Introducción

La resistencia a antimicrobianos (RAM) es un problema mundial, el principal factor de riesgo para el aumento de esta situación es el uso extensivo de antibióticos, tanto en veterinaria como en medicina humana. Las aves, silvestres y de corral, se han postulado como centinelas, reservorios o posibles organismos propagadores de bacterias resistentes a antibióticos (^{Beleza et al., 2024}). Las primeras bacterias multirresistentes de Escherichia coli observadas en la vida silvestre fueron aisladas en palomas, en la década de 1970 (^{Sato et al., 1978}). Posteriormente, diversos estudios han documentado el aislamiento de bacterias Gram negativas y especies de enterococos, provenientes tanto de aves silvestres como de cría, resistentes a antimicrobianos (^{Da Silva et al., 2012}; ^{Dolka et al., 2020}; ^{Radhouani et al., 2012}; ^{Smith et al., 2019}; ^{Stępień-Pyśniak et al., 2021}).

Los enterococos resultan de particular interés, debido a su condición de organismos ubicuos y tolerantes a condiciones ambientales extremas, además de su plasticidad genética, mediante la cual pueden intercambiar material genético (^{García-Solache y Rice, 2019}). Generalmente, se les considera bacterias comensales, aunque algunas especies son patógenas oportunistas, causan diferentes tipos de infecciones en humanos; así también pueden ser agentes causales de bacteriemias, meningitis y endocarditis (^{Cercenado, 2011}).

Los organismos vinculados con la salud pública han observado, con creciente preocupación, que los contaminantes antropogénicos originados por la liberación de metales pesados (MP) al ambiente, como resultado de los procesos industriales y la producción de desechos, principalmente urbanos, ha ido incrementando de forma constante. La mayor fuente de contaminación proviene de las emisiones de automóviles, la manufactura de pigmentos, pesticidas o herbicidas, minería, químicos, entre otros (^{Rebelo et al., 2021}). Todo esto ha generado una perturbación en el ambiente, no solo en organismos superiores, sino que también contribuyó a la aparición de microorganismos resistentes a antimicrobianos. En años recientes, diversos estudios sugieren que la aparición de bacterias resistentes a antimicrobianos podría surgir en el entorno por un fenómeno de corresistencia cruzada con MP (^{Aarestrup y Hasman, 2004}; ^{Fard et al., 2011}; ^{Rebelo et al., 2021)}. Ambas resistencias estarían enlazadas a los mismos elementos genéticos móviles (plásmidos, transposones e integrones). Los agentes antimicrobianos o sales de MP ejercen una presión selectiva sobre el microbiota, fenómeno que provoca la prevalencia de cepas resistentes ^{(Aarestrup y Hasman, 2004)}.

En la región de América Latina y el Caribe, la gestión deficitaria de efluentes industriales y cloacales de grandes centros urbanos, más el uso masivo e indiscriminado de antibióticos tanto en clínica como en producción animal y agrícola intensiva, son factores que contribuyen a la aparición de microorganismos resistentes. Adicionalmente, deben considerarse los ámbitos de la agricultura familiar campesina, ya que en dicha región esta actividad representa cerca del 81 % de las explotaciones agrícolas, lo que provee entre un 27 y un 67 % del total de la producción de alimentos y entre un 57 y un 77 % del empleo agrícola (^{Medina Pizzali et al., 2021}). Todo este contexto contribuye a generar ambientes muy propicios para la diseminación de RAM. Sin embargo, es mucho lo que se desconoce aún respecto de las rutas de transmisión a través del ambiente, en particular, en países de ingresos bajos y medianos, como la Argentina.

Las aves, específicamente las silvestres, por su capacidad de trasladarse a grandes distancias y su vinculación con núcleos urbanos, son consideradas potenciales reservorios y dispersoras de bacterias patógenas, al igual que de sus determinantes genéticos. El objetivo de este estudio fue evaluar la RAM y MP en cepas de Enterococcus spp. provenientes de hisopados fecales de aves de corral y silvestres de la comarca Valle Inferior del Río Chubut y Península Valdés (VIRCh-Valdés) de la provincia de Chubut, Patagonia, Argentina.

Metodología

Resultados

A partir de 250 muestras procesadas de hisopados fecales de aves de corral y silvestres de la zona del VIRCh y costera del noreste de la provincia de Chubut (Patagonia, Argentina), se logró aislar un total de 163 microorganimos, que presentaron los rasgos compatibles con el género Enterococcus(Cuadro 1).

