Introducción

La tripanosomiasis americana, conocida como enfermedad de Chagas (ECH), es una enfermedad zoonótica parasitaria causada por Trypanosoma cruzi, un protozoario hemoflagelado, distribuido en 21 países de América Latina. En México, se estima que un millón de personas podrían estar presentando síntomas de esta enfermedad. La principal forma para adquirir el parásito es mediante las heces u orina de insectos triatominos (vía vectorial) infectados, el vector se conoce como chinche, la cual defeca mientras se alimenta de la sangre de los humanos o animales (^{Morales-Moran et al., 2021}; (^{Organización Mundial de la Salud (OMS), 2023}). La terapia para esta enfermedad se realiza con los medicamentos benznidazol y nifurtimox, estos antiparasitarios tienen una eficacia de casi el 100 % si se administra al inicio de la fase aguda, sin embargo, su eficacia disminuye en la fase crónica, ya que aproximadamente solo el 5.9 % de los pacientes que reciben tratamiento durante la etapa crónica logran curarse (^{Morales-Moran et al., 2021}). En 2012, Muñoz-Calderón et al. evaluó in vitro dichos antiparasitarios en contra de T. cruzi en estadío de epimastigote, encontrando una IC₅₀ de 2.34 ± 0.72 ppm para Nifurtimox y para el Benznidazol la IC₅₀ fue de 13.12 ± 2.45 ppm. Así mismo, ^{Faria et al. (2017}), utilizó el Benznidazol como control positivo en su ensayo tripanocida, encontrando una concentración efectiva 50 de entre 14.63 µg/mL y 16.6 µg/mL. Sin embargo, la distribución de estos medicamentos se encuentra estrictamente regulada por la Secretaría de Salud en México (^{Callejas et al., 2022}), lo que desencadena un difícil acceso (distribución), además se han reportado efectos adversos, debido a la hipersensibilidad a los componentes de la fórmula (^{Abdel-Sattar et al., 2010}; ^{Centro para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC), 2023}; ^{Jackson et al., 2020}).

Es importante mencionar que el tratamiento contra la ECH es escaso o ineficiente (dependiendo de la fase), por lo que, la búsqueda de nuevos métodos alternativos naturales se ha vuelto constante e importante para los investigadores (^{Miranda-Cruz et al., 2012}; ^{Velázquez-Vázquez et al., 2019}), esto se debe a que las plantas producen diversos metabolitos secundarios (MS), tales como los terpenos, alcaloides y compuestos fenólicos, los cuales no tienen reportes de efectos adversos; de hecho se estima que los extractos de plantas o los compuestos aislados de estas pueden ser fuente de un sinfín de oportunidades para la humanidad (^{Jain et al., 2019}).

México es considerado uno de los países más antiguos en el uso tradicional de las plantas, debido a la diversidad de éstas y la riqueza de su vasta cultura, en esta práctica se utilizan diferentes partes de ellas, más a menudo hojas y flores, y esporádicamente raíces o tallos (^{Barragán, 2006}). El consumo de plantas medicinales ha sido ampliamente difundido debido a que, existen hasta 5 000 especies con potencial terapéutico; esto para tratar afecciones causadas por microorganismos, entre ellos los parásitos (^{Pérez-Molphe et al., 2018}; ^{Ramírez-Moreno et al., 2017}; ^{Sharma et al., 2017}). Es por lo antes mencionado, que se han realizado estudios con diferentes partes de las plantas (principalmente corteza, flores, hojas, frutos, y raíces) y usando solventes orgánicos para su extracción con la finalidad de ser evaluadas en contra el parasito T. Cruzi (^{Abe et al., 2002}; ^{Bortoluzzi et al., 2021}; ^{Faria et al., 2017}; ^{Pérez-Treviño et al., 2017}). Sin embargo, una gran cantidad de especies vegetales carecen de registro biológico, como las que se describen a continuación.

