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Introducción
La vid es uno de los cultivos agrícolas más demandados e importantes del mundo. Perú se constituye en el proveedor exportador más dinámico y competitivo. Sin embargo, la calidad y el rendimiento en las uvas de mesa y vino se ven afectados por el moho gris (Botrytis cinerea Pers.), una de las enfermedades fúngicas más prevalentes durante la maduración y el manejo poscosecha (Li et al., 2020). El enfoque principal para el manejo de esta enfermedad es el control químico, lo que conlleva al desarrollo de resistencia del patógeno a fungicidas (De Miccolis Angelini et al., 2014). Por lo tanto, para el control de esta enfermedad, es necesario desarrollar enfoques alternativos a los fungicidas químicos con el uso de agentes de control biológico.
En este cultivo, diferentes agentes de biocontrol funcionan contra diversos patógenos. Entre los antagonistas, se tiene a los hongos endófitos de la uva con capacidad para reducir la colonización de microorganismos patógenos que causan enfermedades en su mismo cultivo (Aleynova et al., 2022). La resistencia inducida, la antibiosis y el parasitismo directo, son mecanismos de acción que pueden suprimir la actividad de los patógenos en las plantas hortícolas (Sánchez-Fernández et al., 2013). Sin embargo, se sabe poco acerca de los hongos endófitos que actúan contra B. cinerea en la vid.
El estudio de comunidades endófitas de uvas en el valle Cañete es de gran interés, debido que Vitis vinifera L. es considerado un sistema modelo de planta para estudiar la microbioma de cultivos leñosos perennes (Deyett & Rolshausen, 2020). Los endófitos son organismos que viven dentro de los tejidos de las plantas y, a menudo, forman asociaciones mutualistas que brindan efectos beneficiosos a sus huéspedes, sin causar ningún síntoma de enfermedad, por el contrario, fortalecen la defensa contra los factores bióticos (Fan et al., 2020). El establecimiento de una relación fúngica endofítica depende del genotipo del huésped y juegan un papel importante en la adaptación al hábitat de las plantas, lo que resulta en un mejor rendimiento de las plantas y en la protección contra el estrés biótico y abiótico (Lugtenberg et al., 2016)
Los hongos endófitos están siendo investigados en muchos cultivos, debido a su importancia en los patosistemas vegetales naturales, que son fundamentales para la biodiversidad y la conservación (Busby et al., 2016). Varios autores han investigado la diversidad y el papel ecológico de las comunidades endófitas en la vid (Aleynova et al., 2022; Cosoveanu et al., 2014; Deyett & Rolshausen, 2020; Fan et al., 2020; Kernaghan et al., 2017; Pancher et al., 2012; Reis Varanda et al., 2016; Stranska et al., 2022). Sin embargo, el conocimiento de la influencia de hongos endófitos en el desarrollo y/o prevención de ciertas enfermedades fúngicas es aún incompleto. Por lo tanto, el presente estudio se centra en aislar e identificar hongos endófitos asociados a plantas de vid (V. vinifera) con capacidad de antibiosis hacia B. cinerea.
Materiales y métodos
Muestreo y aislamiento de hongos endófitos
Se visitaron ocho lotes de producción de vid (Vitis vinifera) var. Italia en la provincia de Cañete, Lima, Perú, durante los meses de marzo, abril y mayo del 2022. De cada lote de producción se seleccionaron cinco plantas sanas de vid (de cuatro años de edad), con las mejores características vegetativas, para un total de cuarenta plantas. Por cada planta se extrajeron sarmientos (ramas con hojas) con tejido vegetal maduro (sarmientos leñosos) y joven (sarmientos de campaña), las muestras fueron rotuladas, depositadas en bolsas de polipropileno y llevadas al laboratorio de Sanidad Vegetal de la Universidad Nacional de Cañete (UNDC), para su procesamiento.
De cada rama (sarmiento), se tomaron tres hojas y tres trozos de tallos del tercio superior, medio e inferior; se cortaron pequeños trozos de hojas (1 cm2), secciones de tallos (1-1,5 cm de largo) o porciones (1 × 0,5 × 0,5 cm3) de las partes internas de los troncos, con seis trocitos por rama, doce por planta y sesenta por lote de producción. El aislamiento de hongos endófitos se realizó dentro de una cabina de bioseguridad, las secciones de tallos y hojas se desinfestaron en su superficie con hipoclorito de sodio al 2 % por 3 min, para eliminar los hongos epífitos, seguido de 1 min en etanol 70 % (v/v) y tres lavados con agua destilada estéril (ADE) (Abdelaziz et al., 2022; De Sousa Leite et al., 2013).
