Introducción

El ñame espino (Dioscorea rotundata) es una planta perenne que forma tubérculos comestibles, lo cual le confiere una alta importancia económica para muchas regiones tropicales y subtropicales del mundo (^{Arya et al., 2019}; ^{Shiriki et al., 2015}). La familia a la cual pertenece el ñame está constituida por seis géneros, entre los cuales se encuentra el género Dioscorea que comprende alrededor de seiscientas especies; con especies comestibles como: D. alata, D. rotundata, D. esculenta, D. bulbifera, D. cayenensis, D. floribunda y D. composita (^{Coursey, 1967}; ^{Purseglove, 1972}). Colombia es un importante productor de ñame en regiones tropicales, con una producción anual de aproximadamente 422 063 t (^{Food and Agriculture Organization of the United Nations, 2017}), sus cultivos se extienden principalmente por la región Caribe, en donde pequeños productores se dedican a esta actividad. Se calcula que aproximadamente 20 000 familias dependen de esta planta para su sustento diario y el departamento de Córdoba es el más importante (^{Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, 2018}).

El ñame es atacado durante su período de cultivo por muchos patógenos, algunas de los cuales afectan los tubérculos producidos. Una de las enfermedades que en los años recientes ha adquirido especial importancia en Colombia, es la conocida como la pudrición seca de los tubérculos. Esta enfermedad se caracteriza por la pérdida de la integridad física de los tubérculos, los cuales se secan, endurecen y se vuelven inutilizables para el consumo en fresco o la siembra. Los síntomas más comunes son tubérculos agrietados que en su interior presentan tejidos duros y secos, con coloración café y marrón. En la literatura mundial se mencionan como posibles agentes causales los géneros fúngicos Aspergillus, Fusarium y Lasiodiplodia, los cuales están asociados a pérdidas de productos agrícolas en post-cosecha o almacenamiento (^{Adeniji et al., 2020}; ^{Gwa & Ekefan, 2017}). Por tratarse de una nueva enfermedad, en Colombia, no se han realizado estudios para investigarla y se desconocen los agentes causales, por lo que el presente estudio se llevó a cabo con el objeto de identificar y caracterizar hongos asociados a la pudrición seca de tubérculos del ñame.

Materiales y métodos

Para el estudio se seleccionó la zona costanera del departamento de Córdoba, en Colombia, en donde se han presentado los mayores problemas asociados a esta enfermedad y en donde ubican la mayor parte de los agricultores dedicados a esta actividad productiva.

Colecta de tubérculos

Se realizaron colectas de tubérculos de ñame (Dioscorea rotundata), afectados por la pudrición seca de ñame espino. Esta colecta fue manejada bajo los lineamientos señalados en Resolución 1466 del 03 de diciembre de 2014 que expresamente dice: “Por la cual se otorga un permiso marco de recolección de especímenes de especies silvestres de la diversidad biológica con fines de investigación científica no comercial y se toman otras determinaciones”. Las colectas se efectuaron en la Subregión zona costanera del departamento de Córdoba, en los municipios de Puerto Escondido, Moñitos y Los Córdobas. La ubicación de los sitios de muestreo se muestra en la Figura 1. En cada localidad se colectaron muestras de diez tubérculos que mostraban síntomas característicos de la pudrición seca, que se encontraban en almacenamiento en sacos y cajas a temperatura ambiente, debido a que los agricultores los conservan como semillas para próximas cosechas. Una vez colectados, se depositaron en bolsas plásticas estériles y transportados en neveras a temperatura entre -4 y -8 °C, a los laboratorios del Centro de Investigación Turipaná de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA), ubicado en el municipio de Cereté, departamento de Córdoba, con coordenadas geográficas: 8º50’79” de latitud norte y 75º47’58” de longitud oeste.

Figura 1 Zonas de muestreo de tubérculos de ñame (Dioscorea rotundata), afectados por pudrición seca en la zona costanera del departamento de Córdoba del Caribe colombiano. 2019. Figure 1. Sampling areas of yam (Dioscorea rotundata) tubers, affected by dry rot disease in the coastal zone of the department of Córdoba in the colombian Caribbean. 2019. 

