Introducción

Theobroma cacao L. es una planta ampliamente cultivada y distribuida en las zonas tropicales del mundo. Tradicionalmente estuvo circunscrita dentro de la familia Sterculiaceae. Sin embargo, estudios morfológicos, moleculares y biogeográficos la incluyeron dentro de la familia Malvaceae, junto con las familias Bombacaeae y Tiliaceae (^{Bayer et al., 1999}; ^{Bayer & Kubitzki, 2003}, ^{Richardson, Whitlock, Meerow, & Madriñán, 2015}; ^{Bhattacharjee, 2018}). ^{Bayer et al., (1999}) y ^{Bayer y Kubitzki (2003}) indicaron que la familia Malvaceae está constituida por 9 subfamilias, Byttnerioideae, Grewioideae, Helicteroideae, Sterculideae, Brownlowioideae, Dombeyoideae, Malvoideae, Bombacoideae y Tilioideae. Bajo este nuevo enfoque de clasificación, T. cacao se circunscribe a la subfamilia Byttnerioidea.

T. cacao es originaria de la cuenca del Amazonas, en áreas relacionadas a los ríos Napo, Putumayo y Caquetá donde existe mayor variación de la especie (^{Zhang & Motilal, 2016}). De Suramérica pasó a Centroamérica, dispersándose quizás, a través de las rutas comerciales de los indígenas y luego de Mesoamérica fue llevado a Asia y Oceanía, llegando a África a través de los portugueses (^{Zhang & Motilal, 2016}). En la actualidad T. cacao es un cultivo tropical muy valioso dado que sus semillas son la materia prima para la industria de chocolates, para la producción de manteca y de cacao en polvo; estas industrias multimillonarias consumen la producción mundial anual de cacao estimada en 4 de millones toneladas (^{Squicciarini & Swinnen, 2016}; ^{Wickramasuriya & Dunwell, 2018}). Entre los años 2015/2016 África contribuyó con el 74 % de la producción mundial (2.92 millones de toneladas) seguido por América con 16 % (0.64 millones de toneladas) y finalmente Asia y Oceanía con 10 % (0.4 millones de toneladas) (^{Pipitone, 2016}; ^{Beg, Ahmad, Jan, & Bashir, 2017}; ^{Wickramasuriya & Dunwell, 2018}).

T. cacao es un árbol de hojas simples perennes que puede alcanzar alturas entre 5-10 m; crece bien entre los 400 hasta 1 250 m de altitud, con temperaturas entre 20 y 30 ºC con una mínima de 16 ºC y precipitaciones entre 1 300 y 2 800 mm por año (^{Bartley, 2005}; ^{de Almeida & Valle, 2010}; ^{Nair, 2010}). Las flores son caulinares y se desarrollan en partes del tallo denominadas cojinetes florales; éstas son perfectas, completas, heteroclamidias, con androceo en dos verticilos uno externo de cinco estambres funcionales y otro interno de cinco estambres estériles o estaminodios, por lo general de color púrpura (^{Bayer & Kubitzki, 2003}; ^{Bartley, 2005}; ^{Swanson, Carlson, & Guiltinan, 2008}; ^{Ha et al., 2016}; ^{de Souza, Moreira, Sarmento, & da Costa, 2018}). El gineceo está formado por un ovario súpero de cinco carpelos e igual número de lóculos, la placentación es axilar y el número de óvulos es variable (^{Bartley, 2005}; ^{Santos, Pires, & Correa, 2012}). En relación al fruto existe bastante controversia al momento de delimitar su categorización exacta, algunos autores lo han conceptualizado como una baya o drupa (^{Roth & Lindorf, 1971}). No obstante, el fruto estructural y funcionalmente parece estar más relacionado con una cápsula indehiscente (^{Simpson, 2010}). T. cacao ha sido dividido en tres grandes grupos: el Criollo, el Forastero y el Trinitario, siendo este último un hibrido entre los dos primeros; esta división tiene en cuenta la morfología, características genéticas y orígenes geográficos (^{Bartley, 2005}). Sin embargo, se han reconocido 10 agrupaciones genéticas, siendo morfológicamente variables (^{Motamayor et al., 2008}). No obstante, recientes estudios han mostrado que Perú, Bolivia y Colombia pueden albergar poblaciones adicionales (^{Motamayor et al., 2010}; ^{Zhang et al., 2012}; ^{Osorio et al., 2017}).

