Introducción

El género Heliconia L. (Heliconiaceae) está integrado por un grupo de aproximadamente 220 especies (^{Kress, Betancur, & Echeverry, 1999}), las cuales crecen de manera natural desde el norte de México hasta el sur de Brasil incluyendo las islas del Caribe (^{Berry & Kress, 1991}) e islas en la región de Indonesia en el Océano Pacífico (^{Kress, 1990}). México posee al menos 14 especies nativas las cuales habitan en selvas y bosques (^{Ferreira de Castro, May, & Gonçalves, 2007}), en suelos ácidos a alcalinos y desde los 36 hasta los 1 700 msnm (^{Ortiz-Curiel et al., 2015}). Entre las especies nativas existen endémicas como H. uxpanapensis^{Gutiérrez Báez(Gutiérrez-Báez, 1987}) y H. veracruzensis Gutiérrez Báez (^{Gutiérrez-Báez, Avendaño-Reyes, & Zamora-Crescencio, 2016}).

La similitud morfológica que muchas especies del género Heliconia comparten en su fase juvenil y lo contrastante que son en la etapa reproductiva por las formas raras y colores de su inflorescencia, son motivo de atención de coleccionistas, viveristas y ambientalistas. En el aspecto científico, la biología y sus distintas disciplinas se han enfocado a conocer la diversidad genética (^{Sheela, Geetha-Lekshmi, Jayachandran-Nair, & Rajmohan, 2006}), su genética poblacional (^{Suárez-Montes, Fornoni, & Nunez-Farfán, 2011}), su biología reproductiva (^{Bruna, Kress, Marques, & Da Silva, 2004}) y estudios de interacción con sus polinizadores (^{Betts, Hadley, & Kress, 2015}). De manera complementaria, disciplinas como la palinología han contribuido en aspectos de ontogenia y filogenia (^{Kress & Stone, 1982};^{Kress & Stone, 1983}) de sistemática y (^{Kress, 1990}) y taxonomía (^{Kress & Stone 1983}).

^{Kress & Stone (1983}), en su estudio palinológico de 27 especies de Heliconia que tienen como origen zonas de Centroamérica y Sudamérica, encontraron que el polen es heteropolar, subisopolar o isopolar y que la variación que existe en su morfología esporófita (con inflorescencia erecta versus inflorescencia colgante) no siempre es en la misma magnitud en su morfología polínica, ya que en ambos tipos de inflorescencias el polen puede ser isopolar o subisopolar o con forma euoblato a suboblato. Pese a lo anterior, los mismos autores indicaron que a nivel intraespecífico, la forma y la longitud del eje ecuatorial de los granos de polen son consistentes y que dichas características, además de la ornamentación de la exina, permiten clasificar variedades de Heliconia.

Respecto a los morfismos que describieron ^{Kress (1990}) en las especies de Heliconia del Pacífico (endémicas), el polen es de forma oblato-esferoidal únicamente y su ornamentación es ligeramente verrugada o psilada, tanto en especies con inflorescencia colgante o erecta. Mientras que ^{Simão, Scatena, & Bouman (2007}) en una especie de Brasil, encontraron variaciones morfológicas en la vista ecuatorial del polen. Por lo anterior, la diversidad morfológica del polen obedece a la diversidad genética pero algunos morfismos del polen son propios de ciertas zonas geográficas.

A pesar de que los estudios palinológicos en el género Heliconia se iniciaron desde hace aproximadamente cuatro décadas, las especies estudiadas representan apenas el 17 %, y de éste, en un porcentaje menor se han estudiado las características de la exina. Aunado a esto, se han omitido a las especies que habitan de manera natural en el Neotrópico mexicano, incluyendo sus especies endémicas. En este sentido, es necesario continuar con estudios de palinología en este género, con la finalidad de conocer la morfología y con ello contribuir al conocimiento palinológico. Además, el comparativo palinológico entre especies y variedades puede mostrar aquellas características relacionadas con la autoincompatibilidad, barrera fisiológica presente en este género.