Las secciones de tejidos desinfestados fueron colocadas para su secado sobre papel toalla esterilizada. Luego, el material se cortó en fragmentos pequeños (0,5 cm2) y se transfirieron un total de 702 secciones de tejidos a cajas Petri con el medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA), con cloranfenicol (0,2 g/L) (Abdelaziz et al., 2022; Shankar Mane et al., 2018). Las cajas Petri sembradas fueron incubadas en oscuridad a 25 °C durante siete días, transcurrido este tiempo, se procedió a purificar las cepas hasta obtener un cultivo axénico.
Aislamiento e identificación de Botrytis cinerea
Se colectaron frutos de vid var. Italia con presencia de síntomas y signos del moho gris. Estos fueron llevados al laboratorio de sanidad vegetal de la UNDC. Con un bisturí estéril se extrajeron fragmentos de micelios con esporas de los frutos, estos se transfirieron en cajas de Petri con medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA), suplementado con antibiótico y se incubaron a 25 °C durante siete días. Luego, se realizaron tinciones con lactofenol azul de las estructuras vegetativas, de reproducción asexual y conservación. Bajo un microscopio se visualizó las estructuras para la identificación con las claves taxonómicas de Barnett y Hunter (1998), Barron (1968) y Watanabe (2002).
Identificación morfológica de hongos endófitos
Los cultivos axénicos de los hongos en PDA, se colocaron bajo luz artificial durante siete días para inducir la producción de estructuras reproductivas asexuales, para su identificación. Se observaron cada día las estructuras y las cepas que no lograron formar estructuras reproductivas se dejaron bajo luz hasta los 30 días. La identificación se realizó a nivel de género, con base en sus características morfológicas.
Se observaron las características culturales de la colonia tales como aspecto, diámetro, textura y coloración. Se realizaron tinciones con lactofenol azul de los cultivos y se observaron las características microscópicas: tipo y tamaño de las estructuras vegetativas y de reproducción. Las estructuras se visualizaron con un microscopio óptico binocular y con el uso de claves taxonómicas de Barnett y Hunter (1998), Barron (1968) y Watanabe (2002).
Prueba de antibiosis
La prueba de antibiosis se realizó con un diseño completamente al azar (DCA). Se extrajeron metabolitos secundarios solubles inhibitorios de veintiocho cepas de hongos endófitos, según la metodología empleada por Leon-Ttacca et al. (2022). De los cultivos jóvenes de HE (siete días de edad) se obtuvo una suspensión de esporas a una concentración de 1 x106 UFC/mL. En matraces con 100 mL de medio líquido de caldo papa dextrosa (CPD), se depositó 1 mL de la suspensión de esporas y se incubaron en un agitador a 110 rpm por siete días a 25 °C (tres repeticiones por cada cepa).
Transcurrido el tiempo de incubación, el micelio desarrollado en los matraces fue removido por filtración, se extrajo el filtrado en tubos falcón esterilizados y se centrifugaron a 3000 rpm por cinco minutos. El sobrenadante (15 mL del filtrado) se colocó en baño maría a 90 °C por una hora, luego se agregó un volumen igual de medio de cultivo PDA con 2x de agar al sobrenadante y se realizó la mezcla a una proporción 1:1 (v:v); después, se transfirieron 10 mL de la mezcla en cajas Petri de 60 x 15 mm. Para los controles (testigo) se realizó la mezcla con el filtrado del CPD. Un disco de 5 mm de medio PDA con micelio del patógeno se colocó en el centro de las cajas con los filtrados, se realizaron tres repeticiones por filtrado, estas fueron incubadas a una temperatura de 25 °C por tres días.
La evaluación se realizó cuando el patógeno colonizó completamente las cajas de los testigos a los tres días. Con ayuda de un vernier digital, se registraron las medidas del crecimiento radial de la colonia (mm) del patógeno en cuatro radios de las cajas. El porcentaje de inhibición micelial se calculó mediante la ecuación 1 (Kouipou Toghueo et al., 2016).
Donde I (%) es el porcentaje de inhibición del crecimiento micelial (radial), C la medida del crecimiento radial del patógeno en el control y T la medida de crecimiento radial del patógeno en presencia del biocontrolador.
