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Introducción
Dentro del género Vasconcellea A. St. Hil., 1837, de la familia Caricaceae, se encuentra la especie silvestre Vasconcellea candicans (A. Gray) A. DC., 1864, perteneciente a la clase Eudicots, orden Brassicales (Catalogue of Life, 2017), que crece en el ecosistema de lomas de regiones tropicales y subtropicales, y es conocida como “mito” o “papaya andina” en los Andes del Perú. Sus frutos son comestibles y aportan nutrientes como vitaminas (A, C, B1, B2, B6), minerales (calcio, magnesio, potasio) y enzimas digestivas (papaína, lipasa, otras proteasas), entre otros. El interés por su estudio se ha visto renovado debido a su composición de metabolitos secundarios, como compuestos fenólicos, alcaloides, flavonoides, triterpenos y saponinas (Acosta Villalba et al., 2015), que actúan como antioxidantes en las células.
Se ha demostrado que otros géneros de la familia Caricaceae poseen metabolitos secundarios con efectos benéficos para la salud humana y se utilizan contra algunos tipos de cáncer (Nguyen et al., 2013), diabetes (Juárez-Rojop et al., 2012) y obesidad (Athesh et al., 2012). El extracto de Vasconcellea weberbaueri (Harms) V. M. Badillo, evaluado por Culquimboz Serván y Escudero Rodas (2018), mostró un potencial antioxidante, anticolagenasa y antielastasa moderado, al relacionarlo con el contenido de polifenoles totales, mientras que Gutiérrez et al. (2017) indicaron que el látex de V. candicans presenta papaína con trece veces más actividad que la papaya.
Los antioxidantes agrupan diversas moléculas que pueden clasificarse como no proteicos o secundarios (vitamina C, vitamina E, polifenoles, fenoles totales) que actúan después de que el radical se ha formado, y proteicos, que previenen la formación de radicales libres, al proteger a los organismos del daño y la muerte celular. Esto ha motivado la incorporación en la dieta de alimentos que proporcionen de manera natural antioxidantes (Delgado Olivares et al., 2010).
Dentro de los antioxidantes proteicos de los alimentos se encuentran enzimas como la catalasa, que tiene la capacidad de transformar el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno molecular; la glutatión peroxidasa, que reduce el peróxido en agua y los peróxidos orgánicos en alcohol (Carvajal Carvajal, 2019); la superóxido dismutasa, que cataliza la dismutación del superóxido en oxígeno y peróxido de hidrógeno (Riera Romo, 2015); y la glutatión sulfhidril transferasa, que detoxifica las células mediante la formación de conjugados entre compuestos electrofílicos y el glutatión, los cuales son expulsados extracelularmente, por ejemplo, a través de la bilis (Denzoin et al., 2013).
Las aplicaciones del mito como fruto natural nativo del ecosistema de lomas de la costa y la sierra del Perú, la función de sus componentes antioxidantes no enzimáticos y enzimáticos, así como los estudios previos, llevaron a plantear como objetivo de investigación evaluar la actividad de las enzimas antioxidantes catalasa, peroxidasa, superóxido dismutasa y glutatión sulfhidril transferasa de extractos acuosos de pulpa madura e inmadura del fruto de Vasconcellea candicans (A. Gray) A. DC. y relacionarla con su concentración de polifenoles totales.
Materiales y métodos
El estudio se realizó en el Laboratorio de Investigación de Bioquímica y Biología Molecular de la Facultad de Ciencias Naturales y Matemáticas de la Universidad Nacional Federico Villarreal, Lima, Perú, de marzo a diciembre de 2023. Para constituir la población de estudio, se seleccionaron al azar veinte frutos maduros y veinte frutos inmaduros a partir de una población de frutos de V. candicans (mito) provenientes de las lomas de Santo Domingo de los Olleros, provincia de Huarochirí, departamento de Lima (12°13¢13²S, 76°30¢58²O), donde la especie crece de forma natural a 2860 m s. n. m. De esta población, se extrajo al azar una muestra de cuatro frutos maduros y cuatro inmaduros. El estado de madurez se determinó de acuerdo con los criterios propuestos por Schreinert dos Santos et al. (2015) y Watada et al. (1984).
Instrumento y reactivos
Se registraron las características físicas de las muestras biológicas recolectadas (dimensiones del fruto, peso y número de semillas) mediante una balanza analítica con precisión de ±0,0001 g y una cinta métrica. Los extractos acuosos se obtuvieron utilizando una licuadora, una balanza analítica, un agitador orbital y una refrigeradora no frost con capacidad de 541 L. La evaluación de la actividad enzimática se efectuó con un multiparámetro para la preparación de los buffers y un espectrofotómetro UV/visible, en el cual se evaluó la densidad óptica. Para determinar la concentración de polifenoles se empleó un lector de microplacas.