Aislamiento

El aislamiento de los hongos se efectuó en el laboratorio, según el protocolo diseñado por ^{Montiel et al. (2016)}. Los tubérculos se dividieron en tres secciones (basal, medio y apical), de las cuales se extrajeron, con cuchillo, rodajas de entre 10 y 12 mm de grosor; estas se lavaron con agua del grifo y se sumergieron en hipoclorito de sodio al 3 % por 2 min. Las rodajas se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril y se escurrieron en papel filtro. Posteriormente, se dividieron en secciones de 1 cm³ y se sumergieron en alcohol al 70 % por 1 min. Se sembraron en cajas de Petri con medio estéril de agar papa dextrosa (APD Merck®) (39 g l^-1), suplementado con Amikacina Biclin® (1 ml l^-1). Las cajas se incubaron (Memmert®, INE 500 E5120992, Alemania) a 28±2 °C por siete días. Los crecimientos fúngicos se aislaron en medios de cultivo APD mediante resiembras continuas hasta alcanzar cultivos puros (^{Chowdhury et al., 2019}).

Caracterización morfológica

Se realizó una descripción de los aislamientos mediante observaciones micro y macroscópicas de los cultivos puros, se empleó para las observaciones microscópicas el azul de lactofenol en un microscopio binocular (Leica®, DM500, USA) (^{Fonseca et al., 2019}); al microscopio se vieron la producción de esporas, conidios e hifas. Con base en esta caracterización fue posible la identificación del género presuntivo, mediante la comparación con claves descritas en la literatura por ^{Arenas (2014)}, ^{Barnet & Hunter (1998)} y ^{Garzón (2013)}. Para la caracterización macroscópica, los cultivos puros se monitorearon a los 7, 14 y 21 días después de la siembra, se describió la coloración, la textura, el borde, la superficie y la presencia o ausencia de exudados (^{Pacasa-Quisbert et al., 2017}). La caracterización morfológica permitió la agrupación de los hongos en morfotipos, acorde con la similitud en las características microscópicas y macroscópicas. Para incentivar la esporulación de algunos de los aislados que no esporularon bajo condiciones normales, se elaboró un caldo de maíz (^{Curvelo & Rojas, 2010}) y se inoculó el hongo, dejándolo incubado (Memmert®, INE 500 E5120992, Alemania) por siete días a 28±2 °C.

Porcentaje de ocurrencia

Con los resultados de la clasificación en morfotipos, se calculó el porcentaje de ocurrencia, mediante la ecuación 1 (^{Gwa & Richard, 2018}):

(1)

Donde:

Y= número de individuos de un mismo morfotipo.

Z= número total de aislados fúngicos.

Caracterización molecular de los aislados

Se realizó una caracterización molecular de los aislados, mediante la amplificación de la región ITS del DNA ribosomal y de los genes β-tubulina 2 y Calmodulina. La extracción del ADN se realizó con base en el protocolo establecido por ^{Voigt et al. (1999)}, para lo cual los micelios secos de los hongos, se maceraron con nitrógeno líquido. El pulverizado obtenido se suspendió con 700 µl de buffer de extracción CTAB (NaCl1.4M, EDTA 25 mM pH 8.0 20 mM, Tris HCl 100 mM pH 8.4, CTAB 2 %) y se agitaron durante 30 s en vortex (Labnet International, Inc. NJ, VX-200, USA). Las muestras se incubaron a 65 °C por 1 h en baño serológico (Memmert, 29 l, Alemania). Se agregó un volumen igual de cloroformo a cada tubo y se agitó en Vortex por 30 s; estos tubos se centrifugaron (Z 326 K, Alemania) a 12 000 s^-1 durante 15 min. Del centrifugado se recuperó la fase superior en un nuevo tubo y se precipitó el ADN con la adición de un volumen igual de isopropanol frío (-20 °C). La mezcla se centrifugó a 12 000 s^-1 por 5 min, descartándose el sobrenadante. El pellet se lavó dos veces con 500 µl de etanol al 70 %, se centrifugó a 12 000 s^-1 y se descartó el sobrenadante. Después del lavado se secó a temperatura ambiente y, finalmente se suspendió de nuevo en 200 μl de buffer TE 1X (Tris-Cl 10 mM [pH 8,0] - EDTA 1 mM [pH 8,0]). El ADN obtenido se almacenó a -20 ° C.