A pesar de que T. cacao es una especie económicamente importante para muchos países en el mundo, son escasos los trabajos relacionados con la comprensión de su biología reproductiva; algunos de estos tienen en cuenta el desarrollo y morfología floral, viabilidad del polen, polinizadores y mecanismos de autocompatibilidad y autoincompatibilidad (^{Bayer & Kubitzki, 2003}; ^{Swanson et al., 2008}; ^{Ford & Wilkinson, 2012}; ^{Rangel et al., 2012}; ^{Frimpong-Anin, Adjaloo, Kwapong, & Oduro, 2014}; ^{Ha et al., 2016}; ^{Bridgemohan et al., 2017}; ^{Lanaud et al., 2017}; ^{N’Zi, Kahia, Diby, & Kouamé, 2017}; ^{de Jesus Branco, da Silva, Lopes, & Corrêa, 2018}; ^{López et al., 2018}; ^{Narayanapur, Suma, & Minimol, 2018}). En relación a los mecanismos ontogenéticos de la formación de los granos de polen, hasta el momento solo se documentan brevemente algunos aspectos de este proceso, por lo cual los eventos de la microesporogénesis en esta especie permanecen aún sin resolver (^{Sivachandran, Gnanam, Sudhakar, Suresh, & Ram, 2017}). En congruencia con lo anterior, la estructura y micromorfología de los granos de polen maduros de T. cacao han sido descritos pobremente y poco se conoce sobre sus implicaciones en la biología reproductiva y su impacto en los mecanismos de autoincompatibilidad (^{Halbritter & Buchner, 2016}; ^{García, Bazurto, García, & Zambrano, 2019}). Atendiendo a estas razones, con este trabajo de investigación se realizará una descripción pormenorizada de la micromorfología y estructura de los granos de polen de 10 variedades élite de T. cacao presentes en el banco de germoplasma ex situ del centro de investigación la Suiza (Agrosavia, Santander, Colombia), haciendo énfasis en la microestructura de la pared de los granos de polen, presencia de orbículas, polenkit, presencia de gránulos de almidón en el citoplasma, anatomía y topografía de los polifenoles en las anteras y la relación entre el tapete y la formación de esporopolenina presente en la pared de los granos de polen.

Materiales y métodos

Se tomaron más de 30 anteras de flores en antesis de cada uno de los genotipos élite de T. cacao, los cuales se describen en la Tabla 1 (^{Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria, 2014}a; ^{Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria, 2014}b; ^{Agudelo, Palencia, Antolinez, & Báez, 2017}). Las muestras fueron obtenidas del banco de germoplasma ex situ del Centro de Investigaciones La Suiza de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (Agrosavia) ubicado en el Municipio de Rionegro, Santander-Colombia a 540 m de altitud (7°22’12” N & 73°11’39” W) durante los meses de junio-julio del 2019. Los genotipos fueron seleccionados de acuerdo la a disponibilidad de materiales en el banco de germoplasma y teniendo en cuenta los modelos de compatibilidad polínica. Las anteras con los granos de polen se fijaron en una mezcla de formol, etanol y ácido acético (FAA) por 24-48 horas a 6 °C. Posteriormente, se deshidrataron en una serie gradual de etanol y dos pasos de aclaramiento en Xilol (^{Ruzin, 1999}) y se incluyeron en Paraplast plus (Mc Cormick^®) durante 12 horas a 55 °C. Se obtuvieron secciones transversales y longitudinales con micrótomo rotatorio LEICA RM^® 2125, entre 3-4 μm de grosor. Se procedió a la tinción de las muestras con Safranina-azul de Alcian para distinguir estructuras con paredes primarias y secundarias y de manera no específica presencia de polifenoles totales. Adicionalmente, las muestras también fueron teñidas con la técnica de PAS, ácido peryódico de Schiff-Amidoblack para discriminar entre polisacáridos estructurales y de reserva, además de la presencia de proteínas. Para la determinación de esporopolenina y polifenoles se usó la tinción de azul de Toluidina y finalmente se aplicó la tinción de azul de Alcian-PAS-Hematoxilina que determina la presencia de paredes primarias, polisacáridos y además de manera no específica polifenoles totales. Para todas las tinciones se procedió de acuerdo a literatura especializada (^{Ruzin, 1999}; ^{Elwers, Zambrano, Rohsius, & Lieberei, 2010}; ^{Yeung, Stasolla, Sumner, & Huang, 2015}; ^{Demarco, 2017}; ^{Rincón, Grisales, Cuaran, & Cardona, 2020}). Las secciones en parafina se examinaron con un microscopio fotónico Nikon 80i eclipse® y Nikon eclipse Ni con el sistema de contraste diferencial de interferencia (CDI). Además, las secciones también fueron analizadas con fluorescencia, empleando el filtro de triple banda de excitación DAPI-FITC-Texas, el cual incorpora un filtro de excitación con ventanas de paso de banda angostas en las regiones espectrales violeta (395-410 nm), azul (490-505 nm) y verde (560-580 nm). Las fotografías se obtuvieron con cámara digital Nikon DS-Fi1^® utilizando el programa NIS Elements versión 4.30.02 de Nikon.