Dentro del género Nothoscordum hay 30 especies distribuidas en el mundo, encontrándose principalmente en regiones tropicales, 20 especies son nativas de Sudamérica; Nothoscordum bivalve Britton, o también llamada cebolleta o ajo falso, es la única especie que se encuentra en Norteamérica (Estados Unidos, México, Argentina, Uruguay y Chile). ^{Lazo y Ravenna (1989}) realizaron estudios in vitro utilizando extractos acuosos de especies del genero Nothoscordum en contra de Staphylococcus aureus, Aspergillus fumigatus y Candida albicans, consiguiendo inhibir su crecimiento. Así mismo, ^{Hernández-Marín (2018}a) evaluaron la actividad antimicrobiana del extracto metanólico de N. bivalve, contra Acinetobacter baumanni, además, evaluaron la toxicidad, la citotoxicidad, la citoprotección y la capacidad antioxidante. Ese mismo año, ^{Hernández-Marín (2018}b), evaluó el potencial de N. bivalve para eliminar la formación de biopelículas bacterianas de A. baumannii y, además, encontró que los principales compuestos encontrados en sus extractos fueron, esteroles, triterpenos, cumarinas, alcaloides, taninos y flavonoides.

Teucrium cubense Jacq, también conocida como cabeza de hormiga, apazotillo, epazotillo, ipazotillo, hierba del negro, hierba de la gallina y en lengua totonaca se conoce como chachacanch-an. Es nativa de ciertos estados de México (Coahuila, Durango, Tamaulipas, Sinaloa, Nuevo León, Guanajuato, Querétaro, San Luis Potosí, Veracruz, Tabasco, Yucatán y Quintana Roo). De acuerdo con ^{Alonso-Castro et al. (2010}) T. cubense se ha usado como tratamiento alterno natural para la diabetes mellitus tipo II, usando extractos acuosos; los cuales mostraron la presencia de compuestos fenólicos, alcaloides y flavonoides. Así mismo, ^{Godínez-Caraballo y Volpato (2008}), registraron que la infusión de las hojas es usada para tratar afecciones de la garganta; el jugo de las hojas se puede aplicar para curar el dolor de oídos y las hojas fritas para la cura de bronquitis, así como el cocimiento de las hojas para tratar edemas e hinchazón de las piernas. Estudios in vitro de las especies, Teucrium ramosissimum y Teucrium polium han evidenciado la actividad antiplasmodial y antibacteriana respectivamente, demostrando su potencial antimicrobiano (^{Henchiri et al., 2009}; ^{Safari et al., 2014}).

Arbutus xalapensis Kunth o madraño, es un árbol perennifolio de la familia Ericaceae, habita en la mayor parte de los estados de la república mexicana, con excepción de Tabasco, Campeche, Yucatán y Quintana Roo. El extracto acuoso de A. xalapensis se utiliza como remedio casero para la diarrea, así mismo, los frutos poseen propiedades narcóticas (^{Niembro-Rocas et al., 2010}) y las ramas se han usado tradicionalmente para tratar problemas relacionados con la circulación, problemas cardiovasculares, fiebre y enfermedades gastrointestinales (^{Dimayuga et al., 1998}; ^{Sharma et al., 2017}). Extractos acuosos de A. unedo, han mostrado actividad antimicrobiana en contra de Bacillus cereus, B. subtilis, Staphylococcus aureus y S. epidermis, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa (^{Hernández-Rodríguez et al., 2015}; ^{Malheiro et al., 2012}; ^{Mohamed et al., 2013}). Con respecto a su fitoquímica, el género Arbustus contiene fenoles, iridoides, antocianinas, carotenoides, terpenoides y ácidos grasos (^{Tenuta et al., 2019}).

Mimosa malacophylla Gray es nativa en diversos estados de la república mexicana, principalmente al norte de México en los estados como Coahuila, Nuevo León y Tamaulipas. La infusión del tallo, raíz y hoja de esta planta se usa como antidiurética y para tratar enfermedades como los cálculos renales (^{Camargo-Ricalde et al., 2001}). También ha presentado propiedades antimicrobianas, antioxidante y citoprotectora (^{Guillén-Meléndez et al., 2022}). En el género mimosa se encuentra M. pudica, para la cual se ha reportado actividad antimicrobiana de extractos metanólicos en contra de Aspergillus fumigatus, Citrobacter divergens y Klebsiella pneumonie y actividad antipalúdica frente Plasmodium berghei; estas actividades se atribuyen principalmente a la presencia de terpenoides, flavonoides y alcaloides (^{Blanco, 2019}). Además, en la especie M. malacophylla se han registrado, saponinas, alcaloides, flavonoides, sesquiterpenlactonas, cumarinas, terpenoides y compuestos fenólicos (^{Guillén-Meléndez et al., 2022}).