Dentro de los reactivos se utilizaron agua destilada grado molecular (Sigma-Aldrich), DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidracil; Thermo Fisher Scientific®), NaOH (Merck), HCl (Merck), albúmina de suero bovino (BSA; Sigma-Aldrich), fosfato de sodio monobásico (Merck), fosfato de sodio dibásico (Merck), Na2CO3 (Sigma-Aldrich), reactivo de Folin-Ciocalteu (Merck), Trolox 97 % (Thermo Scientific Chemicals), ácido gálico (Sigma-Aldrich), reactivo de Bradford (Sigma-Aldrich), guayacol (Sigma-Aldrich), H2O2 (Sigma-Aldrich), EDTA (Sigma-Aldrich), etanol absoluto (Merck), NaCl (Merck), 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (CDNB; Sigma-Aldrich), nitro azul de tetrazolio (NBT; Sigma-Aldrich), riboflavina (Sigma-Aldrich), L-metionina (Merck), glutatión reducido (Sigma-Aldrich), Tritón X-100 (Merck), Tris-HCl (Sigma-Aldrich), catalasa (Merck), glutatión sulfhidril transferasa (Merck), superóxido dismutasa (Merck) y peroxidasa (Merck). Los materiales incluyeron microplacas estériles de 96 pocillos (SPL®), cubetas de cuarzo de 1 mL, tubos, fiolas, matraces Pyrex y micropipetas. Los resultados de las lecturas de absorbancia se registraron en una tabla en Excel para su procesamiento y posterior análisis en el paquete estadístico R.
Procedimiento
Los frutos correspondientes a la muestra fueron desinfectados con hipoclorito de sodio al 1,5 % durante 5 min. Luego, se enjuagaron con abundante agua del grifo y se realizó un último enjuague con agua destilada estéril. Se determinó el peso, el tamaño y el grado de madurez fisiológica, los cuales se codificaron del 1 al 4 con un subíndice “a” para indicar frutos maduros y “b” para frutos inmaduros. Se consideró inmaduro al fruto en la etapa inicial de la maduración fisiológica, y maduro, al fruto en la etapa de maduración de consumo (Schreinert dos Santos et al., 2015; Watada et al., 1984).
Después de la clasificación, se eliminaron los extremos de cada fruto y se cortaron de forma longitudinal para retirar la cáscara, las semillas y el mucílago. Posteriormente, la pulpa se homogeneizó en una licuadora con agua destilada estéril (20 % p/v) para la cuantificación de polifenoles. Para los análisis de activación enzimática se usaron las siguientes concentraciones amortiguadoras de fosfato de sodio: 0,067 M (pH 7,0) para catalasa, 0,1 M (pH 7,4) para peroxidasa, 50 mM (pH 7,8) para superóxido dismutasa y 0,1 M (pH 6,25) para glutatión sulfhidril transferasa, en proporción 10 % p/v. La extracción se realizó mediante un procedimiento sólido-líquido (Valencia-Pérez et al., 2020).
Para la extracción de la unidad muestral utilizada en los experimentos, se siguió el método de Soib et al. (2020), de manera que se replicaran las condiciones naturales de consumo del fruto, razón por la cual se empleó agua y no otro tipo de solvente. Para ello, se colocaron 20 g de pulpa triturada en un matraz que contenía 80 mL de agua q. p. (relación 20:80, sólido/líquido), el cual se mantuvo en un agitador orbital a 180 rpm durante 180 min a temperatura ambiente. Luego, el matraz se mantuvo en refrigeración a 8 °C por 15 días. Después de ese tiempo, se centrifugó a 5000 g/10 min, se separó el sobrenadante y este se volvió a centrifugar a 10000 g/15 min. El sobrenadante fue separado en dos partes y se almacenó a −20 °C para la evaluación, por triplicado y por cada unidad muestral, de proteínas solubles y polifenoles totales; estos últimos mediante el método colorimétrico descrito por Singleton y Rossi (1965) y Singleton et al. (1999), con adaptaciones.
Para la determinación de proteínas solubles, se utilizó el método de Bradford (1976) partiendo de una curva estándar con albúmina bovina de suero (BSA) a una concentración de 1 mg/mL, la cual se diluyó en una fiola de 10 mL completando con agua para inyección hasta obtener una concentración de 0,1 mg/mL. Con esta solución se construyó la curva de 0; 0,01; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08 y 0,1 mg/mL con la ecuación de la recta y = 3,2001x, de R = 0,992. El cóctel de trabajo fue 10 μL de muestra o de cada estándar, al cual se le agregaron 200 μL del reactivo de Bradford. Las absorbancias se leyeron en el lector de microplaca a 595 nm.