Para llevar a cabo las descripciones morfológicas con microscopía electrónica de barrido (MEB), las anteras con los granos de polen fueron tomadas de la colección de germoplasma para fijarlas y deshidratarlas en 2.2 Dimetoxipropano acidificado por 2 a 3 días, realizando un cambio de este solvente durante este tiempo (^{Halbritter, 1998}; Halbritter et al., 2018). Finalmente, se hicieron dos cambios en etanol absoluto durante 30 minutos cada uno, y procedió a desecar al punto crítico con un desecador SAMDRI®-795. Las muestras se montaron sobre cinta conductiva de carbono de doble cara y se recubrieron con oro en una ionizadora DENTON VACUUM DESK IV durante 10 minutos. Las observaciones y registro fotográfico se realizaron en un microscopio electrónico de barrido JEOL JSM-6490LV. Para las descripciones de los granos de polen y las anteras se utilizaron los términos sensu Halbritter et al., (2018), ^{Punt, Hoen, Blackmore, Nilsson y Le Thomas (2007}) y ^{Crang, Lyons-Sobaski y Wise (2018}). Las mediciones del tamaño de los granos de polen están representadas por la medida mínima, máxima, la media y la desviación estándar, empleando 10 réplicas por cada genotipo. Para evaluar si existen diferencias significativas en los tamaños de los granos de polen de los genotipos estudiados se le aplicaron las pruebas estadísticas ANOVA de un factor, evaluando el cumplimiento de los supuestos de normalidad (Shapiro-Wlik) y homogeneidad de varianzas (Test de Levene); al encontrarse diferencias significativas, se plantearon comparaciones pareadas múltiples a posteriori, empleando el test de LSD (Least significant difference) de Fisher con un nivel de significancia del 5 % utilizando software estadístico R versión 4.0.2.

Las descripciones con MEB se detallan para cada uno de los 10 genotipos estudiados. En contraste, en el curso del estudio realizado se comprobó que los genotipos utilizados presentan similar respuesta a las determinaciones histoquímicas efectuadas, por ello, para la descripción pormenorizada de estos procesos se eligieron los genotipos que suministraron las mejores imágenes o ilustraciones.

Resultados

Las anteras: Las anteras de los diez genotipos estudiados son similares estructural y anatómicamente; estas son bitecas y se abren longitudinalmente a través del estomio (Fig. 1A, Fig. 1B). Están sostenidas por un filamento largo, formado por una capa uniestratificada de células epidérmicas y varios estratos de tejido parenquimatoso que protege el haz vascular (Fig. 1C). Tanto en la epidermis como en el parénquima de esta estructura, se aprecian vacuolas con grandes depósitos de polifenoles (Fig. 1C). La pared de las anteras maduras presenta externamente una capa uniestratificada de células epidérmicas, que por lo general son de contorno rectangular, aunque algunas se aprecian de contorno cuadrado y con la maduración tienden a aplanarse; estas células pueden presentar depósitos abundantes de polifenoles en las vacuolas que llegan a obliterar por completo el citoplasma (Fig. 1D).

Fig. 1 Características anatómicas e histoquímicas de las anteras y granos de polen de Theobroma cacao. A. Sección transversal de las anteras (Safranina-azul de Alcian). Se aprecia la pared de las anteras, los lóculos de los microesporangios y el estomio. B. Anteras vistas en microscopía electrónica de barrido (MEB). Se aprecian los granos de polen y el filamento. C. sección longitudinal del filamento que sostiene las anteras (azul de Toluidina). D. Pared de las anteras maduras. Se aprecia la epidermis, endotecio, restos del tapete con orbículas y los granos de polen (azul de Toluidina). E. Granos de polen y orbículas en las anteras (MEB). F. Sección trasversal de las anteras. Se aprecian los polifenoles y las orbículas cubriendo la cavidad de los lóculos (Filtro DAPI-FITC-Texas, azul de Alcian-Hematoxilina). G. Sección trasversal de las anteras. Se aprecian las orbículas cubriendo la cavidad de los lóculos (Filtro DAPI-FITC-Texas, PAS-Amidoblack). H. Sección transversal de los granos de polen. Los gránulos de almidón se aprecian en color fucsia (PAS-Amidoblack). AN: antera; CO: colpo; DR: drusas; EF; engrosamientos fibrilares; EN: endotecio; EP: epidermis; ES: estomio; FI: filamento; GA: gránulos de almidón; HV: haz vascular; LM: lóculo del microesporangio; OR: orbículas; PA: pared de la antera; PL: polifenoles; PO: polen; PP: pared del grano de polen; PT: paredes remanentes del tapete; TC: Tejido conectivo. / Fig. 1. Anatomical and histochemical characteristics of the anthers and pollen grains of Theobroma cacao. A. Cross section of the anthers (Safranina-Alcian blue). The wall of the anthers, the locules of the microsporangia and the stomium can be seen. B. Anthers seen in scanning electron microscopy (SEM). Pollen grains and filament are appreciated. C. Longitudinal section of the filament supporting the anthers (Toluidine blue). D. Wall of mature anthers. Epidermis, endothecium, remains of the tapetum with orbicules and pollen grains (Toluidine blue) can be seen. E. Pollen grains and orbicules on anthers (SEM). F. Cross section of the anthers. Polyphenols and orbicules covering the cavity of the locules are seen (DAPI-FITC-Texas Filter, Alcian Blue-Hematoxylin). G. Cross section of the anthers. Orbicules can be seen covering the cavity of the locules (DAPI-FITC-Texas Filter, PAS-Amidoblack). H. Cross section of pollen grains. Starch granules are seen in fuchsia color (PAS-Amidoblack). AN: anther; CO: colpus; DR: druses; EF; fibrillar thickenings; EN: endothecium; EP: epidermis; ES: stomium; FI: filament; GA: starch granules; HV: vascular bundle; LM: microsporangium locule; OR: orbicules; PA: anther wall; PL: polyphenols; PO: pollen; PP: pollen grain walls; PT: tapetum walls remaining; TC: connective tissue. 

