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Acta Pediátrica Costarricense

Print version ISSN 1409-0090

Acta pediátr. costarric vol.13 n.2 San José Apr. 1999

 

Métodos moleculares para el desarrollo de vacunas
 
 
Fernando García (*)
 
 
La utilización de vacunas para el control de las enfermedades infecciosas ha tenido un gran éxito para modificar los patrones de incidencia y mortalidad de la viruela, polio, sarampión, rubeola, tuberculosis, tos ferina, difteria, entre otras, y han tenido un mayor impacto en salud pública que el tratamiento curativo con antimicrobianos de las enfermedades infecciosas. En este contexto, es esencial para el profesional en ciencias médicas el conocer los principios que han llevado al desarrollo de las diferentes vacunas de uso actual en nuestra región, así como las modernas estrategias que se siguen en la creación de nuevas vacunas. El objetivo de esta presentación es brindar una revisión general y concisa sobre las técnicas clásicas y moleculares para el desarrollo de vacunas, considerando particularmente las vacunas activas (inmunización con antígenos), incluyendo vacunas vivas, vacunas no-vivas y vacunas de ADN. Por limitaciones de espacio, no se consideran los anticuerpos anti-idiotipos, la terapia genética ni la inmunoterapia para la prevención de enfermedades infecciosas.
 
 
Vacunas vivas

Una vacuna viva consiste de un microorganismo que se puede replicar por sí mismo en el individuo o que puede infectar células y actúa como un inmunógeno sin causar la enfermedad natural. Las vacunas vivas usualmente producen tanto inmunidad humoral como celular. Algunas vacunas vivas se acercan al concepto de una vacuna ideal, por cuanto pueden producir una protección duradera con pocos efectos secundarios usando una o dos dosis. La vacuna viva es atenuada, lo cual significa que su capacidad de causar enfermedad ha sido virtualmente eliminada en aquellos individuos inmunocompentes para quienes la vacuna ha sido diseñada. Un aspecto importante a considerar es que los microoganismos atenuados pueden ser transmitidos a otros individuos no vacunados e incluso a individuos con algún tipo de compromiso inmunológico, en quienes eventualmente pueden causar enfermedad.

Aunque estas propiedades de las vacunas vivas hacen parecer deseable que todas las vacunas sean de este tipo, esto no es técnicamente posible para la mayoría de las vacunas que se desarrollan actualmente. Particularmente, existen dos problemas fundamentales en la atenuación de microorganismos. La primera dificultad radica en el mecanismo de atenuación del microorganismo, es decir, como hacerle perder su patogenicidad, sin que pierda las capacidades de multiplicarse en el hospedero y de producir una respuesta inmune apropiada. La segunda dificultad consiste en cómo lograr la estabilidad de la atenuación, debido a que los microorganismos mantienen su capacidad de multiplicación y pueden eventualmente revertir a la forma virulenta.
 

