Resumen
 
El cultivo de bacterias anaerobias en nuestras clínicas es una tarea fuera del alcance de la mayoría de los laboratorios clínicos de países en desarrollo, debido al alto costo de los implementos básicos utilizados, como lo es la jarra de anaerobios que cuesta alrededor de unos $500.

Con la meta de proveer una alternativa de bajo costo para este problema se construyó y evaluó una jarra para anaerobiosis de bajo costo, empleando secciones de tubo plástico polivinil carbamato (PVC) y con una tapa transparente de plástico acrífico.  La jarra construida fue evaluada en paralelo con una jarra comercial (BBL), usando sobres de GasPak en ambas para generar la atmósfera anaerobia.

Para evaluar la eficiencia se hicieron diluciones decimales de la cepa Clostridium botulinum (ATCC 1949), Clostridium sporogenes (ATCC 7955) y de las colecciones de cepas de Clostridium haemolyticum, Clostridium histolyticum y Clostridium novyi de la Bacterioteca de la Universidad de Costa Rica (UCR), se inocularon en placas de agar sangre.  Además, se inocularon placas de agar sangre con Clostridium tetani en ambos tipos de jarras para observar el tipo de "iswarming".

En ambas jarras se recuperó un número similar de Unidades Formadoras de Colonias por mililitro (UFC/ml) de cada cepa.  También el tipo de "swarming" de C. Tetani fue idéntico.  La jarra prototipo tiene un costo de aproximadamente el 5% de la jarra comercial en este estudio.

Palabras claves

Anaerobiosis, jarra para anaerobiosis, clostridios.
   
Abstract

Culturing anaerobic bacteria fron clinical samples 15 beyond the reach of most laboratorios from developing countries, due to high cost of basic equipment, such as the anaerobic jar, wich cost upwards of US $ 500 per unit.  In an effort to provide a lower cost alternativa to this problem, we built and evaluate an inexpensive anaerobic jar made out of sections of ("polyvinil carbonate") PVC pipes with a transparent plastic acrylic top.  This custom made jar tested in parallel with a commercial anaerobic jar (BBL), using GasPak envelopes to generale an anaerobic atmosphere in both jars.  To evaluate performance. serial tendilutions of cultures of Clostridium botulinum ATCC 1949), Clostridium sporogenes (ATCC 7955) and bacteria collection stock of University of Costa Rica (UCR), Clostridium haemolyticum, Clostridium histolyticum and Clostridium novy, and were plated onto blood agar plates and incubated using both the commercial and the custom built jar to obtain the number of colony forming units per milliliter (CFU/ml) of undiluted culture.  Blood agar plates wvere also inoculated with C. tetani and incubated in both types of jars to observe swarming.  Counts of CFU/ml from all strains and the strains and the swarming of C. tetani were similar in both jars.  This is noteworthy since the cost of the customized jar is only 5% that of the commercial jar.    

Key Words

Anaerobiosis. anaerobic. clostridia.    
 

Introducción

La flora indígena, especialmente en tracto intestinal, incluye una alta proporción de bacterias anaerobias estrictas, que alcanza una proporción de 10⁸ a 10⁹ células por gramo de heces (1).  Tal población anaerobia es responsable en gran parte de las infecciones polimicrobianas secundarias a rupturas de intestino las cuales se asocian principalmente con Bacteroides y a estreptococos anaerobios (Pectostreptococcus, Pectococcus) y enterobacterias (2).  Además, los casos de enterocolitis pseudomembranosa asociada con Clostridium difficile se tornan problemas cada vez más frecuentes en pacientes hospitalizados con tratamientos antimicrobianos durante periodos largos (3).  Esto lleva a que en términos generales, al menos en laboratorios especializados en bacterias anaerobias, estos agentes se aislan de las muestras remitidas para tal fin en un 50% (4).

En nuestro medio la investigación de agentes anaerobios en pacientes hospitalizados no se hace en forma rutinaria, ya que es muy bajo el número de laboratorios clínicos que se abocan a la búsqueda de bacterias anaerobias.  Posiblemente el propio carácter anaerobio de estas bacterias, que obliga al cultivo bajo condiciones libres de oxígeno, es el mayor obstáculo enfrentado, ya que presupone una metodología que no está establecida en todos los laboratorios clínicos del país y que de paso es onerosa.

El cultivo bajo condiciones anaerobias puede realizarse en cámaras anaerobias o en jarras especiales.  En estas últimas la atmósfera anaerobia puede lograrse ya sea extrayendo el aire de la jarra y reemplazándolo por una mezcla gaseosa libre de oxígeno, o bien, mediante sobres generadores de anaerobiosis.  Comercialmente se expenden varios tipos de estos sobres, unos consumen directamente el oxígeno oxidando compuestos ferrosos, como en el sistema comercial Anaerocult, o con ácido ascórbico como en el sistema comercial Anaerogen o bien el sistema comercial GasPak System (BBL, Microbiology System.  Cockeysville Md, USA) que genera CO₂ y H₂, este último se combina con el oxígeno en presencia de un catalizador de paladio produciendo agua y por lo tanto dejando una atmósfera anaerobia (5). Un indicador de oxidorreducción, ya sea con azul de metileno o resazurina cuya reducción a la forma incolora indica la generación de un ambiente anaerobio (6).  Estos sobres generadores de anaerobiosis son los más prácticos y empleados.  Sin embargo, el costo de una jarra oscila entre cuatrocientos cincuenta y quinientos dólares, lo que obviamente es una limitante para laboratorios de países en desarrollo y posiblemente sea uno de los factores responsables de la poca investigación en bacterias anaerobias en nuestro país.  Por tal motivo se diseña una jarra económica para generar una atmósfera anaerobia aplicable a los laboratorios clínicos.
 