En el proceso de PCR, para un volumen de 25 µl, se preparó una mezcla de 0,1-1,0 µM de cada cebador (Invitrogen™) (Cuadro 1), 10 pg-1 µg de ADN, 1 µl de albúmina de suero bovino y 12,5 µl de Master mix PCR 2X (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) que contiene 0,05 U µl^-1 Taq ADN polimerasa, tampón de reacción, MgCl₂ 4 mM, 0,4 mM de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP y dTTP).

Cuadro 1 Cebadores utilizados en la amplificación por PCR del ADN de los hongos asociados a la pudrición seca del tubérculo del ñame (Dioscorea rotundata), de la zona costanera del departamento Córdoba del Caribe colombiano. Laboratorio del Centro de Investigación Turipaná de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA). Colombia, 2019. Table 1. Primers used in the PCR amplification of fungi DNA associated with dry rot disease of the yam (Dioscorea rotundata) tubers. Coastal zone of the department of Cordoba in the Colombian Caribbean. 2019. Turipana Research Center Laboratory of the Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA). Colombia, 2019. 

^{Gardes & Bruns (1993)}, ^{O' Donnel & Cigeinik (1997)}, ^{O' Donnell et al. (2000)}

La amplificación se llevó a cabo en un termociclador MiniAmp Plus (Applied Biosystems™, Singapur, Asia). Para la región ITS se realizó la desnaturalización a 94 °C por 4 min, con 35 ciclos de desnaturalización a 94 °C por 30 s; la alineación se realizó a 55 °C por 30 s; la elongación a 72 °C por 45 s y la extensión final a 72 °C por 7 min. Las mismas condiciones de PCR con una temperatura de alineación de 59 °C se conservaron β-tubulina-2 y Calmodulina.

Para verificar la calidad de la extracción de ADN se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1 % y para los productos PCR al 2 %. El buffer usado para la preparación del gel y la corrida fue buffer TAE1X y se usó una cámara de electroforesis horizontal Enduro ™ VE20 (Labnet interntional Inc Taiwán, China). La corrida se realizó a 70 V por 15 min para ADN y 30 min para los productos PCR. Como revelador del gel se usó EZ-vision® (Amresco Inc., USA) y como marcador molecular Generuler 1kb DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific Inc., USA). La visualización de las bandas en el gel se realizó en un foto documentador de geles Gel Doc XR (BioRad, USA).

Identificación molecular

Los productos del PCR se enviaron al Laboratorio de Genética Molecular del Centro de Investigación Tibaitatá- Mosquera-Bogotá, para el análisis de secuenciación Sanger en doble sentido, se utilizó el equipo de electroforesis capilar ABI 3500 (Applied Biosystems™, USA). Las secuencias obtenidas se limpiaron y ensamblaron en una secuencia consenso, se empleó el software Bioedit (Versión 7.0.5.3., Carlsbad, USA). Las secuencias consenso se alinearon con secuencias referenciadas de la base de datos del GenBank mediante la herramienta BLASTn. El árbol filogenético se construyó con el software Mega 10 (Versión 10.0.5., State College, USA), se alinearon las secuencias con la herramienta MUSCLE, y se elaboró el árbol filogenético al utilizar el método de máxima verosimilitud, evaluado por medio del método Bootstrap con 1000 variaciones (^{Sánchez-López & Pérez-Pazos, 2018}).

Resultados

Aislamiento

De los tubérculos colectados se logró el aislamiento de veintiocho crecimientos fúngicos asociados a las lesiones de la enfermedad de la pudrición seca. La localidad Moñitos fue en donde se obtuvo la mayor cantidad de aislados con dieciséis hongos, seguido por el municipio de Puerto escondido con siete hongos y Los Córdobas con cinco hongos.