Materiales y métodos

Material biológico:Se estudió el polen de nueve especies de Heliconia (12 accesiones) que están resguardadas en el Banco de Germoplasma de Heliconias del Campo Experimental Rosario Izapa del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP). El origen, hábitat y características de las accesiones se presentan en el Tabla 1.

Procesamiento de muestras para Microscopía Electrónica de Barrido (MEB): Flores abiertas se colectaron entre las seis y siete de la mañana y en laboratorio se extrajeron los granos de polen por medio de un alfiler y se depositaron en microtubos de 1.5 ml. El polen de tres a cinco anteras procedentes de flores de entre una y tres plantas se mezcló para formar una muestra. Las muestras se fijaron durante 24 h en solución de glutaraldehído al 2 % y etanol al 50 % (debido a que el polen de este género no tolera la técnica de acetólisis tradicional), posteriormente se lavaron por 5 min en etanol al 50 % y se trasvasaron a bolsitas de papel. En seguida, los granos de polen se deshidrataron en alcohol al 70, 90 y 100 % por 30 minutos en cada una de las concentraciones (^{Márquez-Guzmán, Wong, Pérez, López, & Munguía, 2016}). Las muestras se secaron por punto crítico con CO₂ en un secador SUPPLIES modelo SPI-DRY CPD y se montaron en bases de cilindros de aluminio cubiertas con cinta de carbón conductivo doble adhesiva. Posteriormente las muestras con granos de polen se cubrieron con una capa de oro-paladio (Au-Pd) de aproximadamente 20 nm por medio un cobertor iónico Denton Vaccum modelo Desk II. Finalmente, los granos de polen se observaron en un microscopio electrónico de barrido marca TOPCON SM-510 operando a 8 Kv de aceleración.

Morfometría polínica: Se tomaron electromicrografías de los granos de polen en el plano polar distal, polar proximal y ecuatorial, así como de la ornamentación de la exina y en ellas se tomaron medidas del plano polar y ecuatorial de al menos 25 granos de polen de cada accesión con el programa de cómputo libre de ^{Collins (2007}). También se registraron características particulares del téctum (presencia de microporos y la densidad de microespinas o verrugas por µm²) y particularidades de la cara proximal. Las características morfológicas de los granos de polen como la polaridad, la forma y la ornamentación de la exina se identificaron con base a ^{Sáenz (2004}) y ^{Halbritter et al. (2018}). Las variables se interpretaron mediante el análisis de agrupamiento jerárquico (AAJ). Para el AAJ se usó el paquete estadístico SAS (2012) versión 9.3 y el algoritmo por agrupamiento jerárquico con una distancia euclidiana de 0.05 para generar un dendrograma.

Resultados

El polen de las especies de Heliconia se considera grande, con dimensiones de 50.2 a 70.6 µm; tiene una cara distal que es subconvexa, subconvexa-subconcava, convexa-truncada o convexa y se complementa con una cara proximal plana, plana-subconcava, subconcava, subconvexa-subconcava o convexa, razón por la cual es heteropolar (Fig. 1A, Fig. 1E, Fig. 1I; Fig. 2A, Fig. 2E, Fig. 2I, Fig. 3A, Fig. 3E, Fig. 3I y Fig. 4A, Fig. 4E, Fig. 4I).

Los elementos esculturales de ambas caras, distal y proximal, son microespinas (Fig. 1B, Fig. 1C, Fig. 1D H. vaginalis, Fig. 1F, Fig. 1G, Fig. 1H H. adflexa, Fig. 1J, Fig. 1K, Fig. 1L H. spissa; Fig. 2F, Fig. 2G, Fig. 2H H. bourgaeana, Fig. 2J, Fig. 2K, Fig. 2L H. champneiana; Fig. 3B, Fig. 2C, Fig. 2D H. uxpanapensis-10, Fig. 3F, Fig. 3G, Fig. 3H H. uxpanapensis-12; Fig. 4F, Fig. 4G, Fig. 4H H. collinsiana var. velutina,Fig. 4J, Fig. 4K, Fig. 4L H. collinsiana var. collinsiana) y espínulas menos cónicas con base ancha o redonda por lo que se consideraron microverrugas (Fig. 2B, Fig. 2C, Fig. 2D H. librata; Fig. 3J, Fig. 3K, Fig. 3L H. uxpanapensis-11 y Fig. 4B, Fig. 4C, Fig. 4D H. latispatha). La cara proximal tiene microespínulas o microverrugas aún de menor tamaño que la cara distal y están presentes en menor cantidad, en consecuencia, la exina en algunas accesiones es psilada.