Técnicas clásicas de atenuación

Las técnicas clásicas de atenuación son aquellas que no utilizan la metodología del ADN recombinante. Existen cuatro técnicas de atenuación de agentes virales. La primera técnica consiste en la atenuación mediante pasajes seriados en cultivos de células para seleccionar las variantes menos virulentas. Aunque no se conocen con exactitud los mecanismos por los cuales se introducen las mutaciones durante la replicación viral, empíricamente se ha logrado obtener una serie de vacunas virales atenuadas con demostrada eficacia, incluyendo las vacunas para polio, paperas, sarampión, rubeóla y varicela (2, 10, 31, 38, 42). Una segunda técnica consiste en utilizar virus homólogos causantes de enfermedades veterinarias similares a las observadas en seres humanos. Se asume que el virus animal estará naturalmente atenuado para el ser humano pero estará inmunológicamente relacionado, de manera suficiente, con el virus humano de forma que producirá una respuesta inmunológica apropiada. Tal es el caso del virus vaccinia, de origen bovino, el cual fue utilizado exitosamente para la erradicación de la viruela (18). Otros virus que están siendo actualmente analizados en estudios clínicos mediante esta estrategia son los rotavirus (3). La tercera técnica consiste en generar virus con un genoma reordenado derivado de una coinfección de dos virus diferentes en un cultivo celular. El virus resultante contiene en su genoma segmentos de los dos virus paternales. Esta técnica se ha utilizado en rotavirus de origen animal, los cuales mantienen la mayor parte de su genoma así como un gen de rotavirus humano que codifica para una proteína de superficie, la cual genera anticuerpos neutralizantes serotipo-específicos para el rotavirus humano (4, 36). Esta estrategia también se ha utilizado para generar variantes de virus influenza atenuados conteniendo genes de virus influenza virulento (26). Ambos casos están actualmente bajo evaluación en estudios clínicos. La cuarta técnica consiste en obtener mutantes virales que son incapaces de crecer a temperaturas superiores a 37°C (temperature-sensitive, ts) o que pueden crecer a temperaturas más bajas [p. ej. 25°C] (cold-adapted, ca). Se asume que los virus ts o ca son menos vigorosos en su crecimiento y, por lo tanto, atenuados. Por ejemplo, una vacuna influenza ts ha sido utilizada ampliamente en Rusia (13) mientras que una vacuna del virus respiratorio sincicial conteniendo dos diferentes mutaciones ts ha sido probada en estudios clínicos (27).

Existen dos ejemplos clásicos de vacunas bacterianas atenuadas. La primera de ellas es la cepa de Mycobacterium bovis atenuada, conocida como bacilo de Calmette-Guérin (BCG), la cual fue atenuada mediante 231 pasajes sucesivos por subcultivo durante un período de 13 años (17). Actualmente existen muchas cepas de BCG disponibles mundialmente, todas ellas derivadas de la cepa original. Las diversas vacunas BCG varían en términos de tolerabilidad, inmunogenicidad y la eficacia de protección (0 a 80% de protección). La otra es la cepa Salmonella typhi Ty2la, la cual fue atenuada mediante mutagénesis química y posterior selección por su baja virulencia. Esta vacuna ha sido utilizada para la prevención de la fiebre tifoidea con una eficacia de protección de 60-70% con un regímen de tres o cuatro dosis (12).
 

Técnicas recombinantes de atenuación

Las técnicas de ADN recombinante pueden ser aplicadas en diferentes procesos durante el desarrollo de vacunas: La primera aplicación de estas técnicas consiste en manipular el material genético de los microorganismos para introducir mutaciones y aumentar así la estabilidad de la atenuación, de manera que la probabilidad de una reversión sea nula o muy baja. Estas mutaciones en bacterias son generalmente inserciones de transposones (Tn) o deleciones () que inactivan o remueven porciones de genes, respectivamente, involucrados en procesos metabólicos o que codifican para factores de virulencia. Por ejemplo, las mutaciones aroA, asd o cya::Tn10, individualmente o en combinación, disminuyen la virulencia de algunos grupos de Enterobacteriaceae, como Salmonella o Shigella, sin afectar la producción de inmunógenos (7).

La segunda técnica consiste en construir microorganismos recombinantes utilizados como vectores para la expresión de inmunógenos (proteínas o péptidos heterólogos) derivados de otros microorganismos. El virus vaccinia ha sido utilizado como vector para expresar proteínas provenientes de otros virus, incluyendo, por ejemplo, la glicoproteína principal (gp120) del virus de inmunodeficiencia humana 1 (HIV-1) (30) Este tipo de vacuna, basada en el virus vaccinia o en otros virus como adenovirus, polio y varicella-zoster, se encuentra actualmente en evaluación preclínica o clínica. Asímismo, cepas atenuadas de Salmonella typhi, Shigella flexneri, Vibrio cholerae, Listeria monocytogenes e incluso BCG son utilizadas como vectores recombinantes para expresar polipéptidos de origen bacteriano o viral (1, 15, 29, 40).
 