Para la determinación de polifenoles totales (PFT), se preparó un stock de 0,2 g/L de ácido gálico (AG), a partir del cual se utilizaron concentraciones de 1; 2; 3,2; 4; 4,8; 5,6; 6,4 y 8 μg/mL, las cuales se trataron de la misma forma que las muestras. Las absorbancias se leyeron a 750 nm en el lector de microplacas. La curva estándar obtenida presentó la pendiente y = 0,2041x, con un R = 0,9994.
El contenido de polifenoles totales (TPC) se determinó empleando el método colorimétrico según Singleton y Rossi (1965) y Singleton et al. (1999), el cual se adaptó para el lector de microplacas. Los resultados se expresaron como fenoles totales (μg AG/mg TF o μg ácido gálico por miligramo de tejido fresco). Todas las mediciones se realizaron por triplicado. De acuerdo con este método, se utilizó el reactivo de Folin-Ciocalteu (FC) (2N, Sigma-Aldrich), cuyo procedimiento consistió en tomar una alícuota de 20 μL de la solución de extracto madre en un tubo de vidrio, a la que se añadieron 100 μL de FC (1N diluido 1:5). La mezcla se dejó reposar durante 5 min y posteriormente se añadieron 80 μL de Na2CO3 (7,5 %) (PM = 105,99 a 9,5 %, Sigma-Aldrich®). Luego, se agitó y se prosiguió con la reacción en oscuridad por 100 min, tras lo cual se midió la absorbancia a 750 nm en el lector de microplacas.
Para la evaluación de la actividad específica de catalasa, se adaptó la técnica utilizada por Posso Suárez et al. (2020). La pulpa de mito fue homogenizada (1:10 p/v) con tampón fosfato de sodio 0,067 M (pH 7,0), luego se centrifugó a 10 000 g durante 20 min y posteriormente el sobrenadante se separó para la evaluación. La mezcla de reacción contenía 0,5 mL de buffer fosfato de potasio 67 mM (pH 7,0), 60 mM de H2O2 (sustrato) y 100 μL de la muestra. Se incubó a 38 °C durante 4 min, luego se agregó 0,5 mL de molibdato de amonio 32,4 mM y se procedió a la lectura a 405 nm.
Para la curva de calibración se utilizó catalasa (Merck®) a una concentración de 1,3 unidades/mg, frente al H2O2 en concentraciones de 0; 0,25; 0,5; 1,0; 1,5 y 2,0 µmol, siguiendo el mismo protocolo de la muestra. Se construyó la curva estándar según la metodología, que indica la concentración en mM de radicales libres (H2O2) que fueron neutralizados por la enzima catalasa, a una concentración de 1,3 U/mg de proteína, con una ecuación de la recta y = 0,0125x y un R 2 = 0,9979. Con esta curva se calculó la concentración de peróxido capturada por la catalasa de la pulpa de V. candicans, expresada en U/mg de proteína/mg de tejido fresco.
La actividad enzimática de las muestras se determinó según la ecuación 1, donde (H 2 O 2 ) correspondió a la concentración de peróxido de hidrógeno (μmol) y V (mL) al volumen de muestra utilizada. La concentración de la catalasa estándar empleada fue de 1,3 U/mg de proteína.
Para la evaluación de la actividad específica de peroxidasa se acondicionó una cámara a 4 °C. Se tomó 1 g de muestra fresca y se agregaron 10 mL de tampón de fosfato de sodio 0,1 M (pH 7,4) por triplicado. El extracto se centrifugó a 5000 g durante 15 min y el sobrenadante se utilizó como preparación enzimática. El medio de ensayo estuvo constituido por 0,2 mL de tampón de fosfato de sodio 100 mM (pH 6,4), 0,2 mL de guayacol (0,29 mL/100 mL), 0,4 mL de agua destilada y 0,2 mL de preparación enzimática en un volumen total de 1,0 mL.
La reacción se inició agregando 10 μL de H2O2 al 3 % y se registró espectrofotométricamente a 436 nm con un intervalo de 15 s hasta que aumentó la absorbancia. La actividad enzimática se expresó inicialmente como ∆OD min-1·g-1 PF (peso fresco), calculándose la diferencia de absorbancia en un intervalo de tiempo de 1 min, de acuerdo con Pütter (1974), Rai et al. (2016) y Shirsat y Kadam (2015).