Fig. 1 (A, B, C, D) Vag-18; (E, F, G, H) Adf-03 y (I, J, K, L) Spi-15. A, E, I) en vista ecuatorial; (B, F, J) cara distal; C, G, K) cara proximal y (D, H, L) ornamentación de la exina. (A, B, C, E, F, G, I, J, K) Esc = 10 µm; (D, H, L) Esc = 2 µm. Fig. 1 (A, B, C, D) Vag-18; E, F, G, H) Adf-03 and (I, J, K, L) Spi-15. (A, E, I) equatorial view; (B, F, J) distal face; (C, G, K) proximal face and (D, H, L) sculpturing. (A, B, C, E, F, G, I, J, K) Esc =10 µm and (D, H, L) Esc = 2 µm. 

Fig. 2 (A, B, C, D) Lib-13; (E, F, G, H) Bou-08 y (I, J, K, L) Cha-07. (A, E, I) vista ecuatorial; (B, F, J) cara distal; (C, G, K) cara proximal y (D, H, L) ornamentación de la exina. (A, B, C) Esc = 8 µm; (E, F, G, I, J, K) Esc = 10 µm y (D, H, L) Esc = 2 µm. Fig. 2 (A, B, C, D) Lib-13; (E, F, G, H) Bou-08 and (I, J, K, L) Cha-07. A, E, I) equatorial view; (B, F, J) distal face; (C, G, K) proximal face and (D, H, L) sculpturing. (A, B, C) Esc = 8 µm; (E, F, G, I, J, K) Esc = 10 µm and (D, H, L) Esc = 2 µm. 

Fig. 3 (A, B, C, D) Uxp-10; (E, F, G, H) Uxp-12 y (I, J, K, L) Uxp-11. A, E, I) vista ecuatorial; (B, F, J) cara distal; (C, G, K) cara proximal y (D, H, L) ornamentación de la exina. (A, B, C, E, F, G, I, J, K) Esc =10 µm y (D, H, L) Esc = 2 µm. Fig. 3 (A, B, C, D) Uxp-10; (E, F, G, H) Uxp-12 y (I, J, K, L) Uxp-11. A, E, I) equatorial view; (B, F, J) distal face; (C, G, K) proximal face and D, H, L) sculpturing. (A, B, C, E, F, G, I, J, K) Esc =10 µm and (D, H, L) Esc = 2 µm. 

Fig. 4 (A, B, C, D) Lat-04; (E, F, G, H) Col-01 y (I, J, K, L) Col-27. (A, E, I) vista ecuatorial; (B, F, J) cara distal; (C, G, K) cara proximal y (D, H, L) ornamentación de la exina. (A, B, C, E, F, G) Esc = 8 µm, (I, J, K) Esc = 10 µm, (D, H, L) Esc = 2 µm. Fig. 4 (A, B, C, D) Lat-04; (E, F, G, H) Col-01 y (I, J, K, L) Col-27. (A, E, I) equatorial view; (B, F, J) distal face; (C, G, K) proximal face and (D, H, L) sculpturing. (A, B, C, E, F, G) Esc = 8 µm; (I, J, K) Esc = 10 µm and (D, H, L) Esc = 2 µm. 