Materiales y métodos

Las dimensiones de la jarra diseñada brindan el volumen indicado de 2,85 litros, como se detalla en la figura 1.  En el interior de la jarra se colocó una canasta circular construida con cedazo de acero inoxidable para contener el catalizador de paladio, en caso de utilizar un sobre tipo GasPak para generar la atmósfera anaerobia.

Se probó la efectividad de la jarra generando en su interior la atmósfera anaerobia con un sobre generador GasPak y el indicador de resazurina respectivo y se dejó a temperatura ambiente durante una semana observando el indicador diariamente.  Luego se repitió la misma experiencia a 37° C. Posteriormente se cultivaron cepas de Clostridium botulinum (ATCC 1949), Clostridium sporogenes (ATCC 7955) y cepas de la bacterioteca de la Universidad de Costa Rica (UCR): C Haemolyticum, C Histolyticum y C Novyi. (9).  Cada bacteria se cultivó por 48 horas en tubos con el medio de carne prerreducidos y esterilizados (conocidos como "PRAS" por sus siglas en inglés) y de cada caldo se hicieron diluciones decimales de 10 -1 a 10 -6 y de cada dilución se inocularon dos placas de agar sangre, un juego de placas se incubó en una jarra GasPak (BBL) y el otro en el prototipo descrito.  En ambas jarras se incluyó un sobre generador de anaerobiosis (GasPak), una tira indicadora de oxidoreducción y el catalizador de paladio recién activado y ambas jarras se incubaron a 35° C por 24 horas.  Estos experimentos se hicieron tres veces en diferentes días.  También se comparó el tipo de "swarming" de 7 cepas de C Tetani, seis aisladas de suelos de la Universidad de Costa Rica (UCR) y una cepa ATCC y 11 cepas de C sporogenes aisladas de suelos de la UCR (7).
 
 
Resultados

Los experimentos para evaluar el tiempo que podía mantenerse la atmósfera anaerobia en la jarra prototipo, mostraron que a los 7 días, tanto a temperatura ambiente como a 37° C el indicador se mantuvo reducido.

El cuadro 1 resume los datos del número de unidades formadoras de colonias recuperadas a partir de las diluciones de cada cepa.  Se observa que en ambas jarras el recuento de UFC/ml obtenido es similar, con variaciones debidas posiblemente a variaciones intrínsecas del método.

En cuanto a la observación del fenómeno de "swarming" en C tetani y C sporogenes no hubo diferencias morfológicas en cuanto a la película de crecimiento de ambos agentes ni en cuanto al tamaño de las colonias.
 
 
Discusión

La jarra prototipo está construida en un material opaco y por lo tanto solo a través de la tapa se puede observar la tira indicadora de óxido reducción, lo que en cierta forma es una desventaja con respecto a las jarras comerciales que son totalmente transparentes.  No obstante, la mayor ventaja es el costo, pues los materiales de la jarra prototipo tienen un valor aproximado de diez dólares, lo que es significativamente bajo sí se compara con las jarras comerciales cuyo precio oscila entre los 450 y los 500 dólares.
 
 
Referencias

1. Beerens H, Romond C. Sulfate reducing anaerobic bacteria in human feces.  Amer J Clínic Nutr 1977; 30:1770-1776.         [ Links ]

2. Formal S.B., -Hale T.H., Sansonettí P. lnvasive enteric pathogens.  Rev Infect Dis 1983: 5: 702-707.         [ Links ]

3. Brazier J.S. Role of laboratory in investigations of Clostridium dificile diarrhea.  Clin Infect Dis 1993; 16 (Supl. 4): 5228-5233.         [ Links ]

4. Brook I. Recovery of anaerobic bacteria from clinical specimens in 12 years at two military hospitais.  J Clín Microbiol 1988; 26:1181-1188.

5. Brewer J.H., Aligeier D.L. Safe seif-contained carbon dioxide hydrogen anaerobic system. Appl Microbiol 1966; 14:985988.         [ Links ]

6. Brewer J.H., Aligeier D.L., McLaughlin. lmproved anaerobic indicator.  Appl Microbiol 1966; 14: 135-136.         [ Links ]

7. Hernández F, Rodríguez E, Vargas P, Umaña M. Frecuencia de Clostridium tetaní en suelos de la ciudad universitaria Rodrigo Facio.  Rev Cost Cienc Med 1995; 16: 27-31.         [ Links ]

8. Hernández, F. y Rodríguez, E. The swarming phenomenon in Ciostridíurn tetaní.  Rev.  BioL Trop. 1994; 41: 857-859.         [ Links ]

9. Hernández F, Rodríguez E, Umafla M & Vargas P. The swarming phenomenon of Clostridium and its isolation. Rev Biol Trop 1997; 45:124 1245.         [ Links ]
 
 
1.  Facultad de Microbiología, Universidad de Costa Rica.
2.  Facultad de Microbiología, Unidad de Microscopía Electrónica, Universidad de Costa Rica.
*   Correspondencia.