Materiales y métodos

Material biológico: Los especímenes de la esponja marina I. birotulata fueron recolectados en Punta Bello, Caribe colombiano (9.25° N - 75.43° W). El material fue sometido a congelación hasta el posterior tratamiento. Los especímenes recolectados fueron ubicados taxonómicamente y un ejemplar de colección se encuentra en el laboratorio de Química de los Productos Naturales de la Universidad de Córdoba con el código PNM-P13.

Obtención de los extractos: El material recolectado de I. birotulata fue cortado en pedazos y sometido a percolación en metanol (MeOH) durante 5 días (este proceso se realizó tres veces), luego se filtró y se concentró a presión reducida obteniendo el extracto metanólico, el cual fue sometido a fraccionamiento por reparto empleando mezclas de cloroformo:agua (1:1), la fase orgánica fue separada y concentrada a presión reducida hasta obtener el extracto clorofórmico, mientras que la fase acuosa se liofilizó obteniendo el extracto acuoso (^{Pastrana, Santafé, & Torres, 2016}).

Obtención de la fracción lipídica: El extracto clorofórmico fue sometido a cromatografía en columna (CC) usando sistemas de elución desde Hexano:AcOEt (7:1) hasta Metanol (MeOH), las subfracciones obtenidas fueron monitoreadas por cromatografía de capa delgada (CCD). Como reveladores fueron utilizados luz ultravioleta, vapores de yodo y el reactivo de Liebermann-Burchard. Las subfracciones con Rf similares al ácido oleico y al colesterol fueron reunidas y concentradas a presión reducida para su estudio por cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas (CG-EM) (^{Pastrana, Santafé, & Torres, 2016}).

El experimento se realizó en un Cromatógrafo de Gases Agilent 6890N con detector selectivo de masas Agilent 5973N. Se utilizó una columna DB-5MS con un volumen de inyección 3 µl en modo Splitless. Para la identificación de los compuestos registrados se utilizaron las librerías NIST02.L, NIST5a.L y NIST98.L.

Ensayos de actividad antioxidante:

Método de radical DPPH•. Se preparó una solución madre de DPPH• (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) que contiene 150 mg DPPH•/7 ml MeOH, la cual fue guardada en la oscuridad por 24 h. Luego se tomaron pequeñas alícuotas, las cuales fueron diluidas con MeOH hasta obtener una absorbancia de 0.300 ± 0.05 a una λ = 517 nm, ajustando con un blanco de MeOH. Para la evaluación de la actividad antioxidante, se mezclaron 40 µl del patrón de muestra disuelto en dimetilsulfóxido (DMSO) con 1 960 μl del radical DPPH• previamente preparado. La mezcla se dejó a temperatura ambiente durante 30 min en la oscuridad y posteriormente se leyó la absorbancia en el espectrofotómetro a 517 nm. Para el blanco de muestra se mezclaron 40 µl del patrón de muestra con 1 960 µl de MeOH y para la referencia se mezclaron 40 µl de DMSO con 1 960 µl del radical DPPH• (^{Santafé, Pastrana, & Quirós, 2016}). Todas las mediciones fueron realizadas por triplicado y el porcentaje de Inhibición a esa concentración fue calculado utilizando la ecuación 1. Luego se graficó el % inhibición vs la concentración determinando el porcentaje de inhibición medio (IC₅₀) por interpolación lineal.

Método del catión radical ABTS+•. Se preparó una solución madre de radical ABTS• (ácido 2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico)) (17.5 mg de ABTS• en 9.9 ml de H₂O estéril). Luego se tomaron 34 mg de persulfato de potasio (S₂O₈K₂) diluidos en 1 ml de agua destilada. De estas soluciones preparadas se tomaron 9.9 ml de solución de ABTS• (3.5 mM) y 0.1 ml de solución de persulfato de potasio (125 mM) y se mezclaron. Posteriormente la mezcla fue guardada en la oscuridad por 12 h, luego se tomaron pequeñas alícuotas que fueron diluidas con un buffer fosfato de pH 7.4 hasta obtener una absorbancia ajustada de 0.700 ± 0.05 a una λ = 732 nm, ajustando con un blanco de buffer fosfato. Para la evaluación de la actividad antioxidante se mezclaron 40 µl del patrón de muestra en dimetilsulfóxido (DMSO) con 1 960 μl de catión radical ABTS+• previamente preparado, la mezcla fue incubada a temperatura ambiente durante 30 min en la oscuridad y posteriormente se leyó la absorbancia en el espectrofotómetro a 732 nm. Para el blanco de muestra se mezclaron 40 µl del patrón de muestra con 1 960 µl de buffer de fosfato y para la referencia se mezclaron 40 µl de DMSO con 1 960 µl de catión radical ABTS+• (^{Santafé, Pastrana, & Quirós, 2016}). Todas las mediciones fueron realizadas por triplicado y el porcentaje de inhibición a esa concentración fue calculado utilizando la ecuación 1. Luego se graficó el % Inh vs la concentración para determinar el porcentaje de inhibición medio (IC₅₀) por interpolación lineal.

