una B-lactamasa, hay un cambio de color del disco y éste pasa de amarillo a rojo(9).

En los últimos años, se han detectado muchos tipos de B-lactamasas inducidas, con gran importancia clínica, ya que no son detectadas en el laboratorio por los métodos rutinarios. Puede haber un reporte de sensibilidad, pero no funciona el antibiótico en el paciente, ya que al poner la cepa en contacto con el antibiótico in vivo, se presenta la inducción y no hay actividad del antibiótico.

Para poner en evidencia este tipo de cepas hemos usado una técnica muy sencilla. En un plato de agar Müeller-Hinton, se raya un inóculo bacteriano estandarizado y se colocan tres discos: aztreonam, cefotaxime o ceftazidime y amoxicilina/ac. clavulánico, separados equidistantemente por 30 mm. Una vez incubada la placa por 24 horas, si la cepa produce enzimas inducidas, veremos un gran halo de inhibición.(9)

Para la detección de la resistencia al cloranfenicol mediada por una CAT, producida por Haemophilus influenzae, se ha desarrollado una técnica muy ingeniosa, donde se usan discos sin antibiótico impregnados con la cepa a probar, discos de cloranfenicol y un agar Müeller-Hinton(6).

La idea es rayar una cepa de Escherichia coli con sensibilidad comprobada al cloranfenicol sobre el agar y luego colocar discos de cloranfenicol y sobre ellos discos sin antibióticos impregnados con la cepa a probar.

Si la cepa produce CAT, inactivará al coranfenicol y la Escherichia coli no presentará un halo de inhibición; por el contrario, si la cepa no produce esta enzima, no habrá inhibición y por ende, la Escherichia coli presentará un halo de inhibición, poniendo en evidencia la producción de la CAT.
 

Control de Calidad

Una revisión sobre el tema de las pruebas de sensibilidad antimicrobiana no puede estar concluido sin mencionar lo concerniente al control de la calidad(1, 3, 4, 7, 9, 16). Este es un tema de gran importancia.

Dicho control se realiza utilizando cepas control de la American Type Cultive Colection (ATCC) o de alguna otra institución internacional que se dedique a la producción y mantenimiento de cepas bacterianas.

Las cepas de la ATCC, presentan patrones de sensibilidad conocidos, por lo que al montar una prueba de sensibilidad, ésta debe encontrarse dentro de los límites máximos o mínimos impuestos por las regulaciones internacionales.

El control de calidad debe ser efectuado al menos una vez por semana, cada vez que se cambia el lote del medio del cultivo o se prepara medio fresco y cada vez que se cambia un antibiótico o se inicie el uso de uno nuevo.

Quedan sin tratar algunas otras técnicas, como son los métodos genéticos para la detección de resistencia y las diferentes técnicas empleadas en el estudio de resistencia a los antivirales, los antimicóticos, antiparasitarios y la resistencia en organismos anaeróbicos(2, 5, 10, 11,14, 15), así como la detección de agentes antimicrobianos en fluidos biológicos(12).

En todos estos campos se ha avanzado mucho en los últimos años, por lo que estos temas serán objeto de una publicación posterior.
 

Bibliografía

1.    Doern G.: Susceptibility tests of fastidious bacteria. In: Manual of Clinical Microbiology. Sixth edition. Eds: Murray P., Baron E., Pfaller M. et al.: American Society of Microbiology. Washington D. C., 1995.         [ Links ]

2.    Espinel I. & Pfaller M.:Antifungal Agents and Susceptibility Testing. In. : Manual of Clinical Microbiology. Sixth edition. Eds: Murray P. Baron E., Pfaller M. et al.: American Society of Microbiology. Washington D. C., 1995.         [ Links ]

3.    Ferraro M. & Jorgensen J.: Instrument-Based Antibacterial Susceptibility Testing. In: Manual of Clinical Microbiology. Sixth edition. Eds: Murray P., Baron E., Pfaller M. et al.: American Society of Microbiology. Washington D.C., 1995.         [ Links ]

4.    Jorgensen J. & Sahm D. Antimicrobial Susceptibility Testing: General Considerations. In: Manual of Clinical Microbiology. Sixth edition. Eds: Murray P., Baron E., Pfaller M et al.: American Society of Microbiology. Washington D.C., 1995.         [ Links ]

5.    Inderlied C. & Salfinger M.: Antimicrobial Agents and Susceptibility Tests: Mycobacteria. In: Manual of Clinical Microbiology. Sixth edition. Eds: Murray P., Baron E., Pfaller M. et al.: American Society of Microbiology. Washington D.C., 1995.         [ Links ]

6.    Jankins M.: Chloranfenicol acetyltransferase test. In: H. D. Isenberg (ed.), Clinical Microbiology Procedures Handbook, vol. 1. American Society of Microbiology, Washington D.C., 1992.         [ Links ]

7.    NCCLS: Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Eighth Informational Supplement, NCCLS document M100-s8 (ISBN 1-56238-337-X) NCCLS, 940 West Valley Raod, Wayne PA; USA, 1998.         [ Links ]

8.    PDM Epsilometer; AB BioDisk NA Piscataway N.J. USA.         [ Links ]
 
9.    Swenson J., Hindler J. & Peterson L.: Special Test for Detecting Antibacterial Resistence. In: Manual of Clinical Micribiology Sixth edition. Eds: Murray P., Baron E., Pfaller M. et al.: American Society of Microbiology, Washington D.C., 1995.         [ Links ]
 
10.    Swierkosz E. & Biron K.: Antiviral Agents and Susceptiblity Testing. In: Manual of Clinical Microbiology. Sixth edition. Eds: Murray P. Baron E., Pfaller M. et al.: American Society of Microbiology, Washington D.C., 1995.         [ Links ]

11.    Stanley S. jr.: Acquired Drug Resistance and Susceptibility Testing in Parasitic Diseases. In Manual of Clinical Microbiology. Sixth edition. Eds: Murray P., Baron E., Pfaller M. et al.: American Society of Microbiology, Washington D.C., 1995.         [ Links ]

12.    Ostergaard B., Lakatua D & Rotschafer J.: Assays for Antimicrobial Agents in Body Fluids. In Manual of Clinical Microbiology. Sixth edition. Eds: Murray P., Baron E., Pfaller M. et al.: American Society of Microbiology, Washinton D.C., 1995.         [ Links ]

13.    Technical Bulletin Manual Clinical. 510721-1 (rev (0796)) Bio Merieux Vitek Inc. Hazelwood, Missouri, USA, 1997.         [ Links ]

14.    Tenover F., Popovic T. & Olsvik O.: Genetic Methods for Detecting Antibacterial Resistence Genes. In Manual of Clinical Microbiology. Sixth edition. Eds: Murray P., Baron E., Pfaller M. et al.: American Society of Microbiology, Washington D.C., 1995         [ Links ]

15.    Wexler H. & Doern G.: Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria. In Manual of Clinical Microbiology. Sixth edition. Eds: Murray P., Baron E., Pfaller M. et al.: American Society of Microbiology, Washington D.C., 1995.         [ Links ]

16.    Woods G. & Washington J.: Antibacterial Susceptibility Tests: Dilution and Disk Diffusion Methods. In Manual of Clinical Microbiology. Sixth edition. Eds: Murray P., Baron E., Pfaller M. et al.: American Society of Microbiology, Washington D.C., 1995.         [ Links ]
 
 
*  División de Microbiología, Laboratorio Clínico.
Hospital Nacional de Niños. Dr. Carlos Sáenz Herrera, CCSS. San José, Costa Rica