Las medidas del polen con mayor contraste en su eje ecuatorial (E) fueron 50.22 µm en H. collinsina var. velutina y 70.56 µm en H. vaginalis; valores que permitieron identificarlos como el más pequeño y más grande respectivamente para las especies de estudio. Respecto al eje polar (P) los valores fueron 28.48 µm en H. librata y 48.59 µm en H. collinsiana. Esta última variable está determinada por el grado de convexidad de las caras del polen y el tipo de poro germinativo, lo cual influye en la relación P/E. En este sentido, se obtuvo el polen con forma euoblata, suboblata y oblata esferoidal (Tabla 2).

Por otra parte, el agrupamiento jerárquico con un R² semiparcial = 0.05 arrojó cinco grupos principales (Fig. 5). El grupo I lo integraron H. vaginalis, H. adflexa y H. spissa. Este grupo se diferencia fácilmente por su exina microequinada y la alta densidad de microespinas por unidad de superficie, asimismo, presentan poros en el téctum (Fig. 1D, Fig. 1H, Fig. 1L) y tienen la cara proximal altamente convexa (medio círculo). Un segundo grupo lo integraron H. champneiana, H. bourgaeana y las tres accesiones de H. uxpanapensis. Este grupo se identifica porque, de manera inversa al grupo I, el polen tiene la cara distal altamente convexa, mientras que la cara proximal tiende a ser plana o subconvexa, excepto H. librata que tiene la cara proximal convexa como las especies del grupo I.

Fig. 5 Dendrograma de 12 accesiones (taxa) de Heliconia en función de diez caracteres morfológicas de polen (R² = 0.05). Fig. 5 Dendrogram of 12 Heliconia accessions (taxa) as a function of ten pollen morphological characters (R² = 0.05). 

El grupo III lo representa H. latispatha; su cara distal presenta microverrugas, la zona del poro germinativo es protudente, además tiene la cara proximal plana subcóncava. En el grupo IV H. librata se separa porque el polen es de los de menor tamaño, su cara distal es casi plana y en ambas caras la ornamentación la constituyen microverrugas. El grupo V lo integra H. collinsiana con sus dos variedades que tienen el polen morfológicamente similar, ya que presentan una cara distal altamente convexa y con el poro germinativo protudente. Además, presentan un “círculo acanalado” como un aparente engrosamiento en forma de anillo alrededor de la región ecuatorial.

Referente a la morfometría intraespecífica, las tres accesiones de H. uxpanapensis comparten valores similares en el eje ecuatorial, aunque existe mayor variación en la forma general del polen debido a la variada convexidad de sus caras distal y proximal. No obstante, las tres accesiones presentan la cara distal convexa, la diferencia más evidente la presentan Uxp-11 y Uxp-12, las cuales tienen una concavidad en la cara proximal. En la ornamentación, Uxp-11 se diferencia por ser verrugosa en su polo distal, mientras que en el polo proximal de Uxp-10 es psilada (Tabla 2).

Heliconia collinsiana,por su parte, tiene el polen homogéneo en todas las variables a excepción de la longitud del eje ecuatorial, donde la var. velutina es casi diez micrómetros menos que el de la var. collinsiana (Tabla 2). En función de dicha diferencia la var. collinsiana, tiene el polen de forma suboblata-esferoidal, mientras que la var. velutina tiene forma oblato-esferoidal, lo que significa que la relación P/E es cercana a 1.0.

Discusión

El análisis palinológico de las especies del género Heliconia del Neotrópico mexicano, con base en disimilitudes del tipo del poro germinativo, la forma de la cara proximal y distal, mostró que fue posible generar cinco grupos. Por otra parte, con características asociadas a la superficie de la exina fue posible diferenciar especies y variedades dentro de dichos grupos. Resultados similares encontraron ^{Kress & Stone (1983}) en su estudio de 27 especies de Heliconia donde la polaridad, el tipo de poro germinativo, la forma de las caras distal y proximal, permitieron generar cuatro grandes grupos taxonómicos. Por su parte, ^{Ciciarelli y Rolleri (2008}) y ^{Ciciarelli, Passarelli y Rolleri (2010}), en Canna (Zingiberales), encontraron variación en el tamaño del polen y morfología de las espinas (forma, densidad y su superficie), a pesar que Canna es un género con alta homogeneidad en la forma del polen y el tamaño de sus espinas.