Morfotipos

Según la semejanza encontrada en las tipologías morfológicas de los aislamientos caracterizados, se agruparon en once morfotipos, los cuales se describen en el Cuadro 2. Los morfotipos DZC2-1, DZC5-1, DZC7-1, DZC9-1, DZC10-1 y DZC11-1 presentaron variación y cambios morfológicos importantes durante su proceso de crecimiento, los cuales se registraron y describieron.

Cuadro 2 Características de los morfotipos de hongos asociados a la enfermedad de la pudrición seca de los tubérculos de ñame (Dioscorea rotundata), en la zona costanera del departamento de Córdoba en el Caribe colombiano. Laboratorio del Centro de Investigación Turipaná de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA). Colombia, 2019. Table 2. Characteristics of fungal morphotypes associated with dry rot disease of yam (Dioscorea rotundata) tubers in the coastal zone of the department of Cordoba in the Colombian Caribbean. Turipana Research Center Laboratory of the Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA). Colombia, 2019. 

A cada morfotipo encontrado en este experimento, se le realizó un registro fotográfico del crecimiento y de las características morfológicas. Las fotografías se tomaron sietes días después de inoculación (ddi) y se encuentran en las Figuras 2 y 3. Debido a que presentaron variabilidad en sus caracteres morfológicos durante su crecimiento, a los morfotipos DZC2-1, DZC5-1, DZC7-1, DZC9-1, DZC10-1 y DZC11-1, se les realizó un seguimiento fotográfico a los 7, 14 y 21 ddi. Estos se evidencian en las Figuras 4 y 5.

Figura 2 Fotografía de las cajas de Petri en donde se muestran las características macroscópicas de los morfotipos de hongos asociados con la pudrición seca de los tubérculos de ñame (Dioscorea rotundata), cultivados en medio APD®. A) anverso y B) reverso de las colonias a los siete días de incubación. Zona costanera del departamento de Córdoba en el Caribe colombiano. Laboratorio del Centro de Investigación Turipaná de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA). Colombia, 2019. Figure 2. Photograph of the Petri dishes showing the macroscopic characteristics of the fungal morphotypes associated with dry rot disease of yam (Dioscorea rotundata) tubers grown in APD® medium. A) Front and B) reverse of the colonies at seven days of incubation. Coastal zone of the department of Cordoba in the colombian Caribbean. Turipana Research Center Laboratory of the Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA). Colombia, 2019. 

Figura 3 Fotografías de la microscopía (100x) realizada con azul de lactofenol a los once morfotipos de hongos asociados con la pudrición seca de los tubérculos de ñame (Dioscorea rotundata). Zona costanera del departamento de Córdoba en Colombia. Laboratorio del Centro de Investigación Turipaná de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA). Colombia, 2019. Figure 3. Photographs of the microscopy (100x) performed with lactophenol blue at eleven fungal morphotypes associated with dry rot disease of yam (Dioscorea rotundata) tubers in the coastal zone of the department of Cordoba in Colombia. Turipana Research Center Laboratory of the Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA). Colombia, 2019. 

Figura 4 Fotografía de las cajas de Petri de seis de los morfotipos de hongos asociados a la pudrición seca de tubérculos de ñame (Dioscorea rotundata), los cuales muestran cambios morfológicos durante su crecimiento en medio de cultivo APD®. A) Anverso y B) reverso de las colonias. 1) 7 días; 2) 14 días y 3) 21 días. Zona costanera del departamento de Córdoba en el Caribe colombiano. Laboratorio del Centro de Investigación Turipaná de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA). Colombia, 2019. Figure 4. Photograph of the Petri dishes of six of fungal morphotypes associated with dry rot disease of yam (Dioscorea rotundata) tubers, which show morphological changes during their growth in APD® culture medium. A) Front and B) reverse of the colonies. 1) 7 days; 2) 14 days, and 3) 21 days. Coastal zone of the department of Cordoba in the Colombian Caribbean. Turipana Research Center Laboratory of the Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA). Colombia, 2019. 

