Introducción

Colombia es el mayor exportador de uchuva (Physalis peruviana L.) a nivel mundial, alcanzó en 2021 valores de exportación por US$37 820 445, para una producción de 7872 toneladas para el consumo en fresco (^{Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, 2022}). La fruta se caracteriza por su exquisito sabor y aroma, además de presentar propiedades nutricionales y alto contenido de antioxidantes, ácidos grasos poliinsaturados y fitoesteroles (^{Puente et al., 2011}), con alto contenido de provitamina A, ácido ascórbico y vitaminas del complejo B (tiamina, niacina y vitamina B12); además de altos contenidos de proteína cruda, fósforo y hierro (^{Fischer et al., 2014}). Es considerada como una fruta deseada para el consumo en diferentes partes del mundo (^{Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, 2022}).

La uchuva es importante por su impacto social, ya que el 45 % de los costos de producción, incluidos la cosecha y la postcosecha, corresponden a mano de obra, en particular de mujeres cabeza de familia, por lo que aporta al desarrollo rural y fortalecimiento de la economía familiar campesina con importancia para la seguridad alimentaria (^{Ministerio de Agricultura y desarrollo Rural, 2022}).

Contar con plántulas de calidad es una condición que influye significativamente en el rendimiento del cultivo de uchuva (^{Martínez et al., 2008}), para lo cual es importante que durante la etapa de propagación en semillero se integren alternativas que contribuyan a mejorar la calidad agronómica y sanitaria. La inoculación de bacterias endófitas promotoras del crecimiento vegetal en plantas de interés comercial, tiene como objetivo reducir las aplicaciones de fertilizantes químicos y plaguicidas con potencial contaminante (^{Ambrosini et al., 2016}; ^{Blake et al., 2021}; ^{Grageda-Cabrera et al., 2012}; ^{Hamedi & Mohammadipanah, 2014}), que se enmarca dentro de procesos de producción sostenibles, que permiten reducir el tiempo de obtención de plántulas con características ideales para el trasplante y a bajo costo.

Conocer la diversidad microbiana y sus posibles aplicaciones en la agricultura es útil para llegar a medidas que puedan actuar como indicadores del crecimiento de las plantas, el rendimiento y la salud del suelo (^{Verma et al., 2017}). Las bacterias presentan una amplia adaptabilidad fisiológica y versatilidad metabólica, y su influencia en la rizosfera de las plantas es un componente importante en los agroecosistemas del suelo (^{Sturz & Christie, 2003}). Ciertas bacterias del microbioma rizosférico, además de estimular el crecimiento de las plantas, contribuyen con su adaptación a diferentes condiciones extremas y en mejorar la salud del suelo, así como la aptitud de las plantas a adaptarse al medio ambiente (^{Verma et al., 2017}).

Diversos géneros de bacterias se han identificado como rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (de sus siglas en inglés PGPR), de los cuales Bacillus y Pseudomonas son predominantes (^{Podile & Kishore, 2007}). Estas bacterias pueden promover el crecimiento de las plantas, ya sea de forma directa mediante la fijación de nitrógeno, la solubilización de fósforo, potasio y zinc, por la producción de sideróforos y fitohormonas como ácido indolacético, ácidos giberélicos y citoquininas, o indirecta a través de la producción de sustancias antagonistas, como la producción de antibióticos y enzimas líticas (^{Deketelaere et al., 2017}; ^{Glick, 2012}; ^{Olanrewaju et al., 2017}; ^{Tilak et al., 2005}). Estas características han contribuido al éxito de bioproductos basados en estas especies, no solo por su capacidad para promover el crecimiento de las plantas, sino también para reducir el uso de fertilizantes químicos y contribuir a la sanidad de los agroecosistemas (^{Olanrewaju et al., 2017}; ^{Tiing Lau et al., 2020}; ^{Tzec-Interián et al., 2020}).

Tanto Bacillus como Pseudomonas han demostrado características endófitas, ya que tienen la capacidad de colonizar el interior del tejido vegetal, un proceso crítico para la interacción entre microbios benéficos y plantas, que puede tener varios mecanismos que confieren efectos beneficiosos sobre el crecimiento del huésped como la fitoestimulación, la biofertilización y el biocontrol (^{Compant et al., 2010}; ^{Deketelaere et al., 2017}; ^{Mohamed Eid et al., 2019}; ^{Olanrewaju et al., 2017}). De acuerdo con lo anterior, una de las alternativas que podría integrarse en la etapa de producción de plántulas de uchuva es el uso de PGPR, con el fin de favorecer la emergencia temprana de las semillas y mejorar parámetros de crecimiento vegetativo en las plántulas (^{Caglar Kaymak, 2019}; ^{Hallmann et al., 1997}; ^{Podile & Kishore, 2007}).

En la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA) se desarrollaron estudios previos que permitieron aislar y seleccionar a partir de la rizosfera de plantas de uchuva, las rizobacterias Bacillus amyloliquefaciens cepa Bs006 y Pseudomonas migulae cepa Pf014, que en pruebas in vitro presentaron producción de ácido indol acético (AIA) e influyeron de forma positiva sobre la germinación de las semillas y el crecimiento de las plántulas de uchuva (^{Díaz et al., 2013}).

La colonización temprana de la rizosfera y la interacción directa con las plántulas de uchuva por parte de las rizobacterias seleccionadas no se han caracterizado y evaluado previamente. El objetivo de este estudio fue evaluar la actividad promotora de crecimiento vegetal y la capacidad endófita de las rizobacterias B. amyloliquefaciens Bs006 y P. migulae Pf014 inoculadas durante la etapa de semillero de uchuva.