Análisis de datos
Para analizar la relación entre las variables presencia o ausencia de cada uno de los géneros de hongos endófitos detectados por órganos (hojas y tallos) y ramas, se empleó la prueba no paramétrica Chi-cuadrado Pearson. Para la variable porcentaje de inhibición micelial, se realizó un análisis de varianza (ANDEVA) y la comparación de medias mediante la prueba de Scott-Knott (95 %) con el programa estadístico Infostat versión 2008 (Di Rienzo et al., 2008).
Resultados
Aislamiento e identificación de hongos endófitos asociados a plantas de vid
Del total de secciones procesadas de tallos y hojas de plantas de vid, en 129 (26,65 %) secciones crecieron hongos endófitos, de estos 96 se identificaron con base a sus características morfológicas, mientras que 33 cepas no formaron estructuras de reproducción, por lo que no fueron identificadas y se les denominó micelio estéril. Se identificaron los géneros de Cladosporium sp., Nigrospora sp., Fusarium sp., Trichoderma sp., Aspergillus sp., Penicillium sp., Stemphylium sp. y Alternaria sp. (Figura 1). La mayoría de las cepas identificadas presentaron estructuras de reproducción en menos de 6 a 7 días de incubación. Las cajas PDA produjeron un promedio de una colonia por sección de tejido de la planta.
Figura 1 Géneros de hongos endófitos identificados en Vitis vinifera L. 1, 5. Cladosporium sp. 2, 6 Nigrospora sp. 3, 7 Fusarium sp. 4, 8 Trichoderma sp. 9, 13. Aspergillus sp. 10, 14 Penicillium sp. 11,1 5. Stemphylium sp. 12, 16 Alternaria sp. a 100 X. Laboratorio de Sanidad Vegetal, Universidad Nacional de Cañete, Lima, Perú. 2022.
Frecuencias de géneros de hongos endófitos asociados a plantas de vid
Del total de las cepas aisladas de plantas de vid, el 74,42 % fueron hongos asexuales que se identificaron dentro de la clase de los Ascomicetos. Además, cuando se analizó el número de cepas aisladas de cada muestra de tejido, se demostró que su presencia fue diferente según el tipo de tejido analizado. Es así que, el 55,81 % fueron aisladas de rama madura y el 44,19 % de rama joven. Mientras que, el 57,36 % fueron de hojas y el 42,64 % de tallos. Los géneros Trichoderma y Alternaria fueron los más frecuentes con 22,48 % y 21,71 %, respectivamente; por el contrario, los géneros de Aspergillus, Cladosporium, Fusarium, Nigrospora, Penicillium y Stemphylium, se presentaron con menor frecuencia en plantas de vid con valores menores a 12,4 % (Cuadro 1).
Cuadro 1 Frecuencias absolutas y relativas de géneros de hongos endófitos asociados a ramas maduras y jóvenes, hojas y tallos de Vitis vinifera L. Laboratorio de Sanidad Vegetal, Universidad Nacional de Cañete, Lima, Perú. 2022.
| Géneros | Rama madura | Rama joven | Total | |||
| Hoja | Tallo | Hoja | Tallo | FA | FR (%) | |
| Alternaria | 13 | 2 | 6 | 7 | 28 | 21,71 |
| Aspergillus | 4 | 1 | 1 | 5 | 11 | 8,53 |
| Cladosporium | 3 | 1 | 1 | 11 | 16 | 12,40 |
| Fusarium | 0 | 0 | 1 | 3 | 4 | 3,10 |
| Micelio Esteril | 12 | 5 | 11 | 5 | 33 | 25,58 |
| Nigrospora | 3 | 1 | 1 | 0 | 5 | 3,88 |
| Penicillium | 0 | 1 | 0 | 1 | 2 | 1,55 |
| Stemphylium | 0 | 0 | 1 | 0 | 1 | 0,78 |
| Trichoderma | 15 | 11 | 2 | 1 | 29 | 22,48 |
| Total FA | 50 | 22 | 24 | 33 | 129 | 100 |
| Total FR (%) | 38,76 | 17,05 | 18,6 | 25,58 | 100 | |
La presencia de los géneros de los hongos endófitos varió según el tipo de órgano de la planta, ambas variables no fueron independientes (p=0,0005) y estuvieron relacionadas con los tipos de ramas (p=0,0009). Es así que, los géneros Trichoderma, Nigrospora y Alternaria, fueron los más frecuentes en ramas maduras, con 89,66 %, 80,00 % y 53,57 %, respectivamente. Mientras que Fusarium y Stemphylium fueron los más frecuentes en ramas jóvenes (100 %), seguido de los géneros Cladosporium y Aspergillus con 75,00 % y 54,55 %, respectivamente. A nivel hojas, la mayor presencia de cepas de hongos endófitos fueron los géneros Stemphylium, Nigrospora, Alternaria y Trichoderma, con valores superiores a 58,62 % en comparación con los géneros Penicillium, Fusarium, Cladosporium y Aspergillus, que fueron los más frecuentes en tallos con valores mayores a 54,55 % (Figura 2 y 3).