Para la curva de calibración se utilizaron concentraciones de H2O2 de 0; 0,25; 0,5; 0,75; 1 y 1,5 µmol con la enzima peroxidasa estándar de 0,25 unidades/mg (Merck). La curva estándar se construyó conforme a la metodología establecida, la cual indica la concentración en mM de radicales libres (H2O2) neutralizados por la enzima peroxidasa que estuvo a una concentración de 0,250 U/mg de proteína. La ecuación obtenida fue y = 0,064x, con un R2 = 0,9961; con ella se calculó la concentración de peróxido capturada por la peroxidasa de la pulpa de V. candicans, expresada en U/mg de proteína/mg de tejido fresco.
La actividad enzimática de las muestras se determinó según la ecuación 2, donde (H2O2) correspondió a la concentración de peróxido de hidrógeno (μmol) y V (mL) al volumen de muestra utilizada. La concentración de la peroxidasa estándar fue de 0,25 U/mg de proteína.
Para la evaluación de la actividad específica de superóxido dismutasa se procedió a la extracción de la enzima usando 5 g de pulpa y 5 mL de buffer fosfato de sodio 50 mM (pH 7,8) por triplicado. La mezcla se centrifugó a 13 520 g durante 30 min a 4 °C. El cóctel de trabajo se modificó a partir del método de Beyer y Fridovich (1987) y Martínez-Damián et al. (2013), quienes determinaron la actividad total del superóxido dismutasa evaluando la fotorreducción de la inhibición del nitroblue de tetrazolio.
La mezcla de reacción contenía 27,0 mL de buffer fosfato de potasio 50 mM (pH 7,8), 0,1 mM de EDTA, 1,5 mL de L-metionina (30 mg/mL), 0,75 mL de Tritón X-100 al 1 % y 1,0 mL de nitroblue de tetrazolio (1,41 mg/mL). En oscuridad, se preparó el cóctel de trabajo, el cual estuvo constituido por 3,0 mL de la mezcla anterior, 10 μL de riboflavina (4 mg/mL) y 133 μL de la muestra. Inmediatamente, la absorbancia se midió a 560 nm (tiempo cero). Luego, la muestra se irradió con tubos fluorescentes de 15 W durante 7 min, tras lo cual se volvió a medir la absorbancia (tiempo final). Para el blanco se procedió de la misma forma que para la muestra, reemplazando esta por agua destilada. Se realizaron tres repeticiones por muestra.
Se preparó una curva de calibración con la enzima superóxido dismutasa (Merck®), utilizando concentraciones de 0; 0,6; 0,9; 1,5 y 3 unidades/mg. La curva estándar indicó el porcentaje de inhibición de la enzima superóxido dismutasa a partir de una concentración de 6 unidades/mL. La ecuación obtenida fue y = 12,43x con un R 2 = 0,9946. Para esta enzima se definió la unidad como U/mg de proteína/mg de tejido fresco, correspondiente a la velocidad de reducción de hasta 50 % de inhibición de un sistema acoplado de L-metionina y NTB en presencia de riboflavina a pH 7,8 y temperatura ambiente (20-25 °C), en un volumen de reacción de 3,0 mL.
Para evaluar la actividad específica de glutatión sulfhidril transferasa, las muestras se homogenizaron por triplicado utilizando una relación de 1:1 (p/v) con un buffer fosfato de K a 0,1 M (pH 6,25) y se centrifugaron a 14 000 g durante 20 min a 4°C. La actividad de la glutatión sulfhidril transferasa se determinó teniendo como sustratos al glutatión (GSH) y al 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (CDNB). Para los cálculos se empleó el coeficiente de extinción (ε340) = 9,6 mM-1·cm-1 (Habig & Jakoby, 1981).
En una cubeta de 1,5 mL se colocaron 1,2 mL de buffer fosfato de sodio 0,1 M (pH 6,25), que contenía GSH 30 mM y CDNB 0,75 mM. La mezcla se incubó a 30 °C durante 1 min; posteriormente, se añadieron 100 µL de muestra y se realizó la lectura en el espectrofotómetro a 340 nm en el tiempo 0 min y a los 5 min (adaptado de Wyrwicka y Urbaniak, 2016). Para esta enzima, la unidad se definió como los mM de glutatión y CDNB transformados por minuto/mg de proteínas/mg de tejido húmedo, a pH 6,25, en un volumen de reacción de 1,3 mL.
Resultados
Características físicas de los frutos
En general, V. candicans presentó frutos elipsoides, rugosos, con cinco canales y cáscara color verde. Las características de la pulpa mostraron diferencias entre los frutos maduros e inmaduros, con una coloración blanca-amarillenta muy clara en los inmaduros y una consistencia más cremosa en los maduros. Estos últimos presentaron un aroma agradable e intenso, el cual se pierde durante la senescencia del fruto. La caracterización de los frutos de mito se describe en el Cuadro 1.