Figura 5 Fotografías de la microscopía (100x) realizada con azul de lactofenol a los seis morfotipos de hongos asociados a la pudrición seca de los tubérculos de ñame (Dioscorea rotundata), a los que se les realizó un seguimiento morfológico. Zona costanera del departamento de Córdoba en Colombia. Laboratorio del Centro de Investigación Turipaná de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA). Colombia, 2019. Figure 5. Photographs of the microscopy (100x) performed with lactophenol blue to the six fungal morphotypes associated with the dry rot disease of yam (Dioscorea rotundata) tubers that were morphologically monitored. Coastal zone of the department of Cordoba in the colombian Caribbean. Turipana Research Center Laboratory of the Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA). Colombia, 2019. 

Ocurrencia

Los resultados mostraron que los morfotipos DZC3-1 y DZC4-1 presentaron los mayores valores de ocurrencia en los tubérculos de ñame afectados por la pudrición seca en la zona costanera del departamento de Córdoba (Figura 6), mientras que los morfotipos DZC2-1, DZC5-1, DZC8-1, DZC9-1, DZC10-1 y DZC11-1 fueron los que presentaron la menor ocurrencia (Figura 6).

Figura 6 Porcentaje de ocurrencia de los morfotipos de hongos asociados a la pudrición seca de tubérculos de ñame (Dioscorea rotundata), en la zona costanera del departamento de Córdoba en el Caribe colombiano. Laboratorio del Centro de Investigación Turipaná de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA). Colombia, 2019. Figure 6. Occurrence percentage of fungal morphotypes associated with dry rot disease of yam (Dioscorea rotundata) tubers in the coastal zone of the department of Cordoba in the Colombian Caribbean. Turipana Research Center Laboratory of the Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA). Colombia, 2019. 

El morfotipo DZC1-1 no presentó estructuras de reproducción en medio APD®, por lo tanto, para inducir la esporulación se cultivó en caldo de maíz, por lo que se observaron conidias en los extremos de los haustorios (Figura 7).

Figura 7 Fotografías de las características morfológicas del morfotipo DZC1-1 en caldo de maíz. A) anverso de la colonia a los siete días y B) microscopía realizada con azul de lactofenol. Zona costanera del departamento de Córdoba en Colombia. Laboratorio del Centro de Investigación Turipaná de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA). 2019. Figure 7. Photographs of the morphological characteristics of the morphotype DZC1-1 in corn broth. A) Front of the colony at 7 days and B) microscopy performed with lactophenol blue. Coastal zone of the department of Cordoba in Colombia. Turipana Research Center Laboratory of the Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA). 2019. 

Identificación molecular

Los once morfotipos de hongos amplificados para la región ITS, visualizados en gel de agarosa al 2 %, mostraron una banda entre 600 y 750 pares de base (pb) (Figura 8). En esta investigación se utilizaron los marcadores β-tubulina 2 y Calmodulina para complementar la caracterización molecular de los hongos asociados a pudrición seca de los tubérculos de ñame. De las cepas caracterizadas con la región ITS fue posible amplificar el gen de la β-tubulina 2 en cinco hongos y se visualizan en el gel de agarosa 2 % bandas entre los 500 y 700 pb (Figura 8) y para el gen de la Calmodulina se presentaron bandas superiores a 750 pb para un solo hongo en el gel de agarosa al 2 % (Figura 8).

Figura 8 Análisis de electroforesis en gel de agarosa al 2 % de los productos amplificados por PCR de la región ITS y de los genes β-tubulina 2 y Calmodulina, en hongos aislados a partir de la pudrición seca del tubérculo del ñame (Dioscorea rotundata). Los carriles 1 y 13 indican el marcador de ADN. Zona costanera del departamento de Córdoba en Colombia. Laboratorio del Centro de Investigación Turipaná de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA). 2019. Figure 8. Analysis of 2 % agarose gel electrophoresis of the products amplified by PCR of the ITS region and of the β-tubulin 2 and Calmodulin genes, in fungi isolated from the dry rot of yam (Dioscorea rotundata) tuber. Lanes 1 and 13 indicate the DNA marker. Coastal zone of the department of Cordoba in Colombia. Turipana Research Center Laboratory of the Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA). 2019. 