Figura 2 Frecuencia relativa porcentual de géneros de hongos endófitos aislados en ramas maduras y jóvenes de Vitis vinifera L. provenientes de lotes de producción de la provincia de Cañete, Perú. 2020.
Capacidad de antibiosis
Los metabolitos secundarios de cepas de hongos endófitos de V. vinifera, variaron en su capacidad de inhibir el crecimiento micelial de B. cinerea, con valores de 4,08 a 51,01 %. La cepa HEVH-01 del género Cladosporium fue la que presentó la mayor inhibición micelial de B. cinerea, seguida del género Alternaria (cepas HEVH-99 y HEVT-70), Aspergillus (HEVH-77) y Nigrospora (HEVH-13), con valor mayor al 40,74 % de inhibición, sin diferencias significativas entre dichas cepas. Los metabolitos secundarios extraídos de las cepas HEVT-51 y HEVT-71 del género Cladosporium, mostraron el menor efecto en la inhibición, al igual que las cepas de los géneros Fusarium (HEVH-69) y Penicillium (HEVT-04), con valores menores al 11,44 % de inhibición micelial, sin diferencias significativas entre las cepas (Figura 4). De igual forma, se observó que las cepas de los géneros Fusarium, Penicillium y Trichoderma, presentaron una menor inhibición micelial del patógeno; sin embargo, las cepas HEVT-88, HEVT-02 y HEVT-29 de los géneros mencionados, respectivamente, presentaron una ligera inhibición del crecimiento micelial de B. cinerea en medio PDA, con valores de 17,3, 21,76 y 25, respectivamente, en comparación con el testigo (sin metabolitos) (Figura 5).
Figura 4 Inhibición de metabolitos secundarios producidos por cepas de hongos endófitos sobre el crecimiento micelial de B. cinerea en medio de cultivo PDA a las 72 h de incubación. Laboratorio de Sanidad Vegetal, Universidad Nacional de Cañete, Lima, Perú. 2022.
Discusión
Este estudio reporta la microbiota endófita asociada a plantas de V. vinifera cultivadas en el Valle Cañete. Los tejidos vegetales están dominados por hongos asexuales, que representaron alrededor del 74 % del número total de cepas obtenidas. Se destaca que el número de cepas aisladas de las diversas partes de la planta no varió mucho entre las hojas y tallos, y entre las ramas jóvenes y adultas, así como se ha señalado en investigaciones anteriores (Aleynova et al., 2022; Casieri et al., 2009; González & Tello, 2011). La presencia de estos hongos en órganos específicos de la vid es probable que dependa del contenido de diferentes nutrientes, sales y metabolitos secundarios (Aleynova et al., 2022). Además, estos provienen del sistema de raíces y se mueven a través de vasos conductores hacia el tallo y luego hacia la hoja, pueden moverse sistémicamente y colonizar otros órganos de la planta (Deyett & Rolshausen, 2020).
En este estudio, las cepas de hongos endófitos habitaron los tejidos de la vid, pero la mayoría en las ramas maduras y hojas. También, estudios reportaron que el mayor número de aislamientos de hongos se detectó en las hojas (Aleynova et al., 2022; González & Tello, 2011) y que la comunidad de hongos endófitos tiende a expandirse con la edad foliar (López-González et al., 2017). Se reportó un mayor número de taxones en las hojas de plantas sanas de trigo en comparación con el resto de órganos analizados (Larran et al., 2000). En variedades de soja y maíz se aisló un mayor número de hongos endófitos de los tejidos del tallo (Russo et al., 2016). Los cambios en la diversidad de estos pueden estar relacionados con la fisiología foliar (Fan et al., 2020).