También se ha reportado que los extractos metanólicos de las hojas de T. cubense, A. xalapensis y M. malacophylla, han mostrado propiedades bactericidas en contra de S. aureus, P. aureginosa y Stenotrophomonas maltophilia (^{Pérez-Narváez, et al., 2019}).

Por su parte, Arctostaphylos pungens (pingüica o manzanita) habita en lugares templados del suroeste de Estados Unidos y del norte-centro de México (^{Márquez-Linares et al., 2005}). Se le atribuyen una gran variedad de aplicaciones medicinales; tales como propiedades analgésicas, antinflamatorias, antiespasmódicas y antimicrobianas, las infusiones de hojas o frutos son usadas para tratar problemas urinarios y bronquitis (^{Berg, 1974}; ^{Weise et al., 1991}). Recientemente, ^{Navarro-Cortez et al. (2022}), reporta que el extracto metanólico de la pingüica es hipertensivo, pues inhibe en un 50 % la actividad de la enzima convertidora de angiostenina (ECA). En la actualidad, no hay registros de que A. pungens demuestre actividad antiparasitaria, en cambio, hay estudios que demuestran que plantas de la misma familia (Ericaceae), como es Erica arborea y Calluna vulgaris, han presentado actividad antihelmíntica (^{Moreno-Gonzalo et al., 2012}).

Diversas plantas medicinales de origen latinoamericano y mexicano han sido evaluadas por una gran cantidad de métodos in vitro e in vivo; esto con la finalidad de conocer sus aplicaciones terapéuticas y ofrecer una alternativa a los padecimientos actuales. Tal es el caso de las especies Nothoscordum bivalve, Teucrium cubense, Arbustus xalapensis, Mimosa malacophylla y Arctostaphylos pungens, existen registros de sus diversas actividades biológicas, entre ellas antimicrobianas, pero no específicamente de su potencial tripanocida. Por lo que, este estudio se enfoca en evaluar a cada especie mencionada, por métodos de microdilución, en contra de una cepa de referencia de T. cruzi (Ninoa) y una cepa de silvestre obtenida en el municipio de Calvillo, Aguascalientes.

Materiales y métodos

Obtención del material vegetal: Las especies en estudio fueron obtenidas en tres estados de la República Mexicana. N. bivalve fue colectada en Santa Catarina, Nuevo León (25°38’50.78” N & 100°43’24.19” W) en el mes de marzo del año 2020 (^{Hernández-Marín et al., 2018}a). Para el caso de las especies T. cubense, A. xalapensis y M. malacophylla estás fueron obtenidas de la Localidad de Potreto Redondo, Santiago, Nuevo León, México (25°23’17.6604” N & 100°08’37.9896” W) en mayo del año 2019 (^{Pérez-Narváez et al., 2019}). A. pungens fue recolectada en el Cerro del Picacho en Aguascalientes en enero de 2020 (21°53’03.53” N & 102°25’02.05” W). Y el fruto de la misma planta fue obtenido de un local comercial en Lagos de Moreno Jalisco. Todas las plantas fueron secadas a una temperatura de 40 °C por un periodo de 96 h, con ayuda de un horno (Faithful Gp-45B), subsecuentemente fueron molidas y almacenadas en un lugar fresco y seco hasta su uso.