Debajo de la epidermis, se localiza el endotecio que corresponde a una capa uniestratificada de células cuadradas altas con engrosamientos fibrilares lignificados (Fig. 1D), estas células rara vez presentan depósitos de polifenoles. Internamente al endotecio, las anteras maduras tienen una capa uniestratificada de células que se aprecian colapsadas y en degradación, estos remanentes celulares corresponden al tapete (Fig. 1D). Sobre las paredes de estos remanentes celulares se observa el depósito masivo de orbículas que recubren toda la pared de los lóculos de los microesporangios (Fig. 2D, Fig. 2E). Las orbículas o cuerpos de Ubish en los genotipos analizados de T. cacao se presentan en la pared de las anteras o sobre los granos de polen, tienen diferentes formas y tamaños, aunque se aprecian principalmente esféricas y por lo general son psiladas, estas estructuras miden entre 0.42-1.14 µm (Fig. 1E). Las orbículas presentan los mismos patrones de fluorescencia que la exina de los granos de polen cuando son observados utilizando una tinción específica y un filtro fluorescente determinado; tal es el caso cuando se utiliza el filtro de triple banda de excitación DAPI-FITC-Texas y la tinción azul de Alcian-Hematoxilina, en estas condiciones, las orbículas y el esporodermo se distinguen de color verde, en tanto que los polifenoles se aprecian de color amarillo (Fig. 1F). En contraste, cuando se emplea este mismo filtro, pero con la tinción de PAS-Amidoblack las orbículas y la pared de los granos de polen se ven de color azul-verdoso y los polifenoles se aprecian de color rojizo (Fig. 1G). Cuando estos mismos componentes se aprecian en campo claro utilizado la tinción de azul de Toluidina la pared de los granos de polen y las orbículas se aprecian de azul turquesa y los polifenoles se ven de color marrón oscuro e incluso negros (Fig. 1D). Adicionalmente, se pudo observar que el conectivo que une las dos tecas está formado principalmente por células parenquimatosas con grandes depósitos de polifenoles y drusas de oxalato de calcio (Fig. 1D).

En todos los genotipos de T. cacao analizados se observó la presencia de abundantes gránulos de almidón en el citoplasma de los granos de polen, en tanto que, en los tejidos de las anteras, no se pudo evidenciar la presencia de este carbohidrato (Fig. 1H). Así mismo, no fue posible detectar proteínas en las células o tejidos que forman las anteras con la técnica de tinción de PAS-Amidoblack.

Fig. 2 Granos de polen y detalles micromorfológicos de los genotipos de Theobroma cacao. Se observan los colpos y las orbículas sobre la superficie del retículo. A, B. Theobroma Corpoica La Suiza TCS 01. A. vista ecuatorial. En B. el detalle indica orbículas con microgranulaciones (flechas) y la cabeza de flecha orbículas fusionadas. C, D. Theobroma Corpoica La Suiza TCS 05. C. vista ecuatorial. E, F., E. vista ecuatorial. Theobroma Corpoica La Suiza TCS 06. G, H. Theobroma Corpoica La Suiza TCS 11. I, J. Theobroma Corpoica La Suiza TCS 13. CO: colpo; OR: orbículas; RE: retículo. / Fig. 2. Pollen grains and micromorphological details of Theobroma cacao genotypes. Colpi and orbicules are observed on the surface of the reticulum. A, B. Theobroma Corpoica La Suiza TCS 01. A. equatorial view. In B. the detail indicates orbicules with microgranulations (arrows) and the arrowhead orbicules fused. C, D. Theobroma Corpoica La Suiza TCS 05. C. equatorial view. E, F. Theobroma Corpoica La Suiza TCS 06. E. equatorial view. G, H. Theobroma Corpoica La Suiza TCS 11. I, J. Theobroma Corpoica La Suiza TCS13. CO: colpus; OR: orbicules; RE: reticulum 