Actividad insecticida y antialimentaria: El ensayo se desarrolló contra larvas de Spodoptera frugiperda, obtenidas de insectos maduros de la misma especie previamente recolectados de un cultivo de algodón libre de agroquímicos desarrollado en la Universidad de Córdoba. Los insectos maduros se mantuvieron en frascos plásticos sobre un abanico de papel y alimentados con solución acuosa de miel al 30 % y cerveza por medio de algodones impregnados hasta de deposición de los huevos, los cuales fueron transferidos a cajas de Petri con hojas tiernas de algodón e incubados a 25 °C y 75 % de humedad relativa.

Para el ensayo se depositaron en cajas de Petri discos foliares de algodón lavados con agua destilada y secados a la sombra, posteriormente fueron impregnados por 5 min con soluciones de los extractos metanólico y acuoso a concentraciones de 1 000, 2 000, 3 000, 4 000 y 5 000 µg/ml. Como control negativo fueron utilizados discos foliares impregnados con solvente (agua:metanol 95:5) y como testigo absoluto discos foliares lavados con agua. Posteriormente fueron depositadas las larvas, las cuales tenían entre 6 y 9 h de haber eclosionado, luego fueron incubadas a temperatura ambiente durante 72 h. Todos los ensayos fueron realizados por cuadruplicado tomando los valores promedio correspondientes. La actividad insecticida se determinó haciendo lecturas de larvas afectadas a las 24, 48 y 72 h (^{Jiménez, Rodríguez, Murillo, Méndez, & Rueda, 2013}). Para evaluar el número de larvas afectadas se toman como criterios la no respuesta de las larvas a un estímulo punzante, su color amarillo, que sean pequeñas, el poco consumo y/o que estén muertas. Pasadas las 72 h, se conservan las larvas en etanol al 70 % para posteriormente medir su longitud (tamaño) y se tomaron los discos foliares de las hojas de algodón utilizadas en el ensayo midiendo el área de consumo de las larvas. La observación de las larvas en los ensayos de actividad insecticida y la medida de sus tamaños se efectuó utilizando una lentilla micrométrica acoplada a un estereoscopio. Para la determinación de la actividad antialimentaria se realizó la medición del área del consumo foliar empleando el software AUTOCAD y se calculó mediante la ecuación 2:

Siendo T el consumo foliar promedio para cada uno de los tratamientos y C el consumo foliar equivalente al control.

Análisis estadístico: Para la actividad antioxidante, todos los ensayos fueron realizados por triplicado tomando los valores promedios de los mismos. Para la actividad insecticida y antialimentaria, todos los ensayos fueron realizados por cuadruplicado tomando los valores promedios de los mismos. Para todas las actividades realizadas se determinó la correlación de los valores obtenidos mediante un análisis de varianza (ANOVA) y un ensayo Tukey con un nivel de significancia del 95 %.

Resultados

Composición lipídica: El perfil lipídico de I. birotulata fue determinado mediante el análisis de los correspondientes espectros de masas de sus compuestos constituyentes, lográndose la identificación de 19 ácidos grasos, los cuales son reportados por primera vez para esta especie; además, fueron identificados 10 esteroles (Cuadro 1). Los ácidos grasos identificados mostraron longitudes de cadenas desde C15 hasta C26, donde el 31.52 % de la mezcla total de ácidos grasos contienen cadenas saturadas, de este porcentaje, sólo el 17.80 % corresponde a ácidos grasos con cadenas lineales saturadas y el 13.72 % presenta cadenas saturadas ramificadas. El 61.01 % de la mezcla total de ácidos grasos presentan cadenas insaturadas, y de este porcentaje, el 38.98 % corresponde a los ácidos grasos de cadenas lineales insaturadas y el 22.03 % presenta cadenas ramificadas insaturadas. Con relación al tipo de insaturación encontrado se obtuvo que los ácidos grasos monoinsaturados están presentes en un 37.6 %, los diinsaturados en un 5.10 %, y con un porcentaje menor equivalente al 14.54 % aparecen los ácidos grasos poliinsaturados.

