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Abstract
Geometric wing morphometrics for Chrysomya albiceps and C.  megacephala identification (Diptera: Calliphoridae) from Venezuela. Calliphoridae is one of the families with the greatest number of species with forensic importance, which immature stages feed and develop on decaying material. in Venezuela, there are few studies on this taxon reporting the dominance of Chrysomya over other carrion flies. The goal of this study was to analyze the variations on wing morphometrics, to support the identification of two forensic flies. For this we photographed a total of 168 wings from C. albiceps (n=111) and C. megacephala (n=57). Landmark coordinate (x, y)  configurations were registered and aligned by Generalized Procrustes Analysis. Principal Component Analysis and shape significance test based on Procrustes  distance were implemented. Statistical analysis of variance found significant differences in wing isometric size (Kruskal-Wallis). The PCA showed the separation between species, and shape test showed significant differences (F Goodall´s). The main differences between both species were localized on subcosta rupture, join of R2+3   with  wing border, join of dm-cu, and join of Cu with bm-cu, suggesting that wing morphometrics is a suitable tool in the discrimination of blowfly species.

Key words: landmarks, procrustes, forensic entomology, Chrysomyinae.

Resumen

Calliphoridae  es una de las familias con  el  mayor número  de  especies  de  importancia  forense,  donde  sus fases inmaduras se alimentan y desarrollan sobre material en descomposición. En Venezuela, son pocos los estudios en este taxon, sin embargo se ha reportado la dominancia del género Chrysomya sobre los otros dípteros. El objetivo fue analizar la variación  morfométrica en la arquitectura alar, como  herramienta de apoyo a la identificación de dípteros de importancia forense. Se fotografiaron 168 alas de C. albiceps (n=111) y C. megacephala (n=57) y se registraron configuraciones de coordenadas (x, y), se alinearon mediante Análisis Generalizado de Procrustes. Se efectuaron Análisis de Componentes Principales y comparaciones pareadas entre distancia parcial de Procrustes. El análisis estadístico de varianza encontró diferencias en el tamaño isométrico del ala (Kruskal-Wallis). El ACP mostró la separación de ambas especies, y la prueba de configuraciones determinó diferencias significativas (F Goodall). Las principales diferencias entre ambas especies se encontraron en: ruptura de la subcosta, unión de R2+3   con el borde del ala,  unión dm-cu, y unión de Cu con dm-cu, lo que confirma que  la morfometría alar es una herramienta  idónea en la discriminación de especies de Calliphoridae.

Palabras clave: puntos anatómicos de referencia, procrustes, entomología forense, Chrysomyinae.

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Los insectos necrófagos, entre ellos Diptera y Coleoptera, se alimentan de tejido en putrefacción y forman sucesiones ecológicas asociadas con cuerpos en descomposición. Estos grupos constituyen la categoría más importante para el establecimiento del Intervalo Post Mortem (IPM), tiempo transcurrido desde el momento del deceso hasta el instante que se encuentra el cadáver (Cova 1974, Smith 1986, Queiroz et al. 1997, Magaña 2001, Liria 2006). Los insectos son atraídos al cadáver por
los gases desprendidos durante el proceso de degradación de glúcidos, lípidos, entre otros, generando amoníaco (NH3) ácido sulfúrico (SH2), nitrógeno (N2) y anhídrido carbónico (CO2) (Byrd & Castner 2001). Con ello, los diferentes estados de descomposición de un cadáver atraen selectivamente a grupos de insectos. Generalmente, las moscas son las primeras en colonizar manteniendo una sucesión, que varía solo en la composición de especies (Byrd & Castner 2001, Calderón-Arguedas et al. 2005). Basados en este principio, la entomología forense es la disciplina que estudia a insectos y otros artrópodos asociados a cadáveres, como herramienta de la medicina legal para datar y estimar las causas y lugar de una muerte (Smith 1986, Maldonado 2002).  De esta manera, el reconocimiento de las especies vinculadas a la escena del crimen, proveen pruebas criminalísticas como: ubicación geográfica del suceso  e  IPM;  las  cuales  pueden  establecer la autoría, método utilizado, lugar y fecha de muerte (Smith 1986).