Respecto al tamaño, el polen es grande con base en la clasificación de ^{Sáenz (2004}), y los 50.2 µm de H. collinsiana var. velutina a 70.6 µm de H. vaginalis tienen relativa coincidencia con el rango 52 µm a 91.3 µm que reportaron ^{Kress y Stone (1983}) en Heliconia. Asimismo, las especies del presente estudio se limitaron a solo polen heteropolar, en contraste con polen heteropolar a isopolar que reportaron ^{Kress y Stone (1982}) ^{Kress y Stone(1983}) y ^{Simão et al. (2007}) en especies de Centroamérica y Sudamérica, respectivamente.

La forma convexa de la cara proximal, la alta densidad de microespinas y la presencia de microporos en el téctum agruparon a H. vaginalis, H. adflexa y H. spissa en el grupo I. La alta convexidad en forma de “medio círculo” de la cara proximal de las especies de este grupo, así como de H. librata (Grupo VI), presentan cierta similitud con otras especies como H. talamancana y H. maculata (^{Kress & Stone 1983}), así como con H. papuana y H. laufao (^{Kress 1990}) de polen esferoidal.

La presencia de microporos en el téctum solamente la reportaron en H. angusta (^{Buchner & Halbritter, 2010}), H. psittacorum y H. brasiliensis (^{Passarelli, Dedominici, & Rolleri, 2016}). Lo anterior obedece a que, aunque existen trabajos palinológicos sobre Heliconia, no hay reportes frecuentes de esta característica, por tanto, son limitadas las especies que la presentan. Es este sentido, con el presente trabajo se amplía el conocimiento sobre el polen de Heliconia, pero, sobre todo, en especies de una zona geográfica que se ha estudiado mínimamente.

El agrupamiento de especies con microporos en el téctum podría indicar alta autoincompatibilidad como lo afirmaron ^{Stone, Sellers y Kress (1979}). Los poros de la exina son reservorio de proteínas que intervienen en el proceso de incompatibilidad durante la polinización y la germinación del polen, y esto podría ser congruente con la autoincompatibilidad que se reportaron en especies de Heliconia (^{Kress, 1983}; ^{Meléndez, Rojas, & Planas, 2008}). Sin embargo, es necesario corroborar este supuesto con estudios complementarios a fin de demostrar la supuesta autoincompatibilidad de estas especies si se plantea involucrarlas en trabajos de autopolinización.

Respecto al grupo II, H. bourgaeana y H. champneiana son especies que presentan similitudes morfológicas difíciles de separar en su fase esporófita (^{Andersson, 1981}), mientras que H. uxpanapensis presenta altas similitudes en la inflorescencia con H. champneiana (^{Avendaño et al., 2017}), aun cuando H. uxpanapensis es endémica. El agrupamiento de estas tres especies muestra que existe cierta interrelación; sin embargo, trabajos más particulares a nivel de exina e intina podrían dilucidar la filogenia entre estas tres especies que cohabitan en la zona del Neotrópico mexicano.

La ornamentación verrugosa de las caras distal y proximal de H. librata (grupo IV) la hace diferente a las especies estudiadas. Escasas especies reportadas presentan esta característica; no obstante, ^{Simão et al. (2007}), en su estudio sobre el polen de H. subulata subsp. gracilis (Petersen) L. Andersson y H. velloziana Emygdio, reportaron imágenes del polen con ornamentación de la exina verrugosa, pero la forma es diferente al de H. librata.

Respecto a H. collinsiana, por su poro germinativo distinto-protudente representa el grupo V. Las dos variedades de H. collinsiana del presente estudio coinciden con las descripciones de las mismas variedades que reportaron ^{Kress y Stone (1983}). Sin embargo, el “círculo acanalado” de la vista ecuatorial es un rasgo distintivo de las variedades de H. collinsiana de México, rasgo similar al de Heliconia solomonensis Kress, Heliconia lanata (P. Grees) Kress, endémicas del Pacífico (^{Kress 1990}), y a H. angusta Vell (^{Simão et al., 2007}).