Por su parte, en el análisis de la distribución de los diferentes núcleos esteroidales encontrados, se observó que los esteroles con núcleo Δ⁵-3β-Hidroxiandrosteno dominaron con un 55.97 % (es el de más amplia distribución en la naturaleza), siguiéndole el núcleo Δ⁷-3β-Hidroxiandrosteno con un 43.65 %. Teniendo en cuenta la presencia o ausencia de insaturaciones en la cadena lateral de los esteroles identificados, se observó que dominaron en igual proporción las cadenas insaturadas en el C22 (Δ²²) y C24 (Δ²⁴) con un 30 % de abundancia cada una de ellas.

Los esteroles con cadena lateral saturada presentaron una abundancia del 20 %, mientras que los esteroles con insaturación en C24(28) (Δ²⁴⁽²⁸⁾) y con doble insaturación (Δ^22,24(28)) estuvieron presentes en forma minoritaria con un 10 % de abundancia. En cuanto a la distribución de los esteroles identificados de acuerdo con el número de átomos de carbono, se puede afirmar que los esteroles que presentaron mayor abundancia fueron los de 29 átomos de carbono mostrando un porcentaje equivalente al 50 % y los esteroles de 27 átomos de carbono con 30 %, (estos tipos de esteroles son los de más amplía distribución en la naturaleza); los esteroles con 28 átomos de carbono presentaron un porcentaje de abundancia del 20 %, siendo los menos frecuentes.

Actividad antioxidante: Se encontró que los extractos evaluados presentaron actividad antioxidante moderada frente a la capacidad de estabilización del catión radical ABTS+•, con valores de IC₅₀ de 52.6 µg/ml para el extracto metanólico, 62.3 µg/ml para el subextracto clorofórmico y 43.9 µg/ml para el subextracto acuoso (Cuadro 2). Sin embargo, no se encontró el mismo resultado frente a la capacidad de estabilización del radical DPPH•, con valores más altos de IC₅₀ (139.8 µg/ml para el extracto metanólico, > 200 µg/ml para los otros).

Actividad Insecticida: Se encontró que solo los extractos acuoso y metanólico presentaron inhibición del crecimiento larvario significativo en el ensayo preliminar, los cuales estuvieron por encima de 30 % para ambos extractos. Por su parte, el extracto clorofórmico no superó el 15 % de inhibición del crecimiento larvario en el ensayo preliminar siendo descartado para los posteriores ensayos (Cuadro 3).

Actividad antialimentaria: En cuanto al efecto antialimentario de los extractos frente a las larvas (Cuadro 4), se observó que esta característica está más ligada a la concentración de los extractos, encontrándose el mayor efecto a concentraciones de 5 000 µg/ml para ambos extractos, los valores encontrados son más altos en relación con las demás concentraciones.

Discusión

Las esponjas son organismos que están asociados normalmente con la abundante presencia de ácidos grasos de cadenas largas (> C24) con porcentajes que están por encima del 80 % del total de ácidos grasos. Lo anterior se da principalmente en aquellas especies que viven en ambientes acuáticos profundos, ya que estos ácidos al ser constituyentes esenciales de las membranas celulares contribuyen con la resistencia del organismo a las altas presiones a las que están expuestos (^{Lawson, Bergquist & Cambie, 1986}). Sin embargo, en I. birotulata este porcentaje de ácidos grasos de cadena larga no superó el 30 %. Esto podría deberse a que I. birotulata es un organismo que se encuentra principalmente en aguas de baja profundidad (^{Quirós, Medrano & Santafé, 2017}), por lo que posiblemente no requiere en sus membranas celulares ácidos grasos con cadenas laterales tan largas. Sin embargo, esto solo podría ser comprobado a través de un análisis comparativo de la longitud de las cadenas carbonadas de los ácidos grasos, presentes tanto en esponjas que viven en ambientes acuáticos profundos como las que viven en ambientes someros.

Se encontraron ácidos grasos de cadenas ramificadas como el ácido 4,8,12-trimetiltridecanoico, el ácido 9,12,13-trimetiltetradecanoico y el ácido 5,6-dimetil-8-hexacosenoico, característica que está de acuerdo con la observación general que relaciona al filum porífera con la producción de ácidos grasos con cadenas laterales ramificadas (^{Carballeira, Maldonado, & Porras, 1987}). En este aspecto, es interesante la presencia de la sustitución en el C13 del ácido 9,12,13-trimetiltetradecanoico, la cual es considerada como una sustitución inusual para las esponjas, pero que se ha evidenciado en especies del género Agelas, sin que se tenga una completa certeza de la función realizada por este tipo de compuestos químicos (^{Rodríguez et al., 2005}), desde este punto de vista el género Iotrochota puede considerarse como productor de este tipo de ácidos. También se encontró un alto porcentaje de ácidos grasos monoinsaturados (AGMI), los cuales en otros organismos marinos están relacionados directamente con la fluidez de la membrana, comportamiento que les permite adaptarse a condiciones en el medio acuático (^{Drazen, Phleger, & Nichols, 2008}), por lo que en I. birotulata, los AGMI pueden asumir esta misma función.