Cuadro 1 Características físicas de los frutos de Vasconcellea candicans (mito) utilizados como muestra de investigación. Santo Domingo de Los Olleros, Lima, Perú. 2023.
| Frutos de mito | Código | Peso (kg) | Longitud (m) | Diámetro (m) | Peso de la pulpa (kg) | Peso de la cáscara (kg) | Número de semillas |
| Maduro | 1a | 0,226 | 0.015 | 0,015 | 0,0851 | 0,03468 | 180 |
| 2a | 0,196 | 0,015 | 0,013 | 0,0622 | 0,02402 | 169 | |
| 3a | 0,229 | 0,016 | 0,017 | 0,0906 | 0,04663 | 160 | |
| 4a | 0,409 | 0,018 | 0,022 | 0,1704 | 0,14663 | 146 | |
| Inmaduro | 1b | 0,235 | 0,016 | 0,018 | 0,0914 | 0,07520 | 173 |
| 2b | 0,230 | 0,015 | 0,018 | 0,08446 | 0,0649 | 168 | |
| 3b | 0,350 | 0,018 | 0,022 | 0,14019 | 0,14729 | 132 | |
| 4b | 0,253 | 0,017 | 0,019 | 0,09417 | 0,08477 | 168 |
Las características de los frutos de mito no mostraron diferencias en cuanto a peso, longitud, diámetro, peso de la pulpa y número de semillas. Sin embargo, sí se observaron diferencias en el peso de la cáscara. / The characteristics of the mito fruits did not show differences in weight, length, diameter, pulp weight, or number of seeds. However, differences were observed in peel weight.
Proteínas
Los frutos inmaduros de mito presentaron mayor cantidad de proteínas (0,020 µg/mL en promedio) que los maduros (0,012 µg/mL en promedio), con una diferencia estadística igual a p > 0,05. Los datos obtenidos siguieron una distribución normal según la prueba Shapiro-Wilk.
Polifenoles (fenoles totales)
Los datos de polifenoles totales de la pulpa de V. candicans siguieron una distribución normal (Shapiro-Wilk), sin diferencias significativas (p > 0,05) entre los frutos maduros e inmaduros. Las pulpas de mito maduras contenían en promedio 0,179 y las inmaduras 0,187 de fenoles totales, equivalentes a µg de ácido gálico/mg de tejido fresco.
Evaluación de las enzimas antioxidantes de la pulpa de V. candicans
Los valores promedio de la actividad antioxidante de la enzima catalasa en la pulpa de los frutos maduros e inmaduros de mito, expresados como mM de H2O2 neutralizados por la enzima/min/mg de proteína/mg de tejido fresco (TF), fueron de 6,7882 mM/mg de proteína/mg de TF en los frutos maduros y de 3,6937 mM/mg de proteína/mg de TF en los inmaduros, observándose una diferencia significativa (p < 0,01).
Los datos normalizados indicaron que la enzima peroxidasa de las pulpas de los frutos de mito inmaduros capturó una concentración de H2O2 de 0,507 mM/min/mg de proteína/mg de TF y que las pulpas maduras capturaron 0,706 mM/min/mg de proteína/mg de TF, sin observarse diferencias estadísticas significativas (p < 0,05) entre ellas.
Los resultados del promedio de la actividad de la enzima superóxido dismutasa fueron de 17,93 ± 0,36 mU/mg de proteína/mg de TF para la pulpa madura y de 8,53 ± 0,22 mU/mg de proteína/mg de TF para la pulpa inmadura. Estos valores mostraron diferencias significativas (p < 0,05) entre las pulpas maduras y las inmaduras.
Los valores de actividad de la enzima glutatión sulfhidril transferasa de la pulpa de V. candicans fueron en promedio 0,032 U/mg de proteína/mg de TF para pulpas maduras de mito y 0,057 U/mg de proteína/mg de TF para pulpas inmaduras de mito. El análisis de varianza de Kruskal-Wallis para datos no normalizados presentaron diferencias significativas entre ambos grupos (p < 0,05).
En las pulpas maduras de mito, el análisis de correlación de Pearson mostró que la enzima catalasa presentó una relación lineal negativa fuerte para peroxidasa (α = 0,05; r = −0,702) para polifenoles totales (α = 0,01; r = −0,735) y para proteínas (α = 0,01; r = −0,983). La enzima superóxido dismutasa no mostró correlación con ninguno de los parámetros estudiados.