Obtención de extractos (Maceración y Soxhlet): Los extractos metanólicos fueron obtenidos por maceración estática a excepción de una muestra de N. bivalve que fue obtenida por el método de reflujo en Soxhlet. Para las extracciones por maceración estática con metanol (J.T Baker®), diferentes partes de las plantas fueron utilizados, colocando aproximadamente 100 g de la planta seca y triturada en un frasco con tapón de rosca de 1 l y agregando 500 ml de metanol durante 48 h, posteriormente los extractos fueron filtrados con la ayuda de papel Whatman No. 1 y finalmente se concentraron con ayuda de un rotaevaporador (^{Pacheco-Ordaz, 2022}). En el caso de extracto de N. bivalve, una porción del material vegetal fue sometida a una extracción consecutiva utilizando un equipo Soxhlet, utilizando solventes de menor a mayor polaridad (hexano (J.T Baker®), cloroformo (J. T Baker®) y metanol (J. T Baker®) en la misma muestra de planta, estos extractos fueron concentrados de la manera previamente descrita (^{Hernández-Marín et al., 2018}a). Por último, se calculó el rendimiento de cada extracto obtenido.

Cepas de Trypanosoma cruzi utilizadas: La actividad antiparasitaria se realizó sobre dos cepas diferentes de T. cruzi. La primera fue la cepa Ninoa, proporcionada por el departamento de Microbiología de la Benemérita Universidad de Aguascalientes; esta cepa fue mantenida en medio bifásico NNN (Novy, McNeal, Nicolle), a una temperatura de 27 °C. La segunda cepa fue aislada de triatominos de la especie Meccus longipennis o Meccus phyllosoma, los cuales fueron colectados en la comunidad Las Cabras, perteneciente al municipio de Cavillo, en Aguascalientes, México, ambas especies de triatominos tienen reportes de ser portadoras de T. cruzi (^{Morales-Moran et al., 2021}). Una vez colectados, los triatominos fueron trasladados a las instalaciones del departamento de Microbiología de la Benemérita Universidad Autónoma de Aguascalientes, fueron separados en frascos de vidrio, tapados con gasa para permitir la respiración de las chinches (^{Alzogaray, 1996}). Los triatominos fueron alimentados con ayuda de un conejo de la raza Nueva Zelanda blanco (^{Martínez-Ibarra et al., 2018}; ^{Quirós-Gómez et al., 2017}). Después de 24 h, se realizó un masaje abdominal para la obtención de la materia fecal, la cual fue observada al microscopio (40 X) en busca de la presencia de T. cruzi (^{Morales-Moran et al., 2021}). Las muestras positivas fueron mezcladas con solución salina fisiológica, en una proporción 1:1 (vol:vol); posteriormente 1 ml con aproximadamente 1x10⁴ parásitos fue inoculada vía intraperitoneal a tres ratones de la cepa BALB/c con ayuda de una jeringa de insulina (^{Mendes-Carvalho et al., 2020}; ^{Reboreda-Hernández et al., 2021}). Transcurridos 15 días de la inoculación, la sangre de los ratones fue analizada a microscopio (40X) para realizar la búsqueda de T. cruzi (^{Borghi et al., 2021}; ^{Espinoza et al., 2011}). Los ratones positivos, fueron sacrificados por punción cardiaca en un ambiente estéril, para obtener la mayor cantidad de sangre (aproximadamente 2 ml); la sangre fue depositada en tubos que contenía el medio NNN para la proliferación al parásito, a este medio se le añadió gentamicina (0.1 % de 40 mg/ml) y penicilina (0.5 % de 10 000 UI/ml) para inhibir el crecimiento bacteriano (^{Alviarez et al., 2014}; ^{Ballesteros-Rodea et al., 2012}, ^{Kluyber et al., 2021}).