En cuanto a la concentración de ácidos grasos poliinsaturados (AGPI), I. birotulata mostró un bajo porcentaje. Los AGPI modulan algunas enzimas cuya función es la protección de las células a los procesos de oxidación, llegando a ser utilizados en la prevención y tratamiento de enfermedades como diabetes mellitus (^{Pérez & Guerrero, 2006}). Por lo tanto, la baja concentración de AGPI en I. birotulata está directamente relacionada con su incapacidad para producir compuestos químicos con alta actividad antioxidante. Sin embargo, es de resaltar la presencia del ácido eicosapentaenoico (EPA) en este organismo, el cual ha sido empleado en el tratamiento dietario de pacientes con estado avanzado de diferentes tipos de cáncer mostrando resultados relevantes en la disminución de los procesos de degradación celular ocasionados por la enfermedad (^{Dewey, Baughan, Dean, Higgins, & Johnson, 2012}). Lo que podría suponer que los extractos de I. birotulata pueden llegar a exhibir actividad citotóxica frente a una o varias líneas de células tumorales.

Asimismo, se resalta la presencia del ácido docosahexaenoico, el cual ha mostrado potente actividad antimalárica con porcentajes de inhibición superiores al 90 % frente a Plasmodium falciparum; que al igual que otros AGPI de las series C20 y C18 pero con menores actividades, causan principalmente hemólisis en las células sanguíneas del parásito o en ocasiones inhiben su síntesis de ácidos grasos (^{Carballeira, 2008}). La presencia de este compuesto en I. birotulata le convierte en una posible fuente natural de metabolitos con potencial antimalárico.

De otra parte, los esteroles identificados en I. birotulata muestra un patrón más característico y acorde con la información relacionada con este tipo de compuestos en esponjas encontrándose principalmente núcleos Δ⁵-3β-Hidroxiandrosteno y Δ⁷-3β-Hidroxiandrosteno. Sin embargo, no se evidenció la presencia de esteroles con núcleo Δ⁰-3β-Hidroxiandrostano, ni tampoco esteroles con núcleo Δ^5,7-3β-Hidroxiandrosteno, los cuales también son ampliamente abundantes en poríferos (^{Valle & Santafé, 2009}). Se evidenció que el esterol más abundante es el colesta-5-en-3β-ol (colesterol) con un porcentaje de abundancia del 27 %, lo cual es consistente con el hecho de que este compuesto es el más ampliamente distribuido en los invertebrados marinos y que es un constituyente indispensable de las membranas celulares, así como el precursor de otros tipos de sustancias fisiológicamente importantes en estos organismos (^{Kanazawa, 2001}).

La presencia de varios esteroles del tipo 24-metil y 24 etil en I. birotulata como es el caso del sitosterol, campesterol y algunos derivados (los cuales son más comunes en plantas que en invertebrados marinos) (^{Santafé, Pastrana & Quirós, 2016}), sugiere que I. birotulata posiblemente introduce este tipo de esteroles a su organismo a través de la dieta, fundamentada principalmente en fitoplancton (Quirós, Medrano & Santafé, 2017) realizando posteriores modificaciones estructurales.

Se evidenció que el extracto más activo frente al ABTS+• fue el acuoso, esto posiblemente se debe a que en este extracto se encuentran los compuestos más polares, como polifenoles, a los que se les ha atribuido una elevada actividad antioxidante (^{Torres & Ganoza, 2017}).

En cuanto al extracto clorofórmico, se observó una actividad mucho menor en comparación con los extractos polares. Esto posiblemente debido a la presencia de compuestos químicos de polaridad mediana y baja, aunque estos valores pueden considerarse relevantes para extractos de polaridad intermedia (^{Santafé, Pastrana, & Quirós, 2016}). Si bien a los compuestos de polaridad media y baja no se les ha atribuido una marcada actividad antioxidante, algunos AGPI, los cuales se encuentran presentes en este organismo, han demostrado ser efectivos en el control de algunas enfermedades producidas por el estrés oxidativo (^{Cawood et al., 2010}). Esta disminución en la actividad antioxidante también puede deberse a que en la metodología utilizada se emplearon solventes de polaridad alta (etanol y agua) factor que podría estar afectando la solubilidad del extracto y por ende su impregnación en el sustrato empleado para el análisis.

