Introducción

En la actualidad, la agricultura adopta estrategias orientadas hacia una producción agrícola sostenible, con un uso racional de los agroinsumos de síntesis química y alternativas de manejo del cultivo amigables con el medioambiente. Entre estas, se encuentran los bioplaguicidas, utilizados para el control de plagas y enfermedades, y los bioestimulantes, que maximizan el rendimiento en la producción mediante la mejora de la nutrición, la estimulación del crecimiento vegetal y la mitigación del estrés abiótico (^{Fenibo et al., 2021}; ^{Mannino, 2023}; ^{Meena et al., 2020}).

A causa de los costos de los agroquímicos y la transición hacia una producción sostenible, los productores han optado por emplear bioestimulantes en diferentes sistemas productivos en Colombia, con el fin de suplir las aplicaciones de fertilizantes químicos. Gracias a ello, se ha observado la reducción en los costos de producción con rendimientos similares, así como la recuperación de algunas de las características de los suelos (^{Pardo & Orbegozo, 2022}; ^{Rodríguez-Aristizabal & Lugo-Ramírez, 2023}). En este contexto, el fortalecedor vegetal Natibac^® SC, desarrollado por la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA), cuyo principio activo es la rizobacteria Bacillus subtilis Bs006 (familia Bacillaceae), ha evidenciado efectos promotores del crecimiento vegetal en diferentes especies de frutales y hortalizas (^{Beltrán-Acosta et al., 2023}; ^{Zapata-Narváez et al., 2024}).

No obstante, las características propias de cada agroecosistema, la presencia de plagas, la incidencia de enfermedades y los requerimientos nutricionales específicos requieren la aplicación de diferentes agroquímicos. Al introducir un bioproducto a base de microorganismos en el sistema productivo es indispensable que este logre establecerse en el suelo. Por ello, es pertinente determinar los efectos que pueden tener los diferentes agroquímicos utilizados sobre su viabilidad y así generar recomendaciones para la aplicación. Por tanto, el objetivo de este estudio fue determinar el efecto de diferentes agroquímicos utilizados en cultivos hortofrutícolas sobre el crecimiento de Bacillus subtilis Bs006, con el propósito de generar recomendaciones de uso en estrategias de manejo integrado.

Materiales y métodos

Este trabajo se realizó en la Planta Piloto de Bioproductos de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA), Centro de Investigación Sede Central, km 14 vía Mosquera, Colombia. Los agroquímicos se seleccionaron según su uso común en los cultivos para los cuales el bioproducto está registrado ante el Instituto Colombiano Agropecuario, específicamente a su aplicación en solanáceas y hortalizas de hoja.

Efecto de los agroquímicos sobre el crecimiento de B. subtilis Bs006

Se prepararon cajas de Petri con agar LB, inoculadas con 100 µl de una suspensión de B. subtilis Bs006 a una concentración de 1 × 10⁸ UFC/mL. Se distribuyó uniformemente sobre la superficie del agar utilizando un rastrillo Drigalski; posteriormente, se humedecieron con 20 µL del agroquímico a evaluar cuatro discos de papel filtro Whatman^® de 6 mm de diámetro y se ubicaron sobre la superficie de las cajas inoculadas en forma de cruz (^{Mormak & Casida, 1985}). Como control se utilizaron discos de papel filtro humedecidos en agua destilada estéril.

Las cajas se llevaron a incubación durante 72 horas a 28 °C, para después medir el diámetro de la zona de inhibición formada por cada tratamiento y determinar la sensibilidad de B. subtilis Bs006 a los agroquímicos. La comparación del crecimiento se realizó con una escala definida: 0: sin crecimiento bacteriano (incompatible); 1: zona de inhibición mayor a 5 mm (incompatible); 2: zona de inhibición inferior a 5 mm (parcialmente compatible), y 3: sin halo de inhibición (compatible). El porcentaje de inhibición se calculó mediante la ecuación 1 (^{Mormak & Casida, 1985}).

Resultados

El efecto de los fungicidas sobre el crecimiento de B. subtilis Bs006 fue dependiente de la dosis aplicada. Con dosis doble, el fungicida fluazinam fue el único que logró una inhibición del 100 %, mientras que clorotalonil, triadimenol-tebuconazol y cimoxanilo-propineb mostraron una afectación significativa, con valores que oscilaron entre un 58 y 67 %. En cambio, los fungicidas difenoconazol, propiconazol, azoxistrobina-difenoconazol, azoxistrobina, azoxistrobina-mancozeb y fludioxonil-ciprodinil presentaron un efecto menor, con porcentajes entre 19 y 45 % (Figura 1).

Figura 1 Inhibición del crecimiento de B. subtilis Bs006 por fungicidas. Laboratorio de la Planta Piloto de Bioproductos de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA). Octubre de 2024. 

The doses correspond to 2: twice the recommended dose, 1: the recommended dose, and 0.5: half the recommended dose. Bars with the same letter indicate no significant differences according to Tukey’s test (α = 0.05).

Cuando se utilizó la dosis recomendada, se mantuvo una tendencia similar. Los fungicidas fluazinam, clorotalonil, triadimenol-tebuconazol y cimoxanilo-propineb inhibieron el crecimiento en un rango entre 53 y 88 %. Sin embargo, difenoconazol, azoxistrobina-difenoconazol, azoxistrobina, azoxistrobina-mancozeb y fludioxonil-ciprodinil presentaron una menor actividad, con valores entre 12 y 32 % (Figura 1).

De manera particular, el clorotalonil a media dosis logró inhibir el crecimiento en un 63 % (Figura 1; Figura 2A). Sin embargo, fluazinam, triadimenol-tebuconazol, cimoxanilo-propineb, difenoconazol, azoxistrobina-mancozeb y fludioxonil-ciprodinil mostraron resultados entre 16 y 49 %. En contraste, los fungicidas azoxistrobina-difenoconazol y azoxistrobina no evidenciaron ningún efecto (Figura 1).

Figura 2 Vista macroscópica de la inhibición de crecimiento in vitro de B. subtilis Bs006 frente a fungicida y bactericida. A. Clorotalonil a una concentración del 50 %. B. Complejo de yodo a una concentración del 100 %. C. Control. Laboratorio de la Planta Piloto de Bioproductos de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA). Octubre de 2024. 

Respecto a los bactericidas, en presencia del complejo de yodo se observó la mayor inhibición del crecimiento de la bacteria en todas las dosis evaluadas, con valores entre 44 y 58 %. El ácido oxolínico y la gentamicina mostraron resultados moderados en las tres dosis, con rangos de 21 y 26 % y de 13 y 18 %, respectivamente. Sin embargo, en presencia de la oxitetraciclina-oxicloruro de cobre el crecimiento fue inhibido solo hasta en un 10 % y frente a validamicina A el crecimiento de la bacteria no fue inhibido por ninguna de las tres dosis (Figura 3).

Figura 3 Inhibición del crecimiento de B. subtilis Bs006 por bactericidas. Laboratorio de la Planta Piloto de Bioproductos de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA). Octubre de 2024. 

Con relación a los insecticidas, clorpirifos presentó la mayor inhibición del crecimiento de la bacteria con valores entre 27 y 69 % en todas las dosis. En el caso de spiromesifen, se observó un valor de 25 % cuando se aplicó el doble de la dosis, mientras que en la dosis recomendada y a media dosis no afectó el crecimiento de la bacteria, al igual que los demás insecticidas (Figura 4). Ninguno de los fertilizantes ni coadyuvantes afectaron el crecimiento de B. subtilis Bs006. De acuerdo con los resultados, el 75 % de los agroquímicos evaluados pueden ser considerados como compatibles con B. subtilis Bs006 (Natibac^®) (Cuadros 3 y 4).

Figura 4 Inhibición del crecimiento de B. subtilis Bs006 por insecticidas. Laboratorio de la Planta Piloto de Bioproductos de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA). Octubre de 2024. 

Discusión

En este estudio, los fungicidas como fluazinam, clorotalonil, triadimenol-tebuconazol y cimoxanilo-propineb, aplicados a dosis recomendada, afectaron significativamente el crecimiento de B. subtilis Bs006. El fluazinam actúa a través de un mecanismo específico que afecta la fosforilación oxidativa en las mitocondrias fúngicas (^{Magalon & Alberge, 2016}), lo que reduce la síntesis de adenosín trifosfato (ATP) y afecta críticamente todos los procesos dependientes de energía. Aunque este agroquímico se desarrolló para el control de hongos, los resultados sugieren que su exposición podría interferir con los procesos energéticos de B. subtilis Bs006. En bacterias, la fosforilación oxidativa ocurre en la membrana celular, por lo tanto, es posible que el fluazinam haya reducido la eficiencia de la producción de ATP, lo que explicaría la inhibición de crecimiento.

El clorotalonil, el triadimenol-tebuconazol y el cimoxanilo-propineb actúan sobre mecanismos involucrados en la síntesis y la funcionalidad de la membrana celular (^{Bitton et al., 1988}; ^{Shahid et al., 2021}). Aunque existen diferencias caracterizadas entre la composición de la membrana de hongos (ergosterol como componente dominante) y las bacterias grampositivas como B. subtilis (fosfolípidos, lípidos neutros y glicolípidos) (^{Koga et al., 1998}), los fungicidas tienen la capacidad de alterar los procesos de formación, reparación y funcionalidad de la membrana celular bacteriana (^{Sliti et al., 2024}).

La membrana es especialmente vulnerable a estos agroquímicos porque alberga los complejos de la cadena de transporte de electrones necesarios para la fosforilación oxidativa (^{Mitchell, 1961}). Cualquier daño que se produzca en ella altera simultáneamente múltiples funciones celulares fundamentales para la supervivencia y replicación bacteriana, como la síntesis de ATP, el transporte de sustancias, el mantenimiento de gradientes iónicos y la respuesta al estrés (^{Nagaraju et al., 2017}).

En contraste, fungicidas como dimetomorf, carbendazim, flutriafol, kasugamicina, tiabendazol, tiofanato-metilo y propamocarb-fenamidona no inhibieron significativamente el crecimiento de B. subtilis Bs006. Esta compatibilidad puede explicarse por mecanismos de detoxificación específicos en B. subtilis, una permeabilidad membranal reducida a estos compuestos, o por diferencias estructurales (^{Steinberg et al., 2020}). Por ejemplo, el carbendazim actúa interfiriendo con la polimerización de microtúbulos (proceso específico de eucariontes), por lo que bacterias grampositivas como B. subtilis, que carecen de esta estructura del citoesqueleto, son naturalmente resistentes a este mecanismo de acción (^{Yang et al., 2011}). De manera similar, el flutriafol y el tebuconazol son inhibidores específicos de la síntesis de ergosterol en hongos; al carecer B. subtilis de ergosterol en su membrana, estos agroquímicos no afectan fundamentalmente su viabilidad (^{Song et al., 2025}).

La reducción del crecimiento de B. subtilis Bs006 tras la exposición a bactericidas y fungicidas se ha relacionado con daños ultraestructurales en la membrana celular. Estudios en B. subtilis BC8 han observado el deterioro y la pérdida de viabilidad de las células mediante microscopía electrónica de transmisión y barrido. Esto se debe a los daños detectados en la pared y la membrana celulares, lo que modificó la integridad de la célula, particularmente en presencia de metalaxil y carbendazim (^{Shahid & Khan, 2022}). Asimismo, moléculas químicas como kitazin y hexaconazol ocasionan un efecto negativo al permear la membrana celular y permitir el ingreso de sustancias tóxicas al interior de la célula, lo cual interfiere con el metabolismo celular, provoca estrés oxidativo, altera el crecimiento bacteriano e incluso puede causar la muerte del microorganismo (^{Bitton et al., 1988}; ^{Nagaraju et al., 2017}; ^{Shahid et al., 2021}).

En presencia de agroquímicos del tipo antibióticos y desinfectantes, solo el complejo de yodo produjo una inhibición significativa de B. subtilis Bs006 (mayor al 40 %). Su mecanismo de acción, ampliamente estudiado, implica la penetración de la pared celular y su actuación como un potente oxidante, lo que provoca la precipitación de proteínas y la desnaturalización de ácidos nucleicos, procesos que conllevan la muerte celular (^{Diomedi et al., 2017}).

La baja inhibición del crecimiento de la bacteria en presencia de los antibióticos gentamicina y oxitetraciclina puede atribuirse a la elevada capacidad de supervivencia de B. subtilis, como previamente se ha descrito (^{Morawska & Kuipers, 2023}). Este comportamiento se explica por la activación de mecanismos sofisticados de supervivencia que le permiten tolerar la exposición a estos compuestos. Estos permiten cambios osmóticos transitorios o sostenidos que modifican la permeabilidad membranal; la inducción de un estado de dormancia inactivo (activo, pero no cultivable) que permite la supervivencia bacteriana incluso a concentraciones altas de antibióticos (^{Zhao et al., 2017}), y la activación de sistemas de defensa oxidativa y protección del ADN.

La compatibilidad total observada entre todos los fertilizantes y coadyuvantes evaluados y B. subtilis Bs006 tiene implicaciones prácticas relevantes. Los fertilizantes, especialmente aquellos con ingredientes activos como algas, aminoácidos quelados y extractos de plantas, mejoran las propiedades físicas, químicas y biológicas del suelo. Dichos insumos favorecen la proliferación de microorganismos beneficiosos como bacterias promotoras del crecimiento y hongos micorrízicos, y estimulan procesos fisiológicos en las plantas (^{Deng et al., 2025}; ^{Quintarelli et al., 2024}). Además, no representan una limitación para la aplicación conjunta con el bioproducto Natibac^®.

Se determinó que dieciocho fungicidas y cinco bactericidas fueron compatibles o parcialmente compatibles con B. subtilis Bs006. Esta compatibilidad parcial puede atribuirse a las respuestas de defensa de las células bacterianas frente al estrés ocasionado por los plaguicidas, principalmente mediadas por la producción de enzimas antioxidantes. Bacillus subtilis produce al menos nueve enzimas potenciales para eliminar peróxidos (^{Zwick et al., 2017}), así como catalasa y superóxido dismutasa (^{Angelini et al., 2023}; ^{da Cruz Nizer et al., 2024}). Estas enzimas pueden limitar significativamente el daño causado por especies reactivas de oxígeno y preservar la integridad de las membranas y macromoléculas (^{Ramsden, 2017}; ^{Rath & Das, 2025}).

Conclusiones

La inhibición del crecimiento de Bacillus subtilis Bs006 observada con varios de los agroquímicos evaluados se atribuyó principalmente a la toxicidad ejercida por ciertos productos sobre la bacteria. Compuestos como clorpirifos, cimoxanilo-propineb, triadimenol-tebuconazol, clorotalonil y fluazinam generaron los mayores niveles de inhibición. El resto ocasionó reducciones menores, lo que permitió establecer distintos grados de compatibilidad entre los agroquímicos analizados y B. subtilis Bs006, y valorar su uso conjunto según el nivel de inhibición registrado.

Los resultados de la compatibilidad de fertilizantes y coadyuvantes evaluados indican que no hubo afectación a su crecimiento. En este sentido, se demuestra la viabilidad técnica y científica de incorporar el bioestimulante Natibac^® junto con los agroquímicos que no afectaron el crecimiento de B. subtilis Bs006 para contribuir al desarrollo de sistemas de producción sostenibles.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no existen conflictos de intereses.