La estimación del IPM a partir de datos entomológicos, se realiza mediante: 1) estudios de sucesión (patrones de colonización y extinción de especies, no temporales, direccionales y continuos presentes en el cadáver), 2) comparando el desarrollo con tablas de crecimiento de la especie encontrada a una temperatura y humedad relativa específicas (Smith 1986, Von Zuben & Godoy 2001, Maldonado 2002). Es decir, el asiento para la determinación del IPM, es la identificación de especies, de los insectos encontrados en la escena del crimen.

Calliphoridae, es una de las familias con el mayor número de especies de importancia forense (Queiroz et al. 1997). En Venezuela, se ha reportado la dominancia del género Chrysomya sobre los otros dípteros. Particularmente especies como C. albiceps (Wiedemann 1819) y C. megacephala (Fabricius 1794), las cuales  colonizan  durante  los  primeros  días de  descomposición  (Mavárez-Cardozo  et  al.2005, Liria 2006, Magaña et al. 2006). En esta familia, existen escenarios donde se presenta dificultad para la identificación, restringiendo la determinación de la especie a solo uno o muy pocos caracteres morfológicos, que en ocasiones pueden ser ambiguos (Queiroz et al. 1997). Por otro lado, la identificación puede ser crucial en el análisis, porque especies estrechamente relacionadas crecen en proporciones de tiempo diferentes: a una temperatura de 19ºC, el crecimiento de una especie puede tener un promedio de 47 días, mientras que otra especie del mismo género, a la misma temperatura puede tener un promedio de 84 días (Wells & Williams 2005). Por consiguiente, la irresolución taxonómica puede llevar a una incertidumbre en la estimación del IPM.

Adicionalmente, aún cuando la entomología forense es una ciencia utilizada en Estados Unidos, España y en países de América Latina como Brasil, Argentina y recientemente Colombia, en Venezuela el estudio de la entomología forense no ha recibido una atención sistemática por los profesionales del área entomológica o por expertos forenses. Como consecuencia, el científico criminalista se enfrenta a la escena de un crimen con poca formación en morfología de insectos y taxonomía de grupos, por lo que, su aporte en la labor de establecer la data de la muerte por datos entomológicos se dificulta. Por lo anterior, se intenta explorar y optimizar una nueva herramienta que permita de una manera rápida, fácil y eficiente, la identificación de especies, y que proporcione pruebas criminológicas a la investigación en el tiempo requerido.

Actualmente, los métodos de identificación no sólo deben ser rápidos sino también de bajo costo. En este sentido, la morfometría geométrica, es una herramienta matemática con fundamentos biológicos (Bookstein 1991), que permite  descomponer  la  variación  resultante de la fisiología de los individuos de aquellas más estables propias de la población, producto del componente genético. Permite identificar individuos a partir de la conformación de estructuras específicas, en especies estrechamente  relacionadas  (Dujardin  2000),  basado en métodos de descripción y análisis estadísticos de la variación de la forma en estructuras particulares en y entre individuos (Rohlf & Marcus  1993).  Esta  técnica  se  ha  utilizado en diversas clases de organismos vegetales y animales (vertebrados e invertebrados), y particularmente en insectos de importancia médica, como triatóminos (Triatominae), flebótomos (Phlebotominae) y mosquitos (Culicidae). Ha sido empleada en estudios de estructura poblacional (De La Riva et al. 2001, Belen et al. 2004,  Schachter-Broide  et  al.  2004,  Dvorak et al. 2006, Soto-Vivas et al. 2007), identificación de especies (Matías et al. 2001, Villegas et al. 2002, Calle et al. 2008), para detectar diferencias entre parentales de campo y descendientes de laboratorio (Jaramillo & Wolff 2002), así como en estudios filogenéticos (Soto-Vivas et al. 2011).

Este trabajo pretende comprobar la aplicabilidad de la morfometría geométrica en el análisis  del  tamaño  y  configuración  del  ala en dos especies de Chrysomya, con el fin de proporcionar al campo de la criminalística una nueva herramienta que permita discriminar e identificar moscas de importancia forense.