Los granos de polen: En todos los genotipos de T. cacao analizados, los granos de polen son monades, isopolares, pequeños (16-19 µm) con amb circular (ámbito o contorno del grano de polen en vista polar), esferoidales, tricolpados con colpos medianos o breves (5-10 µm) con membrana ornamentada, semitectados, reticulados, heterobrochados, muros ornamentados o sin ornamentación, lumen con microgránulos de diferente tamaño, se observa que el retículo disminuye de tamaño hacia las aberturas (Fig. 2, Fig. 3). Adicionalmente, se observó que el genotipo SCA 6 presenta perforaciones en los muros (Fig. 3J). Los genotipos SCC 19 y SCA 6 muestran abundante polenkit o cemento polínico (Fig. 3C, Fig. 3D, Fig. 3I, Fig. 3J). Las orbículas sobre los granos de polen se aprecian solitarias o a veces pueden quedar fusionadas en 2 o 3 unidades (Fig. 2B, Fig. 3A, Fig. 3F). Aunque la superficie de las orbículas por lo general es psilada, en los genotipos TCS 01 y SCC61 pueden presentarse además microgranuladas (Fig. 2B, Fig. 3F). Los análisis estadísticos mostraron con un nivel de confianza del 95 % que existen diferencias significativas en el tamaño de los granos de polen según los genotipos analizados (P ˂ 0.05). Se observa que los granos de polen con menor tamaño son los del genotipo TCS 19 (16.890 µm) y son diferentes de los demás genotipos. No se observan diferencias significativas en los genotipos SCA 6, TCS 05, TCS 13, TCS 06, CCN 51, TCS 01. Tampoco se observan diferencias entre los genotipos SCC 61, TCS11 y SCC 19 (los de mayor tamaño). De igual forma, los genotipos TCS 11, SCC 19, TSC 01 y CCN 51 no presentan diferencias significativas. Las principales características analizadas en los granos de polen se resumen en la Tabla 2.

Fig. 3 Granos de polen y detalles micromorfológicos de los genotipos de Theobroma cacao. Se observan los colpos y las orbículas sobre la superficie del retículo. A, B. Theobroma Corpoica La Suiza TCS 19. En A. (vista ecuatorial) la cabeza de flecha indica dos orbículas fusionadas. C, D. Selección Colombia Corpoica SCC 19. E, F. Selección Colombia Corpoica SCC 61. E. vista ecuatorial. La cabeza de flecha en F. muestra dos orbículas fusionadas y el detalle indica orbículas con microgranulaciones (flecha). G, H. Colección Castro-Naranjal CCN 51. G. a la izquierda, orbícula sobre el polo; a la derecha se observa en vista ecuatorial el colpo. I, J. Scavina SCA 6. CO: colpo; OR: orbículas; RE: retículo; PER: perforaciones; PK: pollenkit. Fig. 3. Pollen grains and micromorphological details of Theobroma cacao genotypes. Colpi and orbicules are observed on the surface of the reticulum. A, B. Theobroma Corpoica La Suiza TCS 19. In A. (equatorial view) arrowhead indicates two fused orbicules. C, D. Selección Colombia Corpoica SCC 19. E, F. Selección Colombia Corpoica SCC 61. E. equatorial view. The arrowhead in F. shows two fused orbicules and the detail indicates orbicules with microgranulations (arrow). G, H. Colección Castro-Naranjal CCN 51. G. on the left, orbicule on the pole; on the right colpus in the equatorial view I, J. Scavina SCA 6. CO: colpus; OR: orbicules; RE: reticulum; PER: perforations; PK: pollenkitt. 

Discusión

La pared de las anteras maduras de T. cacao presenta una epidermis persistente, un endotecio con engrosamientos fibrilares que se encuentra recubierto por restos de las paredes tapetales, este patrón histológico básico, es común en las anteras maduras y dehiscentes de la mayoría de las angiospermas (^{Passarelli & Cocucci, 2006}; ^{Wilson, Song, Taylor, & Yang, 2011}; ^{Wei, Xu, & Li, 2015}; ^{Shamrov, Anisimova, & Babro, 2020}), incluido Malvaceae (^{Tang, Gao, Wang, & Chen, 2006}; ^{Galati, Monacci, Gotelli, & Rosenfeldt, 2007}; ^{Tang, Gao, & Xie, 2009}; ^{Lattar, Galati, & Ferruci, 2014}). Concordando con las observaciones de ^{Manning (1996}), los engrosamientos fibrilares presentes en el endotecio de los genotipos de T. cacao son el tipo anular y es similar a lo registrado para varias especies dentro de la familia Malvaceae (^{Lattar et al., 2014}); aunque no son exclusivos de este grupo de plantas (^{French, 1985}; ^{Manning & Linder, 1990}; ^{Manning, 1996}; ^{Tebbitt & Maciver, 1999}; ^{Carrizo, 2002}; ^{Nakamura, Longhi-Wagner, & Scatena, 2010}; ^{Gotelli, Galati, & Zarlavsky, 2016}). Estos engrosamientos fibrilares del endotecio de T. cacao son fuertemente lignificados dando respuesta positiva con azul de Toluidina, lo cual es similar a lo observado para otras especies de plantas (^{Dawson, et al., 1999}; ^{Wilson et al., 2011}).