Evaluación de la actividad tripanocida de los extractos metanólicos: Para evaluar la actividad tripanocida de los 12 extractos obtenidos frente a las dos cepas en estudio, se realizó la metodología propuesta por ^{Pérez-Treviño et al. (2017}) y por ^{Rodríguez-Garza et al. (2019}), con algunas modificaciones. Los medios de cultivo NNN que contenían epimastigotes con crecimiento de 21 días (fase exponencial) se ajustaron a una concentración a 1x10⁵ epimastigotes/ml, utilizando una cámara de Neubauer. Posteriormente, se colocaron 140 µl de epimastigotes y 10 µl del extracto a evaluar, en una microplaca de 96 pocillos (CELLTREAT®). Las concentraciones de los extractos se ajustaron a 1 000 ppm, 750 ppm, 500 ppm, 250 ppm, 100 ppm, 75 ppm, 50 ppm, 25 ppm y 10 ppm. Como control negativo, se utilizaron los epimastigotes sin tratamiento, mientras que el control positivo contenía cristal violeta al 1 % (^{Sayé et al., 2020}). El solvente utilizado en los extractos fue colocado como blanco del ensayo. Todas las evaluaciones se realizaron 2 veces por triplicado. Las microplacas fueron incubadas en cámara húmeda a 27.5 °C por 24 h. Después del tiempo de incubación, se revisó la viabilidad de los parásitos con la ayuda de una cámara de Neubauer. Los resultados fueron sometidos a un análisis Probit utilizando el programa estadístico SPSS ver. 23 (^{IBM Corp., 2015}), para obtener las concentraciones mínimas inhibitorias 50 (CI₅₀).

Resultados

Los diferentes gramajes utilizados para las extracciones de las plantas en estudio se muestran en la Tabla 1; los rendimientos obtenidos oscilan entre el 30 % y 5.2 %. En el caso de los resultados obtenidos de las CI₅₀ de cada uno de los extractos en estudio (Tabla 2). Los valores oscilan entre y 1 418.74 ± 6 ppm y 14.1 ± 5 ppm; destacando que la hoja de A. pungens fue aquella que presentó mejor actividad tripanocida.

Discusión

México es un país considerado endémico de la enfermedad de Chagas, se estima que en más de la mitad de su territorio existe el riesgo de transmisión vectorial (^{Organización Panamericana de la Salud (OPS), 2023}); con mayor frecuencia en los estados de, San Luis Potosí, Querétaro, Veracruz, Morelos, Oaxaca, Yucatán, Chiapas, Guerrero y Jalisco (^{Arnal, 2019}). Estudios recientes han demostrado la presencia de T. cruzi en vectores ubicados en el estado de Aguascalientes (^{Morales-Moran et al., 2021}); por ello se recolectaron triatominos del municipio de Calvillo, Aguascalientes; con el fin de buscar el parásito y así obtener una cepa silvestre. Tras la inoculación de las muestras positivas en ratones y obtener tripomastigotes sanguíneos estos fueron sembrados en el medio NNN para obtener epimastigotes, estadío utilizado para los ensayos biológicos; con respecto a esto, el medio NNN es ampliamente utilizado para proliferar parásitos flagelados en su forma móvil, además la adición de antibióticos como penicilina y gentamicina evita la propagación de bacterias indeseadas (^{Alviarez et al., 2014}; ^{Ballesteros-Rodea et al., 2012}; ^{Kluyber et al., 2021}).

Estudios de laboratorio han demostrado, una correlación positiva entre la actividad tripanocida contra epimastigotes in vitro y tripomastigotes in vivo, por lo que estimar la actividad de algún compuesto o metabolito con actividad contra epimastigotes se ha implementado de forma efectiva (^{Abe et al., 2002}; ^{Calvo, 2015}). Los ensayos in vitro de plantas medicinales necesitan de controles para llevar a cabo una correcta evaluación; como se ha mencionado previamente los fármacos benznidazol y nifurtimox tienen un acceso difícil y son estrictamente regulados en nuestro país, por ello, la búsqueda de otras alternativas permite enfrentar los ensayos con un control adecuado y más accesible (^{Callejas et al., 2022}; ^{CDC, 2023}; ^{Jackson et al., 2020}). Con respecto a esto, ^{Sayé et al. (2020}) utilizó cristal violeta como control positivo, debido a que el compuesto inhibe el metabolismo de la prolina; este aminoácido participa en la diferenciación de los estadios de T. cruzi, así como en funciones vitales para la supervivencia del mismo.