Materiales y métodos

Adquisición de datos: Se realizaron muestreos sobre cadáveres de ratas SpragueDawley y cebo de bofe bovino (Corazón, hígado, páncreas), en el Campus Bárbula de la Universidad de Carabobo, estado Carabobo, Venezuela (10º18’15’’ N - 68º02’41’’ W). Las moscas  fueron  obtenidas  durante  el  primer día de descomposición de las ratas y cebos. Los califóridos se identificaron siguiendo las claves  taxonómicas  de:  Ribeiro  &  Carvalho 1998,  Carvalho  &  Ribeiro  2000,  Whitworth 2006 y Amat 2009. Un total de 168 alas: 111 de C. albiceps y 57 de C. megacephala, se disectaron y montaron en láminas, luego se fotografiaron, digitalizaron, y se ubicaron ocho puntos anatómicos de referencia en la nervadura de las venas del ala (PAR1-PAR8), los cuales corresponden con el tipo I sensu Bookstein (1991), siguiendo la nomenclatura de McAlpine (1987), ruptura de la subcosta (PAR1), unión de R1 con el borde del ala (PAR2), unión de R2+3 con el borde del ala (PAR3), unión de R4+5 con el borde del ala (PAR4), unión de M con el borde del ala (PAR5), unión dm-cu (PAR6), unión de Cu con dm-cu (PAR7) y unión de M  con  bm-cu  (PAR8).  La  configuración  de los ocho pares de coordenadas x y de cada ala (Fig. 1) se capturó mediante la ayuda del programa tpsDig (Rohlf 2006).

Análisis de morfometría geométrica: A partir de la matriz de 168 configuraciones de coordenadas geométricas de los ocho puntos (PAR1-PAR8), se realizó el Análisis Generalizado de Procrustes, con el programa CoordGen (Sheets 2005a) para una superimposición Procrustes y luego extraer una matriz con las variables de conformación (Partial warps=Pw) y tamaño centroide (CS). Esta matriz de Pw se usó para un Análisis de Componentes Principales (ACP) con el programa PCAGen (Sheets 2005b), mediante el cual se exploraron los principales ejes de variación morfológica en el espacio tangente, para observar las tendencias de variación entre y dentro de las muestras. Luego se evaluó la significancia entre las diferencias de configuraciones con el programa TwoGroup (Sheets 2005c) mediante la prueba de Goodall. El estadístico F está basado en el cociente de las distancias de Procrustes al cuadrado entre las medias de cada grupo, y la suma de  las  distancias  de  Procrustes  al  cuadrado entre cada espécimen y la media de su grupo. Sin embargo, esta prueba asume distribución de la variación alrededor de la media, por lo cual, se utilizó el método de Bootstrap para realizar 900 permutaciones a los datos y posterior cálculo del estadístico (Bookstein 1997, Zelditch et  al.  2004).  Las  diferencias  en  los  valores de CS entre las especies fueron analizadas en PAST (Hammer & Harper 2011) mediante la prueba de Kruskal-Wallis (p<0.05) con corrección de Bonferroni.

Resultados

Los análisis de morfometría geométrica se presentan a continuación.

Tamaño isométrico: Se encontraron diferencias significativas (Kruskal-Wallis: χ2=6.748, p<0.05) en el tamaño isométrico del ala, en donde C. albiceps presenta mayor talla (3.137mm±0.490) respecto a C. megacephala (2.971mm±0.409).

Diferencias de conformación alar: Se presentan los resultados del ACP y la comparación  pareada  entre  las  configuraciones  de las especies. El diagrama de los dos primeros componentes principales (Fig. 2) muestra la separación entre C. albiceps y C. megacephala; estas diferencias fueron significativas (F=50.17, gl1=12, gl2=1992, p<0.001) y distancia parcial de Procrustes 0.0311. La función de interpolación de placas delgadas (thin plate spline=TPS),  permitió  inferir  las  diferencias en conformación como deformaciones de los ocho puntos en una rejilla, calculada entre las configuraciones  promedios  de  ambas  especies en el ACP (Fig. 3). Las diferencias más importantes se presentan en los PAR1, PAR3, PAR6 y PAR7. En C. albiceps en el PAR1 ocurre desplazamiento hacia arriba en el sentido diagonal a la derecha, el PAR3 se mueve en sentido diagonal hacia el PAR2, mientras que el PAR6 se acerca en sentido diagonal hacia el PAR7, y a su vez se desplaza verticalmente. Por otra parte en C. megacephala, el PAR1 se desplaza hacia abajo en sentido diagonal a la izquierda, el PAR3 se acerca diagonalmente a la derecha hacia el PAR4, el PAR6 se desplaza hacia arriba en sentido diagonal al PAR3, y el PAR7 presenta desplazamiento vertical.