Las secuencias obtenidas para cada morfotipo comparadas con las secuencias referenciadas obtenidas de la base de datos del GenBank del NCBI (National Center for Biotechnology Information), tanto para la región ITS, como para los genes β-tubulina 2 y Calmodulina, se lograron identificar diez especies de hongos que se encontraban asociados con las lesiones de la enfermedad de la pudrición seca de los tubérculos de ñame colectados en la zona costanera del departamento de Córdoba en Colombia. A pesar de que inicialmente se habían clasificado como dos morfotipos diferentes, mediante la caracterización molecular se encontró que DZC2-1 y DZC10-1 pertenecen a la misma especie, pero con características macroscópicas diferentes. Todas las secuencias en el ensayo mostraron un porcentaje de similaridad superior al 97 % (Cuadro 3).

Cuadro 3 Especies de hongos asociadas a la enfermedad pudrición seca de los tubérculos de ñame (Dioscorea rotundata), en la zona costanera del departamento de Córdoba en Colombia. Laboratorio del Centro de Investigación Turipaná de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA). 2019. Table 3. Fungi species associated with dry rot disease of yam (Dioscorea rotundata), tubers in the coastal area of the department of Cordoba in Colombia. Turipana Research Center Laboratory of the Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA). Colombia, 2019. 

Por medio del método de análisis estadístico de máxima verosimilitud, se pudo construir un árbol filogenético en el que se observan ramas consistentes y soportadas al emplear el método de Bootstrap, con 1000 repeticiones. En el análisis se involucraron veinticinco secuencias, de las cuales catorce correspondieron a secuencias referenciadas, obtenidas de la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) y comparadas con las secuencias de los once morfotipos aislados. En el árbol se pueden observar seis clados distribuidos en dos agrupaciones, la primera y más numerosa, conformada por la división Ascomicota y la segunda, menos numerosa, conformada por la división Zigomicota (Figura 9).

Figura 9 Árbol filogenético de las especies de hongos asociados con la pudrición seca de los tubérculos de ñame (Dioscorea rotundata), según las secuencias del gen ITS analizado por el método de máxima verosimilitud. Zona costanera del departamento de Córdoba del Caribe colombiano. Laboratorio del Centro de Investigación Turipaná de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA). Colombia, 2019. Figure 9. Phylogenetic tree of fungal species associated with dry rot of yam (Dioscorea rotundata) tubers according to the sequences of the ITS gene analyzed by the Maximum likelihood method. Coastal zone of the department of Cordoba of the Colombian Caribbean. Turipana Research Center Laboratory of the Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA). Colombia, 2019. 

Discusión

En los tubérculos de ñame con síntomas de pudrición seca se aislaron veintiocho crecimientos fúngicos, los cuales se agruparon en once morfotipos. Mediante la amplificación la región ITS del ADN ribosomal y de los genes β-tubulina 2 y Calmodulina, se lograron identificar diez especies de hongos, pertenecientes a nueve géneros fúngicos. Las especies identificadas fueron: Lasiodiplodia theobromae, Aspergillus piperis, Fusarium solani, Rhizopus oryzae, Penicillium janthinellum, Neocosmospora rubicola, Neoscytalidium dimidiatum, Penicillium citrinum, Curvularia aeria y Trichoderma lixii. La de mayor ocurrencia en este estudio y posiblemente la más importante relacionada con la pudrición seca de los tubérculos de ñame, es Rhizopus oryzae (morfotipo DZC4-1), con un 18 % de ocurrencia en los muestreos realizados en la zona costanera.

Rhizopus oryzae (morfotipo DZC4-1), se reporta en la literatura como patógeno en muchos cultivos, el cual produce enzimas hidrolíticas como amilasas, lipasas, celulasas, proteasas y tannasas (^{Londoño-Hernández et al., 2017}), las cuales tienen gran capacidad enzimática para degradar las paredes celulares de sus hospederos. De igual forma, R. oryzae se ha asociado con la separación celular y maceración de tejido de la papa en almacenamiento (Solanum tuberosum) (^{Amadioha, 2001}). Se encuentran reportes de su aislamiento en una gran variedad de suelos, vegetales, frutas y semillas en descomposición (^{Londoño-Hernández et al., 2017}). Este hongo se caracteriza por su rápido crecimiento, se le conoce como colonizador primario o secundario e invasión de sustratos ricos en azúcares simples (^{Battaglia et al., 2011}).