Materiales y métodos

Localización

El experimento en condiciones de invernadero se realizó en el Centro de Investigación Tibaitatá, de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA), situado en el kilómetro 14, vía Bogotá - Mosquera, a 2600 m s.n.m., municipio de Mosquera, departamento de Cundinamarca, Colombia, con localización a 4º 42'de latitud norte y 74º 12'longitud oeste.

Material vegetal

Se utilizaron semillas de Physalis peruviana L. (uchuva) de la variedad Dorada, desarrollada y registrada por AGROSAVIA (^{Núñez Zarantes et al., 2016}). Los bioensayos se desarrollaron entre abril y mayo de 2018, bajo condiciones de invernadero (temperatura promedio 19,5 °C, humedad relativa promedio 64,3 %), ubicado en las instalaciones de AGROSAVIA, Centro de Investigación Tibaitatá, Mosquera.

Microorganismos

Las rizobacterias utilizadas se aislaron de la rizosfera de plantas sanas de uchuva presentes en focos de plantas con síntomas de marchitamiento vascular (Fusarium oxysporum f. sp. physali), en cultivos comerciales de los municipios de Combita departamento de Boyacá y Granada departamento de Cundinamarca (Colombia). Fueron identificadas como Bacillus amyloliquefaciens cepa Bs006, cuyo genoma fue secuenciado en su totalidad con base en el Illumina Hi ScanSQ System (^{Gámez et al., 2015}) y Pseudomonas migulae cepa Pf014 identificada mediante secuenciación de la subunidad 16s rARN (^{Díaz et al., 2013}), las cuales fueron suministradas por la Colección de Microorganismos con Interés en Control Biológico – AGROSAVIA (^{Uribe Gutiérrez et al., 2021}).

Fermentación líquida

Para la preparación de los inóculos de B. amyloliquefaciens cepa Bs006, la biomasa obtenida en una caja de Petri con agar nutritivo, se suspendió en 200 mL de caldo nutritivo contenido en Erlenmeyer de 500 mL. Los inóculos se dejaron en agitación a 150 rpm, 30 °C por 48 h. Se determinó la viabilidad con y sin choque térmico, mediante recuento en placa como control de calidad microbiológica final. Para la preparación de los inóculos de P. migulae cepa Pf014, se aplicó un procedimiento similar, con condiciones de incubación de 28 °C, agitación a 125 rpm durante 24 h y determinación de viabilidad mediante recuento en placa sin choque térmico.

La producción masiva de las rizobacterias se realizó en la Planta de Bioproductos de AGROSAVIA, mediante fermentación líquida en un biorreactor Infors® modelo Labfors 3. Para B. amyloliquefaciens cepa Bs006, se utilizaron 8 L de un medio de cultivo optimizado y codificado como JM (^{Díaz-García et al., 2015}), con un volumen de inóculo de 800 mL, con unas condiciones de fermentación controladas de 30 °C, con agitación y aireación de tipo escalón previamente estandarizadas, por 48 h. Para P. migulae cepa Pf014 se utilizaron 8 L de un medio de cultivo optimizado (^{Díaz et al., 2012}), con un volumen de inóculo de 800 mL, condiciones de fermentación controladas de 28 °C, a 125 rpm y aireación de 0,5 vvm, por 48 h.

Promoción del crecimiento vegetal

El bioensayo se realizó en bandejas plásticas de propagación de cincuenta alveolos (volumen de 113 cm³), con turba PRO-MIX® ref. PGX Sphagnum canadiense. Cada bandeja representó una unidad experimental. Se sembró una semilla de uchuva por alveolo. Una vez las plántulas presentaron dos hojas verdaderas (siete días después de la siembra), se inocularon 5 mL de una suspensión de rizobacterias con una concentración de 1x10⁸ UFC/mL. Se aplicaron dos refuerzos adicionales de las rizobacterias cada quince días. A todos los tratamientos se les aplicó una fertilización química con Irricol Inicio® 13-36-12, veintiún días después de la siembra.

Una vez que las plántulas alcanzaron una altura de 10 a 15 cm de altura (45 días después de la siembra), se tomaron cinco plántulas por unidad experimental. Las raíces de las plántulas se lavaron con agua de grifo. Se midió la longitud de la parte aérea y de la raíz (cm). Se contó el número de hojas y el área foliar (cm²) se midió con el software Image J®. Las plantas se secaron (raíz y parte aérea por separado) en un horno a 50 °C durante cuatro días, hasta conseguir peso constante para determinar la biomasa seca.

Endofitismo

Finalizado el ensayo, se tomaron tres plántulas y se lavaron con agua de grifo para remover las partículas de sustrato adheridas a la raíz. Las plántulas se dividieron en tres secciones: raíces, tallo y hojas, para conformar una muestra compuesta de 10 g de cada estructura. La desinfección de los tallos y hojas se realizó por inmersión en hipoclorito de sodio (1 %) (5 min), seguida de un enjuague en agua destilada estéril (1 min), un enjuague en etanol (70 %) (3 min) y tres lavados con agua estéril (1 min). Para la desinfección de raíces se siguió el mismo procedimiento, pero se excluyó el uso de hipoclorito de sodio (^{Lodewyckx et al., 2002}).

Las muestras desinfectadas de cada sección, se maceraron en un mortero con solución salina (0,85 %) y Tween 80 (1 %), la proporción de la muestra con el diluyente fue de 1:10. Con la muestra macerada se realizaron diluciones seriadas decimales hasta 10^-4 y se sembraron en superficie 100 µL de cