Cepas de Beauveria spp.

Se utilizaron las cepas de Beauveria spp.: INTA-H26, INTA-H30, INTA-H31, INTA-H49 e INTA-H50 (en lo sucesivo: H-26, H-30, H-31, H-49 y H-50), del Banco de Microorganismos del Laboratorio de Fitoprotección del Instituto Nacional de Innovación y Transferencia en Tecnología

Agropecuaria (INTA), aisladas a partir de insectos muertos parasitados recolectados de diferentes regiones de Costa Rica (tabla 1), con temperaturas que oscilan entre 19 °C min. y 35 °C máx. y ~70 % de humedad relativa. Las cepas se almacenaron en discos de papel filtro (0.5 cm de diámetro) en aceite a -20 °C.

Identificación taxonómica

La caracterización molecular se llevó a cabo en el Laboratorio de Biología Molecular del INTA. La extracción de ADN se realizó con 20 mg de micelio con 15 días de incubación en medio de cultivo agar papa dextrosa (PDA), según el procedimiento descrito por ^{Hoyos-Carvajal et al. (2008}). Se maceró el micelio en 500 μL del buffer de extracción (Tris-HCl 200 mM pH 7.2, EDTA 50 mM, SDS 3 %, NaCl 1 M y Mercaptoetanol 0.2 %), la mezcla resultante se incubó a 60 °C durante 30 min y se agitó cada 10 min con un agitador vortex. Posteriormente, se añadió 500 μL de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1) y se mezcló hasta formar una masa blanca. Luego, se centrifugó a 8 154 g durante 15 min y al sobrenadante se le añadió 0.54 veces el volumen de isopropanol. Se centrifugó a 4 313 g durante 5 min, se descartó el sobrenadante, se dejó secar el sedimento y luego se resuspendió en 300 μL de buffer Tris-EDTA. Se añadió acetato de sodio pH 5.2 (0.3 M) y dos veces el volumen de etanol absoluto y luego se centrifugó a 2 426 g durante 10 min. Se descartó el sobrenadante y se lavó el precipitado con 200 μL de etanol al 70 %, se dejó reposar por 1 h y se centrifugó a 4 313 g durante 10 min. Finalmente, el precipitado se dejó secar y se resuspendió en 100 μL de buffer Tris-EDTA, el cual se incubó a 37 °C durante 10 min. La integridad del ADN se determinó mediante un espectrofotómetro (Thermo Scientific®).

La identificación molecular de las cepas se realizó con la amplificación de dos regiones: 1) la del gen de factor de elongación^-1 alfa (EF1-α) por la técnica PCR Touchdown, los cebadores utilizados fueron 983F (10 µM) 5’-GCYCCYGGHCAYCGTGAYTTYAT-3’ y 2218R 5’-ATGACACCRACRGCRACRGTYTG-3’ (^{Rehner y Buckley, 2005}) y 2) la región intergénica nuclear del locus B (Bloc) mediante PCR de punto final, con los cebadores B5.1F (10 µM) 5’-CGACCCGGCCAACTACTTTGA-3’ y B3.1R 5’-GTCTTCCAGTACCACTAC-GCC-3’ (^{Rehner et al., 2006}). Los reactivos para la PCR fueron: 2X DreamTaq polimerasa Master Mix (Thermo Scientific®, K1071) y 10 ng µL^-1 ADN de volumen final 25-50 µL. Las condiciones de amplificación para el gen EF1-α y la región intergénica Bloc se detallan en la tabla 2. Los productos de PCR obtenidos se visualizaron en gel de agarosa al 1 %. Las secuencias se obtuvieron por el

método de Sanger y las secuencias Bloc y EF1-α se analizaron por separado. Luego se estudió en el software MEGA X (versión 11) de acuerdo con los criterios de verosimilitud bayesiana. Los árboles filogenéticos se realizaron por el método estadístico de árboles de Máxima Verosimilitud, con 1 000 réplicas.

Las secuencias de EF1-α se reportaron en NCBI con los números de acceso H-26: ON755274, H-30: ON755275, H-31: ON755276, H-49: ON755277 y H-50: ON755278; y las secuencias de Bloc con números de acceso H-26: ON734097, H-30: ON734098, H-31: ON734099, H-49: ON734100 y H-50: ON734101.