Usando los cebadores específicos para especie, se identificaron 65 aislados como E. faecium, 32 como E. faecalis, 11 como E. hirae, 6 como E. mundtii, 4 como E. columbae, 2 como E. avium y 1 como E. durans, mientras que 42 no pudieron identificarse por PCR.

161 de los aislamientos (99 %) resultaron resistentes a níquel, cobre y zinc, mientras que 160 (98 %) y 156 (95.7 %) exhibieron resistencia a cromo y plomo, respectivamente. Ninguno de los microorganismos evaluados presentó resistencia a cadmio y mercurio (Cuadro 2).

Los resultados de los ensayos de RAM se muestran en el Cuadro 3y se presentan según la CIM como sensible, intermedio o resistente, según los puntos de corte estipulados. La vancomicina y gentamicina resultaron los antibióticos más efectivos, si los comparamos con el resto, solo 2 aislados exhibieron resistencia en ambos casos. Del total de microorganismos evaluados, se observó resistencia a ampicilina en 158 (96.9 %), 81 aislados presentaron resistencia a estreptomicina (49.7 %), mientras que 35 (21.5 %) resultaron resistentes a tetraciclina y solo 5 (3.1 %) mostraron un fenotipo de resistencia intermedia.

En el Cuadro 4, se presentan los resultados fenotípicos de distribución de RAM y MP, los cuales indican para cada especie la frecuencia y el porcentaje. A partir de lo obtenido, puede observarse una alta frecuencia de elementos resistentes a ampicilina, sola o combinada con otros antibióticos, y los MP evaluados.

Discusión

Analizando los resultados sobre la identificación molecular de los aislados, se observa que las especies más frecuentes fueron E. faecium, seguida de E. faecalis, tanto en aves de cría como silvestres. Estudios previos también fueron coincidentes con estos hallazgos, reportaron estas especies como las más frecuentes en animales de cría y silvestres (^{Rodríguez et al., 2013}; ^{Sharifi et al., 2015}), y, particularmente, en aves silvestres (^{Cagnoli et al., 2022}; ^{Radhouani et al., 2012}; ^{Stępień-Pyśniak et al., 2019}; ^{Torres et al., 2018}). Sin embargo, estos resultados son contrarios a los obtenidos por ^{Da Silva et al. (2012)} y ^{Dolka et al. (2020)}, quienes hallaron a E. columbae como la especie predominante en aislamientos provenientes de palomas.

Los microorganismos frecuentemente se encuentran expuestos a metales en sus hábitats y esta interacción puede ser beneficiosa o perjudicial. Basados en la utilidad que presentan para los organismos, los MP pueden clasificarse como ''micronutrientes esenciales'' y ''metales no esenciales''. El cromo, calcio, zinc, cobre, manganeso, hierro, potasio, magnesio, níquel, sodio y cobalto son considerados esenciales, porque están involucrados en diferentes procesos metabólicos fundamentales para los microorganismos. Estos metales juegan un papel importante en las reacciones rédox, como cofactores de enzimas y estabilizadores, al igual que tienen un papel en la regulación osmótica celular. En cambio, otros metales, como oro, plata, antimonio, cadmio, arsénico, plomo, aluminio y el mercurio no tienen ninguna función crucial en los procesos biológicos y, por lo tanto, se categorizan como no esenciales y extremadamente tóxicos para los microorganismos (^{Vats et al., 2022}).

La resistencia a MP y antimicrobianos es una característica esencial para la supervivencia de las bacterias en ambientes contaminados. En la mayoría de los casos, los genes que se relacionan con la resistencia a MP y algunos antibióticos comparten elementos genéticos móviles, como plásmidos, transposones e integrones (^{Da Silva et al., 2012}) y pueden intercambiarse entre microorganismos que conviven en ambientes contaminados. Trabajos previos han sugerido que la corresistencia no es un fenómeno fortuito, sino que está directamente enlazada a la presencia de estos elementos contaminantes en el ambiente (^{Rebelo et al., 2021}; ^{Vats et al., 2022}). En consecuencia, la presión selectiva natural impuesta por los MP puede seleccionar, de modo directo, la resistencia a diversos antimicrobianos (^{Aarestrup y Husman, 2004}; ^{Vats et al., 2022)}. Por otra parte, en la naturaleza, los MP, además, pueden actuar coseleccionando la RAM en bacterias, mediante la superposición de mecanismos fisiológicos, con lo cual se genera una resistencia cruzada ^{(Rebelo et al., 2021}; ^{Vats et al., 2022)}. Este mecanismo generalmente está conferido por bombas de eflujo, que no solo expulsan antibióticos, sino que también eliminan MP fuera de la célula bacteriana.