Se observó una relación lineal positiva fuerte entre la enzima peroxidasa y las proteínas (α = 0,01; r = 0,711), mientras que los polifenoles mostraron una relación lineal fuerte con las proteínas (α = 0,01; r = 0,745). La enzima glutatión sulfhidril transferasa presentó una relación lineal negativa con los polifenoles totales, según el coeficiente de Spearman Rho (α = 0,05; r = −0,595).
Al correlacionar los datos de las enzimas con los polifenoles y las proteínas de la pulpa de los frutos inmaduros, se observó que no existió una correlación entre ellos, tanto para los datos normalizados (Pearson) como para los no normalizados (Spearman Rho).
Discusión
Los frutos de V. candicans de Santo Domingo de Los Olleros presentaron diferencias en el número de semilla y longitud (n.o promedio de semillas = 160; longitud = 15-18 cm) en comparación con los frutos de San Pedro de Casta, Lima, Perú (n.o promedio de semillas = 140; longitud = 10-15 cm), reportados por Belli Obando (2018). Estas diferencias podrían explicarse debido a que el mito se distribuye en diversas zonas geográficas del Perú, como la zona costera (Lomas de Lúcumo), los bosques nublados secos (Bosque de Zárate), la serranía esteparia (San Pedro de Casta) y la sierra alta de la región central (Santo Domingo de Los Olleros) (Cuya Matos, 1992), lo cual habría generado adaptaciones específicas en respuesta al estrés ambiental (Omaiye Ojonubah & Hafiz Mohd, 2020; Pastori & Foyer, 2002; Rejeb et al., 2014; Rowe et al., 2015). Las interrelaciones de diversos factores abióticos con factores bióticos habrían permitido activar vías inespecíficas en estas plantas, que produjeron distintos fenotipos, reflejados en diferencias en el desarrollo, el crecimiento y los mecanismos de defensa (Bostock, 2005).
Estudios sobre proteínas del fruto de Vasconcellea pubescens (papayita chilena) reportaron valores de 5,35 ± 0,78 g/100 g de TF (Zura et al., 2013), 0,9 g/100 g de TF (Uribe et al., 2015) y 1,86 g/100 g de TF (Vega-Gálvez et al., 2019). En pulpa de los frutos de V. candicans se obtuvieron valores de 2,04 g/100 g de TF en frutos inmaduros y 1,17 g/100 g de TF en maduros. Este mayor valor en los frutos inmaduros podría deberse a que estos requieren una mayor cantidad de proteínas para alcanzar su estado de maduración (Park et al., 2006), proceso que involucra cambios bioquímicos y fisiológicos como la síntesis de etileno, la degradación de clorofila, la degradación de la pared celular y la acumulación de ácidos orgánicos y volátiles.
La variación en la cantidad de proteínas durante el proceso de maduración no solo permitiría cambios en la textura, el aroma y el sabor del fruto (Song y Bangerth, 1996), sino que además explicaría los cambios en la composición de estas proteínas según el estado de madurez fisiológico (Shi, Jiang et al., 2014), de acuerdo con la especie y el medio en el que se desarrolla.
En V. candicans se registraron valores de 17,9 mg eq de AG/100 g de pulpa madura y 18,7 mg eq de AG/100 g de pulpa inmadura. Para V. × heilbornii, Auquiñivin Silva y Paucar Menacho (2020) y Uribe et al. (2015) reportaron 46 ± 2 mg eq de AG/100 g y 28,6 mg eq de AG/100 g, respectivamente. Correa Tejada (2020) encontró 15,06 ± 1,48 mg eq de AG/100 g en Vasconcellea weberbaueri, mientras que Culquimboz Serván y Escudero Rodas (2018) informaron 735,5 mg eq de AG/100 g. No obstante, estos estudios no especificaron el estado de madurez fisiológico de los frutos evaluados, lo que dificulta una comparación directa con los resultados del presente estudio.
La variabilidad observada sugiere que los fenoles totales y la capacidad antioxidante podrían activarse en respuesta a factores abióticos y bióticos, como fue descrito por Orabi et al. (2014). La disminución de estos compuestos podría presentarse en etapas con menor actividad antioxidante, según Da Silva et al. (2013). Las investigaciones sobre el sistema antioxidante y el estrés oxidativo durante la maduración de frutos se han concentrado principalmente en especies de alto valor comercial como mango (Singh y Dwivedi, 2008), duraznos (Camejo et al., 2010) y papaya (Oliveira Resende et al., 2012). Los estudios en frutas tropicales y especies nativas siguen siendo escasos, en especial aquellos que consideran de forma explícita el estado de madurez fisiológica.