La especie de hongo Neoscytalidium dimidiatum (Morfotipo DZC7-1), fue encontrada en este estudio con un porcentaje de ocurrencia 10,7 %. En la literatura, se reporta que “este hongo está afectando raíces tuberosas de batata, las cuales mostraban machas oscuras en la superficie, extendiéndose hacia el centro, lo que causó una necrosis interna de color marrón a negro” (^{Mello et al., 2019}). De igual forma, se reporta en otra investigación que está asociado a la pudrición de hojas y tallos en plantas de D. esculenta, donde se aisló e identificó a nivel molecular con el gen β-tubulina 2 (BT2) y el factor de elongación 1-alfa (TEF 1-α), como el hongo N. dimidiatum (^{Lin et al., 2017}).

En este estudio Fusarium solani, correspondiente a los morfotipos DZC2-1 y DZC10-1, presentó un porcentaje de ocurrencia del 7,2 %. Este hongo es un fitopatógeno causante de la pudrición del tubérculo de D. rotundata (^{Ajayi & Olorundare, 2014}; ^{Gwa & Ekefan, 2018}; ^{Rosado, 2016}). F. solani hace parte de un complejo que comprende aproximadamente 60 especies ampliamente reconocidas como fitopatógenos (^{Coleman, 2016}). Este tipo de hongo posee capacidad de infección, con esporas y metabolitos tóxicos, en los cuales se destacan la fitotoxinas y micotoxinas, lo que confirma su patogenicidad (^{Villa-Martínez et al., 2015}). La especie F. solani detallada en este estudio coincide con varios autores (^{Chinchilla, 2017}; ^{Hernández-Trejo et al., 2019}), al presentar una coloración blanca, que cambia a rosa o violeta con el avance de su crecimiento. Esta pigmentación se relaciona con la esporulación del hongo, lo que coincide con lo reportado por ^{Osorio-Gutiérrez & Castaño-Zapata (2011)}.

Otro de los hongos encontrado asociado a la pudrición seca de los tubérculos de ñame fue Neocosmospora rubicola o Morfotipo DZC5-1 en estos estudios. Este hongo ha sido reportado como endófito en raíces de Glycyrrhiza uralensis (^{Kim et al., 2017}) y a su vez, reportado por ^{Zheng et al. (2018)} como el causante de la pudrición del tallo de la pitaya. Sobre este hongo, actualmente, existe una discusión entre algunos autores, que involucran al género Neocosmospora con el género Fusarium, debido a la similitud en cuanto a sus características macroscópicas y microscópicas. ^{Lombard et al. (2015)}, analizaron filogenéticamente algunas especies del género Neocosmospora y debido a ello, este género fue ubicado en el clado IX de la familia Nectriaceae, separándolo de esta forma del complejo F. solani, algunos autores no aceptan esta idea, como ^{Sandoval-Denis y Crous (2019)}, quienes argumentan que aún faltan análisis tanto morfológicos como filogenéticos que ayuden a determinar si el género Neocosmospora hace parte o no del complejo de F. solani. Cabe mencionar, que los resultados morfológicos expuestos en este estudio dificultan la diferenciación entre estas especies, debido a la similaridad en sus características tanto microscópicas como macroscópicas, con un porcentaje de ocurrencia 3,6 %.

El hongo Lasiodiplodia theobromae o morfotipo DZC1-1 presentó en este estudio un porcentaje de ocurrencia 3,6 %; este hongo ha sido asociado por muchos investigadores como un hongo de alta virulencia y patogenicidad sobre los tubérculos de varias especies (^{Ali et al., 2020}; ^{Gwa & Ekefan, 2017}). “Los tubérculos afectados por L. theobromae, muestran podredumbre seca, con tejidos de coloración negra y aspecto pulverulento” (^{Dania et al., 2019}). L. theobromae no solo se ha obtenido en enfermedades en los tubérculos, sino que ha estado relacionado también con la pudrición de frutas (^{Peixinho et al., 2019}). En este estudio al inocular el caldo de maíz se presentaron estructuras con características fitopatógenicas de esta especie, las cuales están relacionadas con procesos parasitarios de este tipo de hongos en plantas de interés económico (^{Salcedo-Morales et al., 2017}). El género Lasiodiplodia, necesita de ambientes específicos para su crecimiento (^{Munirah et al., 2017}), por lo siguiente, en este estudio no esporuló en el medio de cultivo APD®.