Diversos ensayos in vitro para evaluar la actividad tripanocida, han sido realizados con extractos y/o derivados de plantas medicinales; tal es el caso de ^{Rojas et al. (2010}), donde evaluaron aceites esenciales extraídos de 10 especies de plantas, contra el estadio de epimastigote de T. cruzi, destacando una IC₅₀ de 63.09 μg/ml para Cimbopogon citratus y 96.49 μg/ml para Aloysia triphylla, su actividad biológica podría estar relacionada a su componente principal, que es el citral, el cual posee propiedades antibacterianas y antiparasitarias. En el caso de plantas mexicanas, ^{Pérez-Treviño et al. (2017}), evaluaron extractos metanólicos de Hematoxilum brasiletto, Marrubium vulgare, Schinus molle y Cympongon citratusk, obteniendo CI₅₀ de 543 μg/ml, 647 μg/ml, 827 μg/ml y 1 210 μg/ml, respectivamente, en contra del estadio de epimastigote de una cepa de T. cruzi obtenida en Cerralvo, Nuevo León.

Con respecto a los métodos de extracción, N. bivalve presentó una actividad tripanocida variable; para la cepa Ninoa, ya que el extracto obtenido por maceración estática, presentó una CI₅₀ de 700.98 ppm ± 8 ppm, mientras que para el extracto proveniente de la extracción en reflujo Soxhlet se obtuvo una IC₅₀ superior a 1 400 ppm, esto puede ser explicado debido al desgrasamiento del material vegetal, ya que los compuestos no polares fueron extraídos previamente, demostrando que dichos compuestos pueden tener una posible actividad tripanocida, cabe resaltar que dicho extracto fue seleccionado por presentar baja toxicidad en estudios anteriores (^{Hernández-Marín et al., 2018}a). Por otro lado, se puede observar que las CI₅₀ para la cepa Calvillo, fueron inferiores (< 655.17 ± 9 ppm), demostrando que la cepa silvestre presenta una mayor sensibilidad a los extractos de N. bivalve, esto podría explicarse ya que es común que las cepas silvestres presenten diferentes grados de susceptibilidad al comparase con cepas de referencia (^{Da Costa et al., 2020}). N. bivalve, ha mostrado poca o nula citotoxicidad (^{Hernández-Marín et al., 2018}a); es por ello por lo que fue considerada como una posible fuente de compuestos tripanocidas.

T. cubense destaca por presentar usos como antidermatofítico, pero estudios han evidenciado actividad antimicrobiana contra Acinetobacter lwoffii, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aureginosa, Stenotrophomonas maltophilia, y Candida albicans. Con respecto a la citotoxicidad del extracto, resulta ser no citotóxico (^{Jacobo-Salcedo et al., 2011}; ^{Pérez-Narváez et al., 2019}; ^{Sharma et al., 2017}). ^{Henchiri et al.(2009}) realizó una evaluación in vitro de extractos etanólicos de las partes aéreas de la especie T. ramosissimum, mostrando una marcada actividad antiplasmodial en contra de Plasmodium falciparum con una CI₅₀ de 1.2-5 µg/ml. Nuestros resultados muestran que el extracto del tallo de T. cubense presenta una CI₅₀ contra de T. cruzi menor a 111 ppm para ambas cepas, siendo la segunda especie con mejor actividad en el presente estudio; demostrando que el género Teucrium puede contener compuestos con actividad tripanocida.

Con respecto a la especie A. xalapensis, esta contiene compuestos fenólicos y ha presentado una variedad de actividades biológicas, siendo así fuente de compuestos antioxidantes, antibacteriales, antihipertensivos, antidiarreico, antiagregante plaquetario, entre otros (^{Hernández-Rodríguez et al., 2015}; ^{Niembro-Rocas et al., 2010}; ^{Pérez-Narváez, et al., 2019}; ^{Sharma et al., 2017}). Estudios in vitro han demostrado su actividad antibacteriana inhibiendo a bacterias gram positivas y gram negativas (^{Hernández-Rodríguez et al., 2015}; ^{Malheiro et al., 2012}; ^{Mohamed et al., 2013}; ^{Pérez-Narváez et al., 2019}); lo anterior sugiere la presencia de compuestos con actividad antimicrobiana con potencial tripanocida, esto se puede observar en el extracto de la hoja donde las CI₅₀ obtenidas son < 176 ppm.