Los procesos de amilogénesis y amilólisis en las anteras de las plantas presentan variaciones que dependen del momento del desarrollo de las mismas, y más aún se pueden presentar variaciones dependiendo el grupo de plantas que se analice (^{Pacini & Franchi, 1988}; ^{Pacini, Guarnieri, & Nepi, 2006}; ^{Santos de Oliveira, Martins, Dorneles, & Carvalho de Freitas, 2015}). Por lo general, en las anteras maduras y dehiscentes, los tejidos parietales como la epidermis y el endotecio, no presentan almidones para este momento del desarrollo (^{Konyar, Dane, & Tütüncü, 2013}; ^{Santos de Oliveira et al., 2015}; ^{Wei et al., 2015}; ^{Yun & Huiqiao, 2015}; ^{Zheng, Su, Xiao, & Tian, 2017}), estas observaciones también se cumplen para los genotipos de T. cacao.

^{Baker y Baker (1979}) han indicado la presencia de granos de polen maduros con y sin gránulos de almidón en el citoplasma en diferentes grupos de plantas. Las especies con granos de polen pequeño, por lo general, presentan abundantes almidones y una viabilidad temporal reducida, al momento de su dispersión. Por el contrario, las especies con polen de mayor tamaño, por lo general, son carentes de almidones, pero abundantes en carbohidratos solubles, e incluso lípidos y se consideran de una viabilidad temporal mayor (^{Santos de Oliveira et al., 2015}). De acuerdo con las observaciones de la gran cantidad de gránulos de almidón en el citoplasma de los genotipos de T. cacao y el tamaño reducido de los granos de polen (˂ 20 µm), se puede concluir que esta especie presenta una viabilidad temporal reducida, y en este sentido la dispersión de los granos de polen, una vez se da su liberación de la antera, cuenta con una corta ventana de tiempo antes de que la viabilidad se vea afectada. Lo anterior es congruente con observaciones sobre la biología de la polinización de T. cacao, ya que el polen es de corta viabilidad, y esta puede ser de unos pocos minutos hasta varios días (^{García et al., 2019}). No obstante, además del genotipo, factores ambientales como la humedad, la temperatura y otros factores abióticos, pueden influenciar esta situación (^{García, Vera, Zambrano, Zamora, & Cedeño, 2020})

Aunque no se sabe con exactitud la función de las orbículas, al parecer están relacionadas con la dispersión del polen (^{Heslop-Harrison, 1968}). Así, ^{Galati, Gotelli, Rosenfeldt, Torretta y Zarlavsky (2011}) han relacionado la presencia de orbículas espiculadas y equinuladas con especies de polinización anemófila y también con la polinización vibratoria (^{Galati, Gotelli, Dolinko, & Rosenfeldt, 2019}). En tanto que, las orbículas psiladas, se pueden relacionar con especies melitófilas y las orbículas psiladas y perforadas por lo general con la polinización ornitófila (^{Galati et al., 2011}). En este sentido y debido a la presencia de orbículas esféricas y psiladas, se confirma que T. cacao es una especie miófila, polinizada por Ceratopogónidos, con síndrome de polinización que incluye flores estructuralmente complejas, con nectarios en los pedicelos, sépalos y ovarios, estaminodios y lígulas coloreadas y además reflectancia/absorbancia en el espectro UV que le sirven como atrayentes a sus polinizadores (^{Young, Schaller, & Strand, 1984}; ^{Young, Erickson, Strand, & Erickson, 1987}; ^{Bayer & Kubitzki, 2003}).