Producción de conidios, crecimiento del micelio y germinación

La producción de conidios y el crecimiento del micelio se registró bajo dos condiciones con variables de temperatura y humedad relativa (tabla 3). La primera simula

la temperatura promedio del clima tropical, específicamente de la zona de Nicoya de Costa Rica (en adelante, alta temperatura) y la segunda corresponde a las condiciones óptimas para el crecimiento de B. bassiana (en adelante, óptimo), ambas condiciones fueron preestablecidas en una cámara ambiental MLR-352H (Panasonic®).

Para cuantificar la producción de conidios, cada cepa se inoculó por esparcido y quintuplicado en agar PDA a partir de cultivos monospóricos y se incubaron por 15 días en cada una de las condiciones de cultivo. Luego del periodo de incubación a cada placa se le agregó aproximadamente 9 mL de agua destilada estéril con Tween 80 (0.1 %) para permitir una suspensión del mayor número de conidios. La suspensión resultante se homogeneizó en un mezclador vortex, se diluyó (10-2 conidios mL^-1) y se contaron los conidios en un hemocitómetro. Para la medición de la tasa de crecimiento de micelio, fragmentos del borde de colonias (5×5 mm) de un cultivo monospórico de 8 días de incubación, se inocularon por quintuplicado en el centro de la placa Petri (100 ×15 mm) con PDA y se incubaron en cada una de las condiciones de cultivo. El diámetro de la colonia de cada réplica se registró en mm cada 2 días, hasta cubrir toda la placa, con un periodo máximo de 25 días de incubación (^{Costa et al., 2021}; ^{Gerónimo-Torres et al., 2016}). La germinación de conidios se evaluó inoculando 3 µL de suspensión de 10-2 conidios en medio PDA y se incubó por 24 h en condiciones óptimas y alta temperatura, se consideró germinada cuando el tubo germinativo tenía el doble del tamaño del conidio.

Efecto de B. bassiana en el crecimiento de plántulas de tomate

Se utilizaron plántulas de tomate (Solanum lycopersicum, cultivar ‘Gladiador’) de un mes desde la siembra. Las semillas se germinaron a 32 °C y luego se cultivaron en invernadero a 28 °C y 45 % de humedad relativa. Para aplicar los tratamientos, las plántulas se sembraron en macetas de 100 mL en un sustrato de tierra con abono orgánico. Para el tratamiento con Beauveria spp., se le aplicó a cada plántula (n= 53), por el método de drench, 10 mL de una suspensión de 106 conidios mL^-1 en Tween 20 (0.1 %) de la cepa que mostró la mejor respuesta en la producción de conidios y en el crecimiento del micelio y se incubaron por 21 días en las condiciones de alta temperatura (tabla 3) en la cámara ambiental MLR-352H (Panasonic®). A la semana de incubación se realizó una segunda aplicación por aspersión foliar de 10 mL por plántula de la suspensión de conidios para procurar una distribución homogénea del hongo. Para el tratamiento control (n= 50), se siguió el mismo procedimiento aplicando agua destilada estéril y Tween 20 (0.1 %). La viabilidad de los conidios se determinó inoculando 3 µL de la suspensión en PDA e incubando a 25 °C por 24 h.

Después del periodo de incubación, se registró el desarrollo de las plántulas bajo los siguientes parámetros: número de hojas (NH), altura (A, cm), diámetro del tallo (D, mm), índice de esbeltez (IE, cm mm^-1), masa seca de la raíz (MSR, g), masa seca aérea (MSA, g), masa seca total (MST, g), relación de masa de raíz (RMR: relación de MSR a MST, %), relación de masa aérea (RMA: relación de MSA a MST, %), relación de raíz a superficie (RRS: MSRrelación a MSA, g g^-1) y tasa de crecimiento relativa (TCR, g g^-1 día^-1). El TCR se calculó con la siguiente fórmula:

TCR = (ln(MST ₂ ) - ln(MST ₁ ))/(t ₂ - t ₁ ) (ecuación 1),

donde MST₁ y MST₂ fueron MST inicial y final, respectivamente, y (t₂ - t₁) fue el tiempo de crecimiento. El MST inicial se midió 30 días después de la siembra, antes de aplicar el tratamiento a la plántula. Finalmente, se midió la masa foliar por área (MFA, kg m^-2) y el contenido relativo de agua de la hoja (CRA, %) de tres discos de hoja por plántula (n= 10).

Análisis de datos

La producción de conidios de las cinco cepas de Beauveria spp. en condiciones óptimas y de alta temperatura se evaluó mediante Kruskal-Wallis y la prueba de diferencia mínima significativa (LSD). El crecimiento del área de micelio (MA) en condiciones óptimas y de alta temperatura se evaluó mediante el análisis de covarianza (ANCOVA), por el siguiente modelo:

μ _ij = (μ+α _i ) + (β + γ _i ) ∙ x _ij + ε _ij (ecuación 2),

donde μ_ij es MA para una muestra j de condición i, x_ij es el tiempo (covariable) para una muestra j de condición i, μ es el intercepto y β es la pendiente de la relación entre MA y el tiempo para la condición óptima; α_i y γ_i son las diferencias en la intersección y la pendiente, respectivamente, entre las condiciones óptimas y de alta temperatura (i = 2), y ε_ij es el error para la muestra j de la condición j. Se realizó una extrapolación para estimar el área de micelio a los 25 días para las cepas H-26 y H-31, pues presentaron un crecimiento que cubrió toda la placa, pero no fue posible medir su crecimiento final. Finalmente, el efecto de la cepa aplicada en las plántulas de tomate en condiciones de alta temperatura y control se evaluó mediante una prueba t-student o de Wilcoxon. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el lenguaje de programación R, versión 3.6.1 (^{Equipo RCore, 2021}) con un nivel de significación de α = 0.05.

Identificación taxonómica

Todas las cepas fueron identificadas como Beauveria bassiana de linaje neotropical, excepto la cepa H-49 cuyo linaje es sudamericano (figura 2; relaciones de linaje según región intergénica Bloc en material suplementario).

Fuente: propia de la investigación

Figura 2 Árbol filogenético de cepas de Beauveria (H-26, H-30, H-31, H-49 y H-50) inferido mediante el método TN93+G basado en el factor de elongación-1 alfa (EF1-α). Los números en cada rama muestran los valores bootstrap para 1 000 réplicas. 

Producción de conidios, crecimiento del micelio y germinación

Las cepas H-30 y H-31 presentaron la mayor producción de conidios en ambas condiciones (óptima y alta temperatura, P<0.05; figura 3). Las cepas con los rendimientos más bajos en términos de producción de conidios fueron H-49 y H-50. En cuanto al desarrollo de micelio, todas las cepas en condiciones óptimas tuvieron la mayor tasa de crecimiento (P<0.01 análisis estadístico en material suplementario; figura 4), donde H-31 mostró la mayor tasa de crecimiento en ambas condiciones, con valores de 78.5 y 42.5 cm2 a los 25 días de incubación para condición óptima y alta temperatura, respectivamente. En cuanto a la germinación, para todas las cepas fue de 100 % luego de 8 h después de la inoculación.

Fuente: propia de la investigación

Figura 3 Comparación de la producción de conidios de 5 cepas de Beauveria bassiana (H-26, H-30, H-31, H-49 y H-50) bajo dos condiciones de temperatura: óptima y alta temperatura. Las letras iguales indican que no hay diferencia estadísticamente significativa entre las cepas para cada tratamiento (P>0.05, prueba de diferencia mínima significativa (LSD). El corchete indica la comparación entre condiciones de crecimiento para cada cepa mediante la prueba de Wilcoxon (α= 0.05). KW: Prueba de KruskalWallis; d.f.= 4, 70; *: P<0.05; ***: P<0.001, n. s.: no significativo; S. E.: error estándar.  

Fuente: propia de la investigación.

Figura 4 Crecimiento del área de micelio por tiempo de incubación para cinco cepas de Beauveria bassiana (H-26, H-30, H-31, H-49 y H-50) en dos condiciones de crecimiento: óptimo y alta temperatura. La línea negra sólida muestra el ajuste del modelo de regresión lineal del área de crecimiento del micelio (R2>0.98). La línea roja punteada presenta el estimado para el mejor ajuste del modelo a 25 días para H-26 y H31. S. E.: error estándar. 