Al relacionar polifenoles con proteínas, se observó que, en los frutos de V. candicans en estado de maduración comestible, tanto las proteínas como los polifenoles disminuyeron (proteínas 1,17 g/100 g de TF; polifenoles 0,179 μg AG/g de TF), mientras que en los frutos inmaduros estos metabolitos presentaron valores mayores (proteínas 2,04 g/100 g de TF; polifenoles 0,187 μg AG/g de TF). Lo anterior se explicaría por cambios en la actividad de enzimas de vías metabólicas que inducirían la degradación de proteínas y el posterior uso de los aminoácidos resultantes en la síntesis de compuestos volátiles (D’Ambrosio et al., 2013), los cuales influyen en el aroma de frutos y flores (Winterhalter & Schreier, 1994), y aumentan durante la maduración de los frutos, como se ha observado en durazno (Aubert et al., 2003). Esto permitiría explicar, al menos en parte, la disminución en la síntesis de proteínas y el incremento de aroma y sabor de la pulpa durante la maduración.
La actividad enzimática de la catalasa en frutos de C. papaya, según Pandey et al. (2012), fue mayor en frutos maduros (4,56 ± 0,47 U/g de pulpa) que en inmaduros (1,22 ± 0,08 U/g de pulpa); esta misma tendencia se encontró entre los frutos maduros e inmaduros de V. candicans con diferencia significativa (p < 0,01). A pesar de que la afinidad de catalasa por el H2O2 es baja en comparación con la de las peroxidasas, en los frutos maduros de papaya y mito su actividad fue mayor, probablemente porque la producción de H2O2 fue alta (Switala & Loewen, 2002). Esto sugiere que, durante el desarrollo de las características sensoriales, la actividad de catalasa aumentaría para mantener el equilibrio del sistema redox celular (Baquero Duarte et al., 2005; Kumar et al., 2016; Song et al., 2020), y prevenir el estrés oxidativo en las células (Hanif et al., 2020), sin requerir el uso de otros reductores.
La actividad enzimática de peroxidasa en papaya, según Pandey et al. (2012, 2013), presentó diferencias significativas entre el fruto maduro (0,40 ± 0,07 nmol/g pulpa) y el inmaduro (0,86 ± 0,06 nmol/g pulpa), mientras que en mito se encontraron diferencias no significativas, lo cual indicaría que la peroxidasa tiene un papel importante en el control de las especies reactivas de oxígeno (ROS) durante su maduración (Oliveira Resende et al., 2012). Otra diferencia con papaya puede deberse a que el mito crece a una altitud superior a 2500 m y la papaya crece entre 0 y 1200 m s. n. m., por lo que se plantea la hipótesis de que los frutos de mito están sometidos a un mayor estrés natural (concentración de gases, temperatura, presión, etc.) que generaría una mayor actividad de enzimas como catalasa y peroxidasa, necesarias para su función de defensa y para otras funciones fisiológicas (Martínez-González et al., 2017; Pandey et al., 2017).
La actividad de la enzima superóxido dismutasa durante el proceso de maduración de V. candicans mostró diferencias significativas entre los frutos maduros (0,0172 U/mg proteína/mg de TF) y los inmaduros (0,0080 U/mg proteína/mg de TF), lo cual se podría explicar por una mayor cantidad de ROS (O2.-, OH y H2O2) en los frutos maduros de mito, producto del estrés ambiental y del metabolismo oxidativo que deben soportar para mantener el equilibrio redox (Foyer et al., 2020; Jarisarapurin et al., 2019; Lv et al., 2020; Wu et al., 2025). De lo contrario, los ROS podrían acumularse produciendo toxicidad y daño celular irreversible en los tejidos (Masia, 1998). Este mismo comportamiento se encontró en tomates (Mondal et al., 2004) y melocotones (Camejo et al., 2010). Sin embargo, otros estudios demuestran que la actividad de las enzimas antioxidantes durante la maduración varía según la fruta, como en el caso de la actividad de la superóxido dismutasa, que disminuye en naranjas, mangos (Singh & Dwivedi, 2008) y guayabas (Mondal et al., 2004).
La actividad de la enzima glutatión sulfhidril transferasa (GST) del mito fue mayor en frutos inmaduros (0,057 U/mg de proteína/mg de TF) que en frutos maduros (0,032 U/mg de proteína/mg de TF), aunque sin diferencias estadísticamente significativas (p > 0,05). Este comportamiento sugiere que la enzima podría desempeñar una función similar a la de las peroxidasas (Board et al., 2000; Dixon et al., 2002; Edwards et al., 2000; Wagner et al., 2002), al contribuir a la reducción de especies reactivas de oxígeno (ROS) mediante mecanismos catalíticos y no catalíticos (Nianiou-Obeidat et al., 2017). Esta función se sustenta en su capacidad de interacción tanto con glutatión como con tiorredoxina (Ozyigit et al., 2016; Passaia y Margis-Pinheiro, 2015), lo que permitiría prevenir procesos de daño celular y muerte celular programada (Dixon et al., 1998; Dixon et al., 2010; Schröder et al., 2007; Wagner et al., 2002).