^{Strittmatter y Galati (2001}), ^{Galati et al., 2007} y ^{Galati et al., (2011}) indican que las orbículas de varias especies de plantas se pueden presentar aglomeradas sobre las paredes internas del endotecio o sobre los restos de las paredes del tapete, recubriendo la superficie del lóculo microesporangial; además de presentar las mismas reacciones de tinción y autofluorescencia que el esporodermo de los granos de polen, lo que estaría reflejando su composición de esporopolenina; estas observaciones concuerdan con lo descrito en esta investigación para los 10 genotipos analizados de T. cacao y es congruente con lo indicado recientemente para diferentes grupos de plantas (^{Ruggiero & Bedini, 2020}) y en particular para Malvaceae (^{Lattar et al., 2014}). Las orbículas de T. cacao pueden ser variables en tamaño, por lo general son psiladas y se pueden presentar solitarias y a veces fusionadas, estas características han sido indicadas para varios grupos de plantas (^{Huysmans, El-Ghazaly, Nilsson, & Smets, 1997}; ^{Galati, 2003}) incluidas Malvaceae (^{Galati & Rosenfeldt, 1998}; ^{Lattar et al., 2014}). Aunque ^{Galati y Rosenfeldt, (1998}) y ^{Lattar et al., (2014}) también consideran la presencia de orbículas con microgranulaciones en algunas de las especies de Malvaceae y esto concuerda con nuestras observaciones para los genotipos TCS 01 y SCC61 de T. cacao. Adicionalmente, también se ha indicado la presencia de orbículas de contorno piriforme en Malvaceae (^{Strittmatter, Galati, & Monacci, 2000}; ^{Galati et al., 2007})

Con la información obtenida de esta investigación no fue posible determinar si el tapete T. cacao es secretor, invasivo no sincitial o plasmodial, dado que se tomaron anteras maduras y en dehiscencia, momento del desarrollo para el cual el tapete ha degenerado por completo (^{Pacini, Franchi, & Hesse, 1985}; ^{Parkinson & Pacini, 1995}; ^{Furness & Rudall, 2001}; ^{Galati et al., 2007}; ^{Pacini, 2010}; ^{Wei et al., 2015}). En congruencia con lo anterior, varios autores han indicado la relación exclusiva entre la presencia de orbículas y el tapete secretor (^{Pacini et al., 1985}; ^{Huysmans, El-Ghazaly, & Smets, 1998}; ^{Verstraete, Moon, Smets, & Huysmans, 2014}). Por el contrario, se ha observado la presencia de orbículas en especies con tapete plasmodial (^{Gotelli, Galati, & Medan, 2008}). En el caso de Malvaceae, el tapete secretor es el más común (^{Lattar et al., 2014}), pero se ha registrado en esta familia de plantas la presencia de orbículas en especies que tienen tapete plasmodial e invasivo no sincitial (^{Strittmatter & Galati, 2001}; ^{Galati et al., 2007}; ^{Galati et al., 2011}). Teniendo en cuenta lo anterior, se puede indicar que las orbículas se encuentran ampliamente distribuidas en diferentes grupos de plantas (^{Verstraete et al., 2014}; ^{Moon, 2018}; ^{Ruggiero & Bedini, 2020}) y la relación entre estas estructuras y los tipos de tapete, no ha sido aún claramente dilucidada.

Los polifenoles son metabolitos secundarios presentes en la mayoría de las plantas, están relacionados con respuesta a la herbivoría, también como mecanismos de resistencia a hongos y como subproductos de algunos procesos metabólicos (^{Lattanzio, Lattanzio, & Cardinali, 2006}; ^{Aoun, Rioux, Simard, & Bernier, 2009}; ^{Aoun, 2017}; ^{Rincón et al., 2020}). Estos compuestos, han sido registrados ampliamente en T. cacao (^{Porter, Ma, & Chan, 1991}; ^{Rojas et al., 2008}; ^{Rangel et al., 2012}; ^{Ioannone et al., 2015}; ^{Gallego, Henao, Urrea, & Atehortua, 2016}; ^{Magrone, Russo, & Jirillo, 2017}; ^{Alean et al., 2020}) y su función en T. cacao, probablemente se relacione con lo descrito para otras plantas. En este sentido, ^{Garcia, Potiguara, Kikuchi, Demarco y Aguiar (2014}) relacionan la presencia de compuestos polifenólicos y cristales de oxalato de calcio tipo drusas como respuesta a la herbivoría y mecanismos de resistencia a hongos como Moniliophthora perniciosa (Stahel) (^{Aime & Phillips-Mora, 2005}). Adicionalmente, los polifenoles junto con otros compuestos son los responsables del color y sabor del chocolate (^{Porter et al., 1991}; ^{Counet, Ouwerx, Rosoux, & Collin, 2004}; ^{Niemenak, Rohsius, Elwers, Ndoumou, & Lieberei, 2006}; ^{Oracz, Zyzelewicz, & Nebesny, 2015}; ^{Magrone et al., 2017}). Se ha registrado para Theobroma, que los polifenoles se acumulan en las vacuolas principalmente de tejidos epidérmicos y parenquimatosos (^{Martini, Figueira, Lenci, & Tavares, 2008}; ^{Elwers et al., 2010}; ^{Garcia et al., 2014}; ^{Alean et al., 2020}) lo cual es congruente con las observaciones anatómicas realizadas en este trabajo para las anteras y filamentos de los estambres de los genotipos analizados de T. cacao.