La especie Curvularia aeria o morfotipo DZC9-1, presentó un porcentaje de ocurrencia en este estudio del 3,6 %. Del género Curvularia se aislaron e identificaron algunas especies como causantes de la pudrición de tubérculos de ñame en almacenamiento (^{Gwa & Richard, 2018}). El género Curvularia ha sido reportado en enfermedades foliares, en plantas de categoría económica como maíz (^{Rojas et al., 2019}), el arroz (^{De-Pinho et al., 2019}), y el tomate (^{Nayab & Akhtar, 2016}).

De las diez especies de hongos encontradas en estos ensayos, cuatro de ellas podrían descartarse como agentes causales de la pudrición seca de los tubérculos de ñame, debido a que en la literatura se reportan tres de ellas como agente benéfico de biocontrol, y una como agente secundario o saprófito. En el primer caso, las especies Aspergillus piperis, Penicillium citrinum y Trichoderma lixii se reportan en la literatura como especies de hongos que actúan como agentes de bicontrol. Aspergillus piperis que presentó la mayor ocurrencia en este estudio (32 %) es reportado por ^{Jovičić-Petrović et al. (2016)} como “antagonista contra patógenos, cuya acción se realiza mediante la secreción de un complejo de metabolitos como el ácido glucónico, ácido cítrico y derivados del ácido itacónico”.

Penicillium citrinum ha sido reportado en girasol (Helianthus annuus) como un hongo endófito, que protege al cultivo de enfermedades. Este hongo produce metabolitos activos con potencial antifúngico, insecticida y antimicrobiano (^{Waqas et al., 2015}) y como controlador biológico, debido a la producción de janthinell, una toxina que ataca patógenos responsables de la pudrición de la raíz y de la podredumbre del sorgo (Sorghum bicolor) (^{Sreevidya & Gopalakrishnan, 2016}). Trichoderma lixii, aunque ha sido aislado de tubérculos de ñame en etapa de podredumbre (^{Ezeibekwe et al., 2016}), es un género de hongo reportado en la literatura como un agente antagónico, benéfico o biocontrolador (^{Montiel et al., 2016}). Aunque se desconoce la rutina de utilizar biocontroladores por parte de los agricultores de ñame en la zona bajo estudio, es de resaltar que Trichoderma es un género fúngico habitante natural de los suelos, por lo que se cree que este hongo está relacionado con acciones benéficas de control en los cultivos de ñame. Este hongo presentó una ocurrencia de tan solo el 3,6 % en el presente estudio.

El hongo Penicillium janthinellum con una ocurrencia del 7,1 %, ha sido reportado como un hongo saprófito que puede estar asociado en forma secundaria con los tubérculos de ñame (^{Montiel et al., 2016}).

Conclusiones

De los tubérculos de ñame afectados por la pudrición seca, se lograron aislar veintiocho crecimientos fúngicos, los cuales, por sus características macro y microscópicas fueron agrupados en once morfotipos.

Mediante el uso de herramientas moleculares se lograron identificar diez especies, de las cuales se asociaron seis con la enfermedad seca de los tubérculos del ñame en la zona costanera del departamento de Córdoba en Colombia.

Las posibles especies relacionadas con la pudrición seca serían: Lasiodiplodia theobromae, Fusarium solani, Rhizopus oryzae, Neocosmospora rubicola, Neoscytalidium dimidiatum y Curvularia aeria.

Con base en los resultados obtenidos la investigación que continua, es la de realizar pruebas de patogenicidad en tubérculos de ñame, a fin de comprobar su asociación con la enfermedad de la pudrición seca en la zona costanera de Córdoba en el Caribe colombiano y determinar el mejor tratamiento para su control. Se debe realizar también un muestreo al resto del área sembrada de ñame en la región Caribe de Colombia, a fin de corroborar la asociación de estos y otros hongos con la enfermedad.