Con base en las variables estudiadas, podemos sugerir que el polen de las especies del presente estudio tiene coincidencias con dos de cuatro grupos taxonómicos que ^{Kress y Stone (1983}) propusieron para las especies de Centro y Sudamérica. Así, los grupos de poro germinativo distintivo protudente corresponden al grupo nutans mientras que los de polen con poro germinativo indistinto trichocarpha. Cabe mencionar que cada especie mostró particularidades que permiten distinguirlas a nivel de especie y variedad como en H. collinsiana.

Los datos morfológicos de Heliconiaceae (monotípica) del presente estudio, así como los que reportaron ^{Kress (1990}), ^{Simão et al. (2007}), ^{Buchner y Halbritter (2010}) y ^{Passarelli et al. (2016}), muestran cierta homogeneidad de caracteres. Por lo tanto, se puede sugerir que esta familia presenta indicios de polen estenopolínico, con énfasis en algunos grupos detectados, por ejemplo, el grupo de especies de la Fig. 1 (Vag-18, Adf-03 y Spi-15) y Fig. 2 (Cha-07, Bou-08, Uxp-10, Uxp-11 y Uxp-12). Sin embargo, aunque se forman grupos polínicos con cierta homogeneidad, es parcial si se les compara a las familias estenopolínicas Gramineae (^{Perveen, 2006}); Malvaceae, Grewioideae (^{Mambrín, Avanza, & Ferrucci, 2010}) y Chenopodiaceae (^{Perveen & Qaiser, 2012}) las cuales presentan características altamente homogéneas en todos sus grupos. Más estudios en Heliconiaceae podrían reafirmar la homogeneidad en los grupos polínicos, puesto que las especies hasta ahora estudiadas representan aproximadamente el 23 % de las especies reportadas.

Por otra parte, referente a la morfología intraespecífica, considerando un R² semiparcial = 0.05, la variación que se observó en H. uxpanapnesis fue en distintas variables y en diferente magnitud. Esta situación la reportaron ^{Kress y Stone (1983}) y ^{Tekşen, Aytaç y Pinar (2010}), en Fritillaria L. (Liliaceae). Caso contrario a lo que se observó en H. collinsiana, donde la var. velutina se diferenció de la var. collinsiana únicamente por la longitud de su eje ecuatorial, al menos para las variables que aquí se estudiaron. Sin embargo, esta característica es altamente consistente y es mínimamente afectada por factores ambientales, debido a que los 50.2 µm de H. collinsiana var. velutina versus 52 µm que reportaron ^{Kress y Stone (1983}) demuestra que en longitud ambas son altamente similares. La similitud del polen entre estas dos variedades permite ver que, aunque no son el mismo genotipo puede asegurarse que son la misma variedad botánica debido a que ambas tienen como origen la Sierra Madre Occidental en la vertiente del Pacífico, zona que comparten Guatemala y Chiapas, México. Esto concuerda con lo que encontraron ^{Ciciarelli, Passarelli, & Rolleri (2010}) en Canna, al reportar que la longitud del eje ecuatorial es una variable consistente que permite inclusive diferenciar a las variedades dentro de especies. La variación intraespecífica a nivel de ornamentación la han reportado también en otros géneros, por ejemplo, en Quercus (^{Panahi, Pourmajidian, Fallah, & Pourhashemi, 2012}) y en Fritillaria L. (Liliaceae; ^{Tekşen et al., 2010}).

Declaración de ética: los autores declaran que todos están de acuerdo con esta publicación y que han hecho aportes que justifican su autoría; que no hay conflicto de interés de ningún tipo; y que han cumplido con todos los requisitos y procedimientos éticos y legales pertinentes. Todas las fuentes de financiamiento se detallan plena y claramente en la sección de agradecimientos. El respectivo documento legal firmado se encuentra en los archivos de la revista.