En general, los granos de polen de todos los genotipos analizados de T. cacao tienen características micromorfológicas similares; son de contorno esféricos, pequeños, tricolpados, reticulados, heterobrocados y con presencia de orbículas, estos hallazgos son coincidentes con las observaciones previas para esta especie (^{Halbritter & Buchner, 2016}; ^{García et al., 2019}). Sin embargo, algunos detalles micromorfológicos como la complejidad de la ornamentación de los muros del retículo, del lumen y la ornamentación de la membrana de los colpos, así como la presencia de polenkit, se describen en detalle en esta investigación para T. cacao. En general, el tamaño de los granos de polen de los genotipos analizados no supera los 20 µm y esto es coincidente con lo que ^{Erdtman (1986}) categoriza como polen pequeño y es similar con lo observado por ^{Enríquez (1985}) y ^{García et al., (2019}) para T. cacao.

La familia Malvaceae es euripalínica, y con la estructura y micromorfología de los granos de polen diversa, se ha registrado polen de contorno esférico, prolado, oblado y variación de estos contornos. Las aberturas pueden ser colpadas, colporadas o poradas, en tanto que la ornamentación va desde reticulada, equinulada, foveolada o variación de estos patrones (^{Bayer & Kubitzki, 2003}; ^{Perveen, Grafström, & El-Ghazaly, 2004}; ^{Perveen & Qaiser, 2009}; ^{Bibi, Naveed, Manzoor, & Ajab, 2010}; ^{Hamdy & Shamso, 2010}; ^{Mambrín, Avanza, & Ferrucci, 2010}; ^{Saba & dos Santos, 2015}; ^{Halbritter & Buchner, 2016}; ^{Silveira Júnior, Lima e Lima, & Saba, 2017}; ^{Amirul-aiman et al., 2019}). Para la subfamilia Byttneridoideae a la cual se circunscribe T. cacao, ^{Hamdy y Shamso (2010}) han descrito dos tipos polínicos: el tipo Abroma característico de la tribu Byttnerieae que presenta polen tricolpado, en tanto que el tipo Brachychiton presente en la tribu Theobromeae caracterizado por tener polen tricolporado. Por otro lado, los estudios realizados por ^{Silveira Júnior et al., (2017}) en Waltheria L. (Malvaceae-Byttnerioideae) muestran una gran variabilidad en las aberturas (colporados, pantoporados y pantocolporados) pero no se observan granos colpados. De acuerdo a nuestras observaciones de los diez genotipos de T. cacao indican que los granos de polen son afines con el tipo Abroma por la presencia de tres colpos.

Analizando los caracteres micromorfológicos de los granos de polen de los genotipos y su relación con los modelos de compatibilidad polínica, no se encontró una relación específica, por ejemplo, se observaron genotipos autoincompatibles y autocompatibles que tienen muros ornamentados y sin ornamentación; lo mismo, se cumple para los tipos de ornamentación microgranulada y escabrada presente en el lumen del retículo. Lo anterior, también se aplica para las medidas tomadas como: el tamaño de los granos de polen, la medida promedio del colpo, la relación diámetro del grano de polen y colpo y el largo del colpo. El polenkit fue abundante en los genotipos SCC 19 (autocompatible) y SCA 6 (autoincompatible) y no se pudo observar en los demás genotipos; sin embargo, es importante entender que T. cacao es una especie polinizada por insectos en especial por dípteros (^{Kaufmann, 1975}; ^{Young et al., 1984}; ^{Young et al., 1987}; ^{Young & Severson, 1994}; ^{Adjaloo & Oduro, 2013}; ^{Bridgemohan et al., 2017}; ^{Chumacero de Schawe, Kessler, Hensen, & Tscharntke, 2018}) lo que implica probablemente, la presencia de polenkit en todo los genotipos (^{Pacini & Hesse, 2005}), y más aún cuando se ha documentado que el procesamiento de los granos de polen para su observación con MEB utilizando 2.2 dimetoxipropano y secado al punto crítico puede eliminar esta estructura de la superficie de los granos de polen (^{Pacini & Hesse, 2005}; ^{Halbritter et al., 2018}). Todas las observaciones anteriores reforzarían la idea de que la autoincompatibilidad de T. cacao es del tipo tardía y está relacionada con la fusión del núcleo espermático del grano de polen y el núcleo de la ovocélula en el saco embrionario (^{Ford & Wilkinson, 2012}; ^{Lanaud et al., 2017}; ^{N’Zi et al., 2017}; ^{de Jesus Branco et al., 2018}; ^{Narayanapur et al., 2018}). Más aun, se ha documentado que el polen de las especies autoincompatibles puede germinar sobre sus estigmas y formar un tubo polínico viable (^{N’Zi et al., 2017}).

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