La mayoría de las cepas de hongos endófitos encontradas en V. vinifera, pertenecen a los géneros Alternaria y Trichoderma que habitan las hojas, y Cladosporium y Trichoderma en los tallos. Además, las cepas obtenidas en este estudio son consideradas endófitas de vid, así como Alternaria, Aspergillus, Penicillium, Fusarium y Cladosporium, fueron los géneros de hongos endófitos más abundantes que se detectaron en V. vinifera y otros cultivos (Fan et al., 2020; Sadeghi et al., 2019). Cepas de Alternaria fueron identificadas como endófitas en vid (Cosoveanu et al., 2014), mientras que la cepa A. verrucaria SYE-1 fue obtenida de la uva silvestre china (uva de Amur) (Li et al., 2020). También, se aislaron otros antagonistas fúngicos del género Trichoderma (González & Tello, 2011). Especies de Alternaria se presentaron con alta frecuencia (Kecskeméti et al., 2016; Pancher et al., 2012). En V. amurensis, Cladosporium fue uno de los géneros de hongos endófitos más comunes que habitaban tallos y hojas (Aleynova et al., 2022), lo que concuerda con los resultados de este estudio. Cladosporium también fue uno de los géneros que se aislaron con mayor frecuencia de las hojas de Glycine max (Gomes Fernandes et al., 2015). En cambio, Cladosporium cladosporioides fue reportado de manera esporádica en hojas sanas de Caesalpinia echinata Lam. (Feijó de Lima & da Silva Cavalcanti, 2014). En las hojas de Vaccinium dunalianum var. Urophyllum se reportaron mayor diversidad de hongos endófitos y el género Cladosporium fue encontrado en ramas (Li et al., 2016). Por consiguiente, se confirmaría que los géneros identificados en esta investigación son hongos endófitos.
Los metabolitos obtenidos de algunas cepas de los géneros Cladosporium, Alternaria, Aspergillus y Nigrospora, presentaron la mayor inhibición micelial de B. cinerea y se podrían considerar como posibles candidatos de biocontrol de enfermedades de la vid, así como cepas de A. verrucaria contra B. cinerea, controlaron el moho gris de la uva (Li et al., 2020), y A. alternata del mildiú velloso de la uva (Plasmopara viticola) (Musetti et al., 2006), y Alternaria sp. inhibió el desarrollo de B. cinerea (Cosoveanu et al., 2014). También, se reportaron especies de Alternaria como potenciales agentes de biocontrol de patógenos de plantas (Lou et al., 2013) y contra algunas plagas agrícolas (Sharma & Sharma, 2014). En otro estudio, se aislaron cuatro metabolitos secundarios antifúngicos de cultivos líquidos de Nigrospora sp. cepa LLGLM003, un hongo endofítico aislado de la planta medicinal Moringa oleifera Lam., y se demostró que la griseofulvina mostraba inhibición del crecimiento micelial de ocho hongos patógenos de plantas (Zhao et al., 2012).
En recientes investigaciones, el hongo endófito Aspergillus fumigatus, exhibió el 77 % de inhibición del crecimiento de A. flavus, también redujo la producción de aflatoxinas AFB 1 (Abdelaziz et al., 2022). De igual modo, especies de Aspergillus inhiben el crecimiento de varias especies de Phytophthora spp (El-Sayed & Ali, 2020). Cladosporium omanense se ha descrito como un nuevo hongo endofítico que tiene la capacidad de suprimir Pythium aphanidermatum (Halo et al., 2021).
La capacidad antimicótica puede atribuirse a la actividad de los metabolitos secretados (Brakhage, 2013). Esta supresión hacia B. cinerea podría prevenir la germinación de conidios y el crecimiento de micelio, como se reporta en esta investigación. También, se ha reportado que esos géneros poseen propiedades antifúngicas que son útiles contra una serie de enfermedades de las plantas (Brakhage, 2013; Cosoveanu et al., 2014; González & Tello, 2011; Leon-Ttacca et al., 2022). Se ha identificado una variedad de metabolitos bioactivos de A. verrucaria como productos naturales antimicrobianos, como las verrucamidas AD antibacterian (Sadeghi et al., 2019). Por consiguiente, las cepas aisladas de V. vinifera en el valle Cañete podrían ser posibles agentes de control biológico de patógenos de la vid y otros cultivos.