En la actualidad, hay abundante literatura sobre resistencia/tolerancia a MP en microorganismos provenientes de diversos hábitats; sin embargo, no existe una metodología estandarizada ni puntos de cortes consensuados para evaluar la susceptibilidad, como sí ocurre con los antimicrobianos. En consecuencia, se utilizó el procedimiento metodológico propuesto por el ^{CLSI (2022)}, para la evaluación de lo dicho, y los puntos de corte planteados por ^{Nies (1999)}, con el fin de definir la resistencia.

En este estudio, 161 microorganismos resultaron resistentes a níquel, cobre y zinc, y más del 95 % al cromo y plomo, resultados similares a los obtenidos por ^{Da Silva et al. (2012)} en palomas de zonas urbanas brasileñas. Tanto el zinc como el cobre se utilizan bajo la forma de óxidos o sales, por sus propiedades antimicrobianas y efectos favorables para el crecimiento en animales de cría (^{Aarestrup y Hasman, 2004}). Estos metales, como se mencionó, son considerados oligoelementos esenciales; no obstante, se incorporan a las dietas en exceso y la mayor parte no es retenida por el organismo, por lo que se acumula en suelos y aguas subterráneas (^{Vats et al., 2022}). Como iniciativa para mitigar los efectos negativos que provoca, tanto al rendimiento animal como al medio ambiente, la Unión Europea (UE) decidió prohibir el óxido de zinc a partir del 2022.

En ninguno de los microorganismos aislados se observó resistencia al mercurio y cadmio, a diferencia de lo obtenido por ^{Da Silva et al. (2012)}, quienes hallaron una baja tolerancia en Enterococcus sp. y relacionaron el fenómeno con ambientes contaminados por el uso de estas sustancias en la industria, agricultura, medicina, etc.

A partir del 2020, la UE, a través del grupo de expertos en asesoramiento antimicrobiano, ha elaborado una guía con la clasificación de ciertos antibióticos sobre la base de posibles consecuencias para la salud pública cuando se utilizan en medicina veterinaria. Con este propósito, los antibióticos se dividen en 4 categorías: 1) los que deben evitarse administrar y no están autorizados para medicina veterinaria (categoría A); 2) los que deben limitarse en su uso, debido a que tienen una importancia trascendental en la medicina humana (categoría B); 3) los que deben administrarse con precaución, ya que existen alternativas en la medicina humana (categoría C); y 4) los que deben administrarse con prudencia, al emplearse como tratamientos de primera línea, siempre que sea posible (categoría D).

Los glicopéptidos (vancomicina) son utilizados como la última opción para el tratamiento de infecciones nosocomiales causadas por enterococos, cuando las penicilinas no resultan eficaces, especialmente en pacientes inmunocomprometidos. En la UE, este tipo de antimicrobiano no está autorizado (categoría A) como medicamento veterinario en animales productores de alimentos y en animales de compañía se recomienda en circunstancias excepcionales. Los enterococos resistentes a múltiples fármacos, en particular a la vancomicina, son una causa importante de preocupación para la comunidad médica. El porcentaje de infecciones causadas por enterococos resistentes a vancomicina (ERV) se ha multiplicado por 20 durante la última década en los Estados Unidos (^{Torres et al., 2018}).

En Argentina, se han llevado a cabo numerosos estudios orientados a la caracterización de ERV; sin embargo, es poca o nula la información sobre la presencia de este grupo microbiano en aves de corral y silvestres. Coincidente con trabajos previos en aves silvestres de Brasil, Italia, Túnez y Portugal (^{Cagnoli et al., 2022}; ^{Da Silva et al., 2012}; ^{Yahia et al., 2018}), este estudio solo reveló resistencia a vancomicina en un aislado de E. faecalis y otro sin identificar en el nivel de especie, proveniente de calandria y gallina, respectivamente. Estos resultados contrastan con lo hallado por ^{Onaran et al. (2019)} en investigaciones llevadas a cabo en granjas turcas de engorde de pollos, quienes determinaron una alta frecuencia de ERV (van A y van B).

Los aminoglucósidos (categoría C, según la UE), como la gentamicina y estreptomicina, están autorizados en medicina veterinaria, tanto en Argentina como en otros lugares del mundo. Son un grupo de antibióticos que contienen aminoazúcares, detienen el crecimiento bacteriano mediante la acción sobre sus ribosomas y provocan la producción de proteínas anómalas. Su espectro terapéutico es muy amplio, pero, se ha limitado su uso por su potencial nefrotoxicidad y ototoxicidad.

Los resultados obtenidos de resistencia a gentamicina (alto nivel de resistencia) fueron bajos (1.2 %), a diferencia de lo hallado por ^{Da Silva et al. (2012)} y ^{Radhouani et al. (2012)}, quienes encontraron un 58.8 % de resistencia en palomas de regiones urbanas de Brasil y 20 % en E. faecium aislados de buitres de Portugal, respectivamente. Como contrapartida a lo anterior, el 50 % de los aislamientos de este trabajo exhibió un alto nivel de resistencia a estreptomicina, datos mayores si los comparamos con los de Radhouani et al. (2012) y ^{Cagnoli et al. (2022)}. La resistencia a este antimicrobiano en los enterococos se produce por cambios en la subunidad ribosómica 30S, que deriva en una baja de la unión de la estreptomicina. En general, la resistencia a altas concentraciones de estreptomicina implica resistencia solamente a este antimicrobiano, mientras que la resistencia a altas concentraciones de gentamicina implica también resistencia al resto de los aminoglucósidos más frecuentemente utilizados en clínica, con la excepción de la estreptomicina (^{Cercenado, 2011}).

La resistencia a ampicilina está ampliamente extendida en microorganismos de origen clínico, fenómeno detectado en diferentes partes del mundo (^{García-Solache y Rice, 2019}; ^{Torres et al., 2018}). En Argentina, ^{Rodríguez et al. (2013)} evaluaron la RAM, entre 1996 y 2010, de 1873 enterococos aislados, provenientes de infecciones intrahospitalarias y detectaron un 95 % de resistencia a ampicilina en E. faecium, especie que, además, ha aumentado su presencia desde el 2007, en estos ambientes.

Los resultados de esta investigación demuestran una elevada frecuencia de resistencia a ampicilina en los aislados de enterococos (98 %) y son coincidentes con lo hallado por ^{Radhouani et al. (2012)} y ^{Zhao et al. (2020)} en Enterococcus sp. provenientes de buitres comunes de Portugal y aves silvestres (patos, cuervos y gaviotas) de Houston, EUA, respectivamente. Sin embargo, estos datos contrastan con lo observado por ^{Cagnoli et al. (2022)}, ^{Dolka et al. (2020)} y ^{Smith et al. (2019)}, quienes detectaron un 13 % de resistencia a ampicilina en aves silvestres de Australia, 100 % de cepas sensibles provenientes de palomas mensajeras de Polonia y 5.83 % en avifauna de Italia, respectivamente.

Actualmente, los antibióticos pertenecientes a la familia de las tetraciclinas (categoría D) no se utilizan para el tratamiento de infecciones en humanos, pero este antimicrobiano, junto con la clortetraciclina, doxiciclina y oxitetraciclina, se utiliza para combatir enfermedades en animales de cría y como promotor del crecimiento, práctica que aumenta la resistencia (^{Torres et al., 2018}). En este estudio, se detectaron 35 aislados resistentes a tetraciclina, de los cuales 20 provienen de aves de cría, mientras que solo 5 presentaron una resistencia intermedia. Estos resultados son coincidentes con indagaciones efectuadas en microorganismos que provienen de aves silvestres de diferentes lugares (^{Da Silva et al., 2012}; ^{Dolka et al., 2020}; ^{Zhao et al., 2020}).

A partir del análisis fenotípico de los patrones de resistencia a tetraciclina y MP (Cuadro 4), se observa una alta frecuencia en los aislados pertenecientes a las especies E. faecium y E. faecalis, resultados similares a los obtenidos por ^{Da Silva et al. (2012)}. Por otra parte, en trabajos previos como el de ^{Sharifi et al. (2015)}, se demostró que el 100 % de las cepas de E. faecalis aisladas de fuentes humanas y ganaderas exhibieron patrones de resistencia a 2 o más antibióticos (entre ellos ampicilina) y metales como zinc, cobre, níquel, datos que coinciden con los obtenidos en este trabajo.

El cobre, junto con el arsénico y el mercurio, se encuentran entre los principales contaminantes metálicos históricos y contemporáneos, vinculados a actividades antropogénicas globales (^{Rebelo et al., 2021}). A diferencia del arsénico y el mercurio, el cobre es un cofactor esencial en reacciones enzimáticas intracelulares, sin embargo, es extremadamente reactivo y resulta tóxico en altas concentraciones. En consecuencia, los microorganismos han desarrollado diferentes mecanismos de detoxificación codificados genéticamente para mantener la homeostasis, entre ellos, proteínas transmembrana encargadas de su transporte ^{(Rebelo et al., 2021)}. Estos mecanismos están regulados por operones cromosomales, no obstante, en diferentes estudios se ha descrito resistencia adquirida a sales de cobre mediada por un plásmido (tcrB), con una alta presencia en especies de enterococos provenientes de animales de cría (^{Da Silva et al. 2012}; ^{Vats et al. 2022}). Si bien en este trabajo no se ejecutó la caracterización genética de los aislados, por los resultados obtenidos podemos inferir una elevada resistencia a cobre y los antibióticos evaluados, particularmente, ampicilina, estreptomicina y tetraciclina. Durante años, se ha considerado que los enterococos son indicadores de contaminación fecal y resistencia a los antibióticos, pero su metaloma, en gran medida poco explorado, impide comprender también su papel como bioindicador de contaminación por metales de origen antropogénico ^{(Rebelo et al., 2021)}.

La RAM en Latinoamérica es un problema de salud pública y motivo de alarma; las vías de transmisión se conocen parcialmente, debido a que la mayor parte de la labor investigativa se concentra en el ámbito hospitalario urbano. Por otro lado, la contribución a la resistencia de los factores ambientales, generalmente, solo se menciona en la producción animal a gran escala (^{Medina-Pizzali et al., 2021}). Si bien hay normas sobre el uso de los antimicrobianos en el campo clínico, la agricultura e incluso la cría de animales, no existe un marco regulatorio que considere o cuantifique los riesgos de la presión selectiva de los antibióticos en bacterias del ambiente. En parte, esto se debe al desconocimiento de cuáles son las concentraciones ambientales de los contaminantes emergentes, para estimular dicho proceso en bacterias resistentes (^{Barrantes-Jiménez et al., 2022}).

En la provincia de Chubut, se encuentra el VIRCh, considerado como uno de los sitios más importantes de la Patagonia, debido a sus características climáticas, número de productores, superficie cultivada y producción agrícola. Las principales actividades y complejos económicos de la región incluyen pesquería, turismo y ganadería ovina cuyo producto es el procesamiento de la lana, insumo primordial para el desarrollo de la actividad textil. La industria lanera en la Argentina comenzó a gestarse durante la primera mitad del siglo XX y se realiza mayormente en la ciudad de Trelew, donde existen lavaderos y peinadurías, aunque en otras épocas también existían establecimientos textiles en más ciudades de la comarca. La producción textil es una de las líderes en el mundo, en términos de contaminación. Este sector emplea una gran cantidad de productos químicos, que contienen MP como plomo, cromo y cobre, utilizados en la producción de pigmentos para tintes textiles. Antiguamente, no había un organismo estatal que se encargara del control de estas industrias en la zona del VIRCh; por años, los desechos sin tratamientos previos se volcaron en lagunas denominadas de estabilización, cercanas a la ciudad de Trelew. En la actualidad, existe una mayor regulación y un control ambiental de los residuos o desechos generados; sin embargo, aún se produce el volcado de efluentes de manera clandestina.

Todos los microorganismos aislados se evaluaron mediante técnicas fenotípicas para determinar su RAM, sin embargo, en un futuro se debería hacer un estudio molecular para detgerminar el tipo de resistencia (adquirida o intrínseca). De esta manera, sería posible abordar los orígenes de los determinantes de la resistencia a los antibióticos o MP, incluso, se podría rastrear la propagación de bacterias del ambiente nosocomial.

Conclusiones

La RAM es considerada por la OMS una de las 10 principales amenazas globales contra la salud pública, por lo que es necesario multiplicar los esfuerzos para enfrentar este problema, que impacta en los ámbitos humano, animal y ambiental. Los resultados de este trabajo muestran que existe evidencia de perturbación antrópica generada en áreas nosocomiales, industriales o establecimientos de cría de animales. El uso indiscriminado de antimicrobianos o la inclusión de antibióticos o metales como el cobre y el zinc en las dietas animales ejercen una presión selectiva sobre la población microbiana. En consecuencia, las aves pueden constituirse en un reservorio o agentes de dispersión de microorganismos resistentes. Los países latinoamericanos tienen diferencias socioeconómicas, existen disparidades en las condiciones de vida, como la falta de infraestructura y educación o el fácil acceso a los antibióticos, por lo que resulta perentorio abordar este asunto desde una perspectiva global que integre a múltiples sectores y disciplinas