En M. malacophylla se han reportado alcaloides y taninos, estos compuestos podrían estar relacionados con los halos de inhibición obtenidos contra los patógenos como B. subtilis, S. aureus, P. aureginosa, Stenotrophomonas maltophilia, Klebsiella pneumoniae, Aspergillus flavus y Trycophyton rubrum (^{Dimayuga et al., 1998}; ^{Pérez-Narváez et al., 2019}; ^{Sharma et al., 2017}). Por otro lado, la especie M. púdica presenta actividad antibacteriana, pero destaca su actividad antipaludica frente Plasmodium berghei; estas actividades se atribuyen principalmente a la presencia de terpenoides, flavonoides y alcaloides (^{Blanco, 2019}). En el caso de M. malacophylla, su actividad tripanocida presentó una CI₅₀ > 950 ppm en los extractos evaluados; estos son superiores o similares a las demás especies analizadas en el presente estudio, e incluso a extractos de otras especies (^{Pérez-Treviño et al., 2017}).

Finalmente, para A. pungens se evaluaron tres extractos dos de ellos provenientes de los frutos. El fruto comercial, presentó buena actividad biológica (CI₅₀ < 401 ppm); la cual puede ser atribuida a compuestos naturales como las quinonas y los flavonoides ya que se ha determinado que los compuestos mayoritarios en la baya o fruto de A. pungens son este tipo de compuestos (tetragaloiglucosa, galloilarbutina, arbutina) y flavonoides (miricetina) (^{Gallo et al., 2013}). En contraste, el extracto de hoja de A. pungens presentó la mejor actividad tripanocida del presente estudio, siendo para la cepa Ninoa una CI₅₀ 14.1 ± 10 ppm y una CI₅₀ de 35.9 ± 4 ppm para la cepa Calvillo; los valores son cercanos a los reportados por ^{Muñoz-Calderón et al. (2012}) al obtener una CI₅₀ de 2.34 ± 0.72 ppm para Nifurtimox y de 13.12 ± 2.45 para el Benznidazol (13.12 ± 2.45), caso similar obtenido por ^{Faria et al. (2017}) para el Benznidazol con una concentración efectiva de entre 14.63 µg/ml y 16.6 µg/ml. Esto último podría significar, que A. pungens, tiene gran potencial como tratamiento de la enfermedad de Chagas. Cabe mencionar que se ha reportaron que los metabolitos secundarios mayoritarios presentes en la hoja de A. pungens son quinonas (arbutina), triterpenos (ursona y ácido ursólico), flavonoides (hiperín, isoquercetín y miricetina), hidroquinonas (alatoina, metilarbutín, ericinol y ericolín) y taninos (ácido gálico, málico y quínico) (^{Panusa et al., 2015}); el efecto tripanocida de los extractos de A. pungens en contra de las cepas evaluadas fue similar al reportado para la miricetina (flavonoide), quercitina (flavonol) y el ácido ursólico (triterpeno), que se encuentran presentes en la hoja y/o fruto; esto debido a que dichos compuestos han presentado actividad tripanocida inhibiendo la proliferación del estadio de epimastigote, utilizando plantas nativas de Brasil, (^{Faria et al., 2017}). Futuros ensayos con A. pungens, podrían relacionar a los compuestos mencionados con su actividad tripanocida con mayor certeza, así como evaluar su toxicidad y citotoxicidad, para lograr disponer de una fuente natural de compuestos en contra de T. cruzi.

Concluyendo, la actividad tripanocida fue variable en los extractos evaluados, pero la especie A. pungens mostró la mayor actividad in vitro frente a los epimastigotes de dos cepas diferentes de T. cruzi. Estudios previos de su fitoquímica, han registrado dentro sus compuestos mayoritarios a la miricetina (flavonoide), quercitina (flavonol) y el ácido ursólico (triterpeno), dichos metabolitos han sido aislados y evaluados en otras investigaciones, demostrado su efectividad tripanocida. Futuras investigaciones podrían determinar si estos u otros metabolitos están involucrados en su actividad, así como en realizar los estudios pertinentes con respecto a su toxicidad y/o citotoxicidad, ya que los reportes existentes no aclaran del todo el potencial tóxico de A. pungens; todo ello con la finalidad, de determinar si la especie puede ser aplicada como una alternativa para el tratamiento de la tripanosomiasis americana.

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