Diversos estudios han señalado que la actividad de las GST puede incrementarse durante el inicio de la senescencia. En este sentido, Shi, Li et al. (2014) reportaron un aumento de la isoenzima tau (SIGST) en hojas senescentes de Hordeum vulgare L., inducida por bajas temperaturas. Estos hallazgos sugieren la participación de esta enzima en procesos asociados al metabolismo secundario y a la regulación de la senescencia vegetal (Frear & Swanson, 1970; Kunieda et al., 2005; Lamoureux et al., 1970).
En el presente trabajo se encontró que la actividad de catalasa y superóxido dismutasa fue mayor en los frutos maduros (fisiológicamente comestibles), lo que indicaría un incremento de los mecanismos de defensa frente a radicales libres (Das & Roychoudhury, 2014; Gill et al., 2015). Los polifenoles totales, en cambio, se mantuvieron sin diferencias significativas entre la madurez fisiológica y la madurez de consumo. La actividad de la peroxidasa fue mayor en frutos maduros, sin diferencias estadísticas respecto a los frutos inmaduros, lo cual sugiere que debe estar oxidando principalmente compuestos fenólicos y produciendo radicales fenoxilos, donde el H2O2 participaría como aceptor de electrones y se convertiría en dos moléculas de H2O (Martínez-Rubio et al., 2018). En contraste, la glutatión sulfhidril transferasa presentó mayor actividad en frutos inmaduros, lo que indicaría su participación en la protección contra el estrés oxidativo durante las primeras fases de la maduración del fruto (Nianiou-Obeidat et al., 2017), trabajando como una peroxidasa.
Una de las hipótesis que se planteó para los frutos inmaduros de mito es que hay mayor peroxidación de ácidos grasos insaturados por estrés oxidativo (Dixon et al., 2002; Dixon & Edwards, 2010), que podría deberse a la altitud donde crece el mito, por lo que la glutatión sulfhidril transferasa debe detoxificar los productos tóxicos derivados de ello, además de transportar metabolitos como la vitamina C y otros. Diversos estudios se han orientado a evaluar la síntesis de la glutatión sulfhidril transferasa en frutos de papaya y otros, como el estudio de Nakamura et al. (2000), quienes usaron papaya inmadura y aguacate para activar la producción de glutatión sulfhidril transferasa y de esa forma contribuir a la protección de la salud humana. Para profundizar en el estudio del proceso de maduración, podrían utilizarse microARN, analizados con qRT-PCR, con el fin de validar el contraste de patrones de expresión entre ARNm y sus genes dianas, así como otras técnicas de la proteómica para observar la expresión y el comportamiento de isoenzimas de catalasa, superóxido dismutasa, peroxidasa y glutatión sulfhidril transferasa presentes en los frutos durante la maduración (Bi et al., 2015; Reyes Soria, 2021).
La maduración del fruto implica la activación coordinada de diversas rutas bioquímicas que modifican sus características sensoriales y funcionales, razón por la cual este proceso ha sido ampliamente estudiado. La extracción acuosa de los compuestos bioactivos presentes en la pulpa reproduce condiciones similares a las empleadas en la preparación de infusiones (Gallé et al., 2009), en las que se ha demostrado que la actividad antioxidante se incrementa cuando distintos compuestos fenólicos actúan de manera conjunta con otros metabolitos (Larson, 1988). Los resultados obtenidos indican que V. candicans posee en su pulpa un sistema antioxidante complejo, cuya actividad varía según el estado de madurez. Este comportamiento resalta su potencial funcional y justifica la necesidad de profundizar en su estudio para orientar estrategias de conservación de especies nativas.
Conclusiones
La evaluación de la actividad de las enzimas antioxidantes en extractos acuosos de pulpa madura e inmadura del fruto de Vasconcellea candicans permitió determinar que, en los frutos maduros, la catalasa presentó una correlación negativa con los polifenoles (r = −0,702); la glutatión sulfhidril transferasa mostró una correlación débil (r = −0,595), y la superóxido dismutasa y la peroxidasa no presentaron correlación. La diferencia del estado de madurez de estos frutos podría evaluarse mediante el seguimiento de la actividad de la catalasa y la concentración de polifenoles desde la madurez fisiológica hasta la senescencia, con el fin de estimar el tiempo de vida útil del fruto.