 
Vacunas no-vivas

Las vacunas no-vivas se caracterizan por su incapacidad de multiplicarse en el individuo o en células y, por lo tanto, no pueden revertir -en el caso de microorganismos- su patogenicidad, tienen menos efectos adversos en el individuo, no se transmiten de persona a persona y, por lo general, son técnicamente más factibles. Las vacunas no-vivas pueden consistir de microorganismos enteros (bacterias o virus) que han sido inactivados para hacerlos no-viables, o de componentes celulares purificados o producidos mediante técnicas de ADN recombinante. En ciertos casos, estos componentes son asociados a otros para aumentar su inmunogenicidad.
 

Microorganismos inactivados

La utilización de microorganismos completos inactivados químicamente o por calor pretende generar una respuesta inmune humoral contra muchos componentes, de manera que algunos anticuerpos logren neutralizar el patógeno. Así, las bacterias son cultivadas en grandes cantidades, recolectadas y posteriormente inactivadas por calor o mediante el uso de sustancias químicas como fenol o timerosal. Debido a que este tipo de vacunas son preparaciones muy crudas, se pueden observar muchos efectos adversos cuando se aplican parenteralmente, aunque algunas son bien toleradas por ruta oral. Algunas vacunas preparadas de esta manera incluyen el componente pertussis de la DPT y vacunas de Vibrio cholerae y de cepas enterotoxigénicas de Escherichia coli (5, 9, 41).

Los virus cultivados en células son recolectados de los sobrenadantes y purificados mediante técnicas sencillas de precipitación y cromatografía. Tal procedimiento se sigue para los virus polio, influenza y rabia, por ejemplo (6, 28, 32). En el caso del virus de la hepatitis A, las células son lisadas y las partículas virales son posteriormente purificadas (33). Las partículas virales son luego químicamente inactivadas, usualmente con fenol, y se les añade una sal de aluminio como adyuvante.
 

Componentes purificados: proteínas, péptidos y polisacáridos

El desarrollo de una vacuna basada en componentes purificados, particularmente proteínas y péptidos, es la estrategia de escogencia para muchos patógenos microbianos. Esta estrategia consiste en identificar epitopos protectores y sus correspondientes proteínas, las cuales son entonces purificadas, en muchos casos inactivadas y posteriormente utilizadas como inmunógenos. Alternativamente, con base a la disponibilidad de secuencias de genomas microbianos, es posible deducir la secuencia de aminoácidos de proteínas e identificar aquellas que estén localizadas en la superficie del microorganismo o que tengan algún posible efecto tóxico en células o en individuos. Los correspondientes genes pueden ser expresados en microorganismos (típicamente Escherichia coli) y las proteínas purificadas y analizadas por sus propiedades inmunogénicas. Igualmente se pueden identificar péptidos inmunogénicos, los cuales pueden ser sintetizados in vitro y posteriormente utilizados en vacunas.

La primera vacuna contra el virus de la hepatitis B (HBV) utilizaba el antígeno de superficie (HBsAg) purificado a partir de plasma obtenido de pacientes portadores crónicos del virus. Una vez purificado, la preparación era inactivada químicamente para matar el HBV o cualquier otro virus humano presente (19). Las proteínas bacterianas, principalmente toxinas como pertussis, tetánica y diftérica, pueden ser purificadas a partir de cultivos e inactivadas mediante tratamiento con sustancias químicas como formalina o glutaraldehído para producir los toxoides PT, TT y DT, respectivamente (20, 34) PT, combinada con otros antígenos pertussis naturales constituyen las vacunas pertussis acelulares (Pac) (8). Alternativamente a la inactivación química, las proteínas pueden ser inactivadas genéticamente mediante la introducción de mutaciones en sitios específicos en sus correspondientes genes, de manera que se bloquea irreversiblemente la actividad enzimática de las toxinas sin alterar significativamente su estructura tridimensional, manteniendo así sus propiedades inmunogénicas. Por ejemplo, se ha generado un toxoide diftérico que contiene una sustitución de un solo aminoácido en su cadena polipeptídica, la cual provoca la pérdida de la actividad de ADP-ribosiltransferasa (14). Este toxoide genético, denominado CRM197, también se utiliza para conjugar el polisacárido de Haemophilus influenzae tipo b.