En el ensayo de actividad insecticida se pudo observar que el extracto acuoso mostró mayor inhibición a todas las concentraciones y todos los tiempos de ensayo comparado con el extracto metanólico. A concentraciones bajas (1 000 µg/ml) y pasadas 48 h no se observaron diferencias significativas en la afectación larval entre ambos extractos. Sin embargo, estas diferencias empiezan a ser más notorias a medida que la concentración de los extractos aumenta y los tiempos de exposición del ensayo son cortos (24 h). Así hasta el punto de lograr el 100 % de la afectación larval para el extracto acuoso a la concentración de 5 000 µg/ml para los tres tiempos de exposición del ensayo. Deduciendo que en el extracto acuoso se encuentran compuestos con mayor capacidad de inhibir las larvas de S. frugiperda, esto podría ser utilizado con insecticida de origen natural para el control de esta plaga.

Si bien el extracto acuoso mostró los mejores resultados de afectación larval a las concentraciones y todos los tiempos de exposición del ensayo, se observó que existe una diferencia significativa entre la concentración más baja (1 000 µg/ml) y todas las demás concentraciones de este extracto. En este mismo sentido, se observó que a concentraciones superiores a los 2 000 µg/ml, las variaciones en la afectación larval no son tan marcadas en ninguno de los tiempos de exposición del ensayo. Lo anterior exceptuando la concentración más alta (5 000 µg/ml) en la que se observó una afectación larval del 100 % a las 24 h de exposición. Esto evidenció que la concentración de 2 000 µg/ml puede generar una afectación larval significativa a tiempos de exposición de 24 h, siendo estas las posibles condiciones óptimas y favorables en cuanto a la eficiencia y menor utilización de recursos para una posible utilización de dicho extracto como insecticida natural.

Por su parte, en el extracto metanólico se observó que a concentraciones bajas la afectación larval no es altamente significativa. Sin embargo, a medida que se aumentó la concentración y los tiempos de exposición al ensayo aumentó la afección larval. Una característica importante que se logró observar es que a concentraciones superiores de 3 000 µg/ml del extracto metanólico y tiempos de exposición de 48 h no se observó diferencias apreciables en el ensayo y cuando se aumentó el tiempo de exposición a 72 h, se observó que el aumento en la afección larval no es significativamente grande a ninguna de las concentraciones. Por lo tanto, la mayor eficiencia en la afectación larval para el extracto metanólico se logró a una concentración de 3 000 µg/ml y un tiempo de ensayo de 48 h.

La selección de concentraciones y tiempos de exposición de los ensayos para los extractos acuoso y metanólico puede ser también justificada en razón a la longitud de las larvas afectadas. Lo anterior debido a que no se encontraron diferencias significativas en los tamaños de las larvas afectadas a ninguna de las concentraciones en ambos extractos. Dicho comportamiento podría ratificar que emplear concentraciones más altas que 2 000 µg/ml para el acuoso y 3 000 µg/ml para el metanólico generaría mayores gastos de materia prima que no se verían reflejados en mejores resultados.

El extracto acuoso es el que mejor produce el EAA en las larvas, también es el que generó mayor afectación larval. Esto podría suponer que este extracto posee compuestos que, en primer lugar, son capaces de afectar la larva sin inducir un elevado EAA en las mismas, comportamiento observado a concentraciones entre 2 000 y 4 000 µg/ml, en las que no se superó el 50 % del EAA, aunque se observó una afección larval bastante significativa. En segundo lugar, a compuestos que posiblemente inducen un elevado EAA en la larvas y por ende una afección larval total en el ensayo.

Comparados con estudios previos de actividad insecticida y antialimentaria (^{Rojano & Montoya, 2007}; ^{Céspedes, Salazar, Martínez, & Aranda, 2005}), se puede afirmar que tanto el extracto acuoso como el extracto metanólico de I. birotulata se pueden considerar como promisorios y eficientes agentes agroquímicos para el control del gusano cogollero de maíz S. frugiperda, ya que ambos pueden producir afección larval a varias concentraciones y tiempos de exposición, además de inducir un importante efecto antialimentario.

Declaración de ética: los autores declaran que todos están de acuerdo con esta publicación y que han hecho aportes que justifican su autoría; que no hay conflicto de interés de cualquier tipo; y que han cumplido con todos los requisitos y procedimientos éticos y legales pertinentes. El documento firmado se encuentra en los archivos de la revista