Se ha documentado que B. bassiana puede crecer adecuadamente en temperaturas entre 25 y 30 °C; sin embargo, se ha reportado que conforme aumenta la temperatura, el rendimiento disminuye hasta el punto de detener el crecimiento a 35 °C (^{Alali et al., 2019}). En el presente estudio las cepas probadas mostraron una mayor tolerancia al sobrevivir 7 h al día a temperaturas entre 31 y 35 °C durante 25 días, destacando a H-31 como la mejor cepa en cuanto a producción de conidios y crecimiento de micelio. Otros estudios han demostrado la supervivencia de B. bassiana hasta 45°C en una prueba de 2 h, y mortalidad a 46°C para una prueba de 6 h (^{Fernández et al., 2008}). Al momento de causar la infección en insectos, las vías de propagación de los hongos son conidios, blastosporas y el micelio, esto debido a que estas estructuras aumentan la probabilidad de contacto (^{Wang et al., 2020}). Se conoce que en condiciones de campo la exposición a altas temperaturas es uno de los factores de estrés más determinantes que podrían afectar negativamente la germinación y el crecimiento de estos biocontroladores (^{Fernández y Bittencourt, 2008}), por lo que los resultados del presente estudio sobre el desarrollo de estas estructuras, demuestran que es viable obtener cepas autóctonas de B. bassiana con cualidades termo tolerantes para ser utilizadas en el control biológico de algunas plagas bajo altas temperaturas. Esto es útil para incentivar la aplicación en cultivos de zonas de clima tropical y también en escenarios de calentamiento global. Incluso, la temperatura fuera del óptimo podría estimular la producción de conidios, tal fue el comportamiento observado en las cepas H-26, H-30 y H-50.

Efecto de B. bassiana en el crecimiento de plántulas de tomate

De acuerdo con los resultados de producción de conidios y crecimiento de micelio en altas temperaturas, se utilizó la cepa H-31 para evaluar cambios en el desarrollo de plántulas de S. lycopersicum. A pesar de que no se presentaron cambios significativos en el desarrollo foliar (número y área), altura, diámetro y raíz y brote+hoja (tabla 4), se observaron cambios leves pero significativos en la partición de la raíz y la superficie (RMR, RMA y RRS), lo cual representa un ajuste marginal de +0.8 % entre el tratamiento H-31 y el control. Se destaca que el tratamiento donde se aplicó el hongo no mostró cambios físicos negativos visibles en las plántulas (coloración o deformación de hojas, brotes y raíces).

^{Raya-Díaz et al. (2017}) encontraron que a mayor tiempo de exposición de este hongo (93 días después de la siembra), se obtuvo un incremento en la longitud total de las raíces al hacer las aplicaciones de hongo sobre semillas, sustrato y hojas en comparación con el control. Por su parte, ^{Mantzoukas et al. (2021}) también demostraron un aumento en el crecimiento de las raíces sin dañar la planta de ninguna manera y ^{Kuzhuppillymyal-Prabhakarankutty et al. (2020}) reportaron una mayor tolerancia a la sequía en el maíz con hasta un 63 % de recuperación del vigor 24 h después del riego tras 10 días de sequía. En el contexto de esta investigación, se plantea la hipótesis de que si se extiende el tiempo de exposición al hongo se obtendrán mayores efectos en el crecimiento de órganos como las raíces, con posibles beneficios como una mayor absorción de agua (resistencia a la sequía) y nutrientes (^{Tall y Meyling, 2018}). Además, se podrían esperar efectos notables al conferir a las plantas resistencia a ciertas plagas en condiciones de campo (^{Russo et al., 2019}).

En cuanto al efecto endófito de este hongo, se sabe que se ha logrado una colonización exitosa cuando se aplica la cepa a la semilla (43.34 % después de 60 días en Corchorus olitorius; ^{Biswas et al. (2011})) y a la radícula (100 % después de 60 días en Theobroma cacao, ^{Posada y Vega (2005})). Sin embargo, en algunos casos este hongo puede establecerse como endófito, pero sin persistir en el tiempo; la asociación podría ser incluso cepa-específica (^{Brownbridge et al., 2012}). Para este estudio se plantea la hipótesis de que al inocular B. bassiana en plántulas de tomate no se evidenció una interacción significativa debido a que: i) requiere una etapa de inoculación más temprana en algunos momentos de desarrollo de la planta, es decir, radícula o semilla; ii) su establecimiento cesa poco tiempo después, o iii) la interacción del endófito es específica de la cepa.