Muchas bacterias están recubiertas por una cápsula de polisacáridos. En la mayoría de los casos, anticuerpos dirigidos contra estos polisacáridos capsulares son protectores contra la infección bacteriana. Los polisacáridos capsulares están formados hasta por cientos de unidades repetitivas que difieren según la especie bacteriana y los grupos antigénicos (serotipos). Las unidades repetitivas están constituidas por monosacáridos, grupos fosfatos y otras moléculas orgánicas. Estos polisacáridos han sido utilizados como inmunógenos en los casos de Haemophilus influenzae tipo b (Hib), Neisseria meningitidis (4 serotipos) y Streptococcus pneumoniae (23 serotipos) (16, 21, 37). La principal desventaja de estas vacunas es que los polisacáridos, siendo antígenos T-independientes, son poco inmunogénicos en niños menores de 2 años debido a su sistema inmunológico inmaduro, además que no producen una respuesta de memoria en niños mayores y en adultos. Por tal motivo, los polisacáridos capsulares han sido químicamente conjugados con proteínas acarreadoras para convertirlos en antígenos T-dependientes, los cuales pueden producir una respuesta humoral protectora y células de memoria. Así, se han desarrollado cuatro vacunas Hib conjugadas, cada una con diferentes proteínas acarreadoras (TT, DT, CRM197 y una proteína de membrana externa de N. meningitidis tipo b)(24). En el caso de S. pneumoniae, se han diseñado vacunas de uso pediátrico que incluyen mezclas de hasta once polisacáridos conjugados, las cuales están actualmente en evaluación clínica (23).
 
 
Vacunas de ADN

Una nueva estrategia ha sido el utilizar moléculas de ADN, que codifican para un antígeno microbiano, las cuales son utilizadas en vacunación. El objetivo es transformar las células con este ADN, el cual es incorporado en la célula que sintetiza entonces el antígeno. El antígeno puede ser secretario o puede ser localizado en la superficie de la célula, de manera que pueda producir una respuesta inmune, sea humoral, celular o de los dos tipos. Las moléculas de ADN deben contener, además de los genes de interés, todas aquellas secuencias necesarias para que pueda ocurrir la transcripción. Adicionalmente, los dinucleótidos CpG presentes en la secuencia de ADN inducen proliferación de células B y la secreción de inmunoglobulinas (25).

Existen tres estrategias para lograr la internalización del ADN. Una estrategia consiste en inyectar intramuscularmente una solución del ADN desnudo (43). Las células lo incorporan, transcriben la información y sintetizan el antígeno, de manera similar a como ocurre durante una infección viral. La segunda estrategia es el ADN facilitado, el cual consiste en recubrir el ADN con lípidos catiónicos para neutralizar la carga y facilitar la internalización del AND (35). La última estrategia consiste en incluir el ADN en un microorganismo vector que infecte la célula y, una vez dentro. libere el ADN. Los microorganismos que son utilizados como vectores deben tener la capacidad de introducirse en la célula y liberar el ADN pero sin multiplicarse intracelularmente. Algunos virus han sido utilizados para tal propósito, incluyendo fowlpox virus o canarypox virus, en los cuales los genes de interés se incorporan en su genoma (11, 22). Por otra parte, cepas de Shigella flexneri asd, las cuales requieren de ácido diaminopimélico (ADP) para su multiplicación, se utilizan como vectores para plásmidos conteniendo los genes que codifican para los antígenos. Una vez que la bacteria ha llegado al citoplasma de la célula, deja de multiplicarse (debido a la ausencia de ADP en el citoplasma) y sufre lisis, liberando el plásmido en el citoplasma (39).
 
 
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(*) MQC, PhD. Centro de Investigación en Enfermedades Tropicales Facultad de Microbiología - Universidad de Costa Rica 2060 Ciudad Universitaria Rodrigo Facio Tel.: 207-4275 Fax: 225-2374 E-mail: fgarcia@cariari.ucr.ac.cr