Discusión

Tamaño isométrico: Los resultados de las variaciones de tamaño del ala entre C. albiceps y C. megacephala, estimada a través del tamaño isométrico, revelan diferencias significativas entre ambos táxones. Brown (1979), realizó uno de los primeros estudios morfométricos del ala  en  especies  de  Muscidae,  Sarcophagidae y Calliphoridae. Aún cuando su investigación utilizó caracteres como distancia entre las venas r-m, m-cu, M, R2+3 y Sc, entre otras, la separación de los táxones se realizó mediante el tamaño del ala.

Por otro lado, Lomônaco & Germanos (2001) determinaron en Musca domestica (Linnaeus) el tamaño del ala y su relación con el tiempo de desarrollo larval y las densidades larvarias.  Encontrando  que  tales  variaciones son causadas por asimetrías fluctuantes (que denotan  pequeñas  desviaciones  de  la  simetría perfecta de cualquier carácter de organismos  con  simetría  bilateral),  y  que  dichas fluctuaciones fueron inducidas por la competencia  por  el  alimento. Asimismo,  indican que los niveles de variaciones en la asimetría fluctuante pueden ser indicativos de stress o de la plasticidad fenotípica de la especie, que estarían promoviendo la sobrevivencia de un número mayor de individuos.

Estos resultados fueron confirmados por Reigada  &  Godoy  (2005),  que  relacionaron el tamaño de alas y tibias en C. megacephala con su fecundidad estacional. Los autores determinan correlaciones negativas y significativas entre la temperatura mensual y los tamaños de ambas estructuras. De esta forma, el menor tamaño se presenta en los meses cálidos, cuando hay mayor abundancia de individuos (aumenta la competencia), por otro lado, durante los meses fríos se evidencian el mayor tamaño de las estructuras y a su vez la menor abundancia de individuos. Pero cabe destacar, que esto puede no cumplirse para todas las especies, puesto que, Gião & Godoy (2006) en estudios similares para Lucilia eximia (Wiedemann), encuentran que no existe correlación entre la temperatura y los tamaños de ala y tibia, y concluyen, que esto puede ser debido a la estabilidad en la abundancia de dicha especie durante el año.

En nuestra investigación, las diferencias del  tamaño  alar,  donde  C.  albiceps  presenta mayor talla respecto a C. megacephala, posiblemente se asocien a factores como la densidad larval, tipo de sustrato donde se criaron, variables ambientales como temperatura y humedad y competencia intraespecífica. Además,  estudios  sobre  dinámica  poblacional, dispersión y depredación en Calliphoridae,  señalan  la  gran  capacidad  competitiva de C. albiceps, con respecto a especies como C. putoria (Wiedemann), C. megacephala y Cochliomya macellaria (Fabricius); así como, la depredación de C. albiceps sobre durante la fase de dispersión larvaria (Godoy  et.  al.  2001,  Von  Zuben  &  Godoy 2001, Bartholo de Andrade C. macellariaet al. 2002, Faria et al. 2004, Gomes et al. 2006). Debido a esto, las diferencias de talla encontradas entre C. albiceps y C. megacephala podrían asociarse con aspectos relacionados a colonización de sustrato y competencia entre ambas especies.

Diferencias de conformación alar y uso de la morfometría geométrica para la identificación de especies: La función de placas delgadas TPS permitió evidenciar las diferencias de conformación, en la configuración de ambas especies. Tradicionalmente, en la clasificación taxonómica de las especies de Calliphoridae y otras familias de calípterados, los caracteres utilizados son la quetotaxia del tórax, presencia de setas en la superficie posterodorsal de la sección basal de la vena radial y la inflexión de la vena medial (Shewell 1987, Ribeiro & Carvalho 1998, Carvalho & Ribeiro 2000, Whitworth 2006, Amat 2009). La visualización de estos caracteres requiere de conocimiento detallado de morfología de insectos y taxonomía del grupo. Por otro lado, algunas de estas setas podrían desprenderse durante la manipulación o recolecta de los especímenes, y en algunos casos la interpretación de estos caracteres puede ser ambigua. Debido a esto, la configuración de la venación alar podría considerarse como una herramienta adicional en la taxonomía de estos táxones. Concretamente los puntos anatómicos de referencia son: ruptura de la subcosta (PAR1), unión de R2+3   con el borde del ala (PAR3), unión dm-cu (PAR6), y unión de Cu con dm-cu (PAR7).

Los estudios de variación en la morfología del ala de dípteros han demostrado que factores como: clima, temperatura, fotoperiodo a lo largo de un gradiente latitudinal y competencia larval durante el desarrollo, influyen en el tamaño y conformación del ala (Aytekin et al. 2007, Bubliy et al. 2007, Jirakanjanakit et al. 2007, Loh et al. 2008). En otros casos, las diferencias en la conformación podrían ser consecuencia de interacciones más complejas, que contenienen así información que permitiría postular hipótesis filogenéticas (Soto-Vivas et al. 2011).

Por ello, los resultados de distintos estudios sugieren que la morfometría geométrica es particularmente apropiada para el análisis fenotípico de variación de la forma (Klingenberg  &  Zaklan  2000).  Esta  herramienta permite  descomponer  la  variación  resultante de la fisiología de los individuos (variación de tamaño) de aquellas más estables propias de la población, producto del componente genético (variación de la forma) (Dujardin 2000). La morfometría geométrica ha demostrado su utilidad para resolver problemas taxonómicos en insectos de importancia médica (Matias et al. 2001, Villegas et al. 2002, Calle et al. 2008), mediante la discriminación a partir de la configuración alar, de los integrantes de una especie en particular de otros que no lo son.

Calle et al. (2008) lograron distinguir las hembras de 11 especies del subgénero Nyssorhynchus de Anopheles presentes en Colombia mediante el uso de la información contenida en la conformación del ala. Estos resultados permiten proponer la utilización de los puntos anatómicos seleccionados como apoyo en la taxonomía de este grupo Recientemente, Lyra et al. (2010) sugieren que la morfometría alar representa un método sencillo y fiable para la identificación de C. hominivorax (Coquerel) y C. macellaria.

Los resultados descritos en este trabajo, demuestran que la morfometría geométrica del ala es una herramienta idónea en la discriminación  de  especies  de  Calliphoridae,  siendo un método de fácil aplicación y con validación estadística. En este sentido, resulta interesante que utilizando ocho puntos anatómicos en el ala, a diferencia de los 16 empleados por Lyra (2010), se logren diferenciar las especies de Chrysomya. Sin embargo, aún es necesario realizar análisis adicionales que incluyan otras especies de los géneros Lucilia, Paralucilia, Cochliomya, entre otras, con el fin de evaluar la relevancia de los puntos anatómicos seleccionados.  Por  otro  lado,  esta  investigación abre camino en estudios de especies similares como C. albiceps y C. rufifacies (Macquart), en las cuales, la diferenciación se realiza por la presencia de una seta proepimeral y 2-4 setas proespisternales en C. rufifacies y sin seta proepimeral y 4-6 setas proespisternales en C. albiceps (Amat 2009).

Agradecimientos

Deseamos expresar nuestro agradecimiento a todas las personas que facilitaron su apoyo en la realización de este trabajo. Darjaniva Molina de Fernández, Ana Soto-Vivas e Gianna Martiradona, del instituto de Altos Estudios en  Salud  Pública  “Dr. Arnoldo  Gabaldon”  MppSalud. Al  Departamento  de  Biología  de la Universidad de Carabobo y FONACYT– MppCyT, Programa Misión Ciencias, por el apoyo y financiamiento de los estudios doctorales (MV). A los árbitros anónimos por los valiosos comentarios y sugerencias en mejora de la versión final del presente trabajo.

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*Correspondencia:
Marianela Vásquez: Departamento de Estudios Ambientales, División de Ciencias Biológicas, Universidad  Simón Bolívar, Caracas, Distrito Capital. Código Postal 1080, Venezuela. marianela.vasquez@gmail.com
Jonathan Liria: Departamento de Biología, Facultad Experimental de Ciencias y Tecnología, Universidad  de Carabobo. Valencia, estado Carabobo. Código Postal 2005, Venezuela. jonathan.liria@gmail.com 
1. Departamento de Estudios Ambientales, División de Ciencias Biológicas, Universidad  Simón Bolívar, Caracas, Distrito Capital. Código Postal 1080, Venezuela; marianela.vasquez@gmail.com
2. Departamento de Biología, Facultad Experimental de Ciencias y Tecnología, Universidad  de Carabobo. Valencia, estado Carabobo. Código Postal 2005, Venezuela; jonathan.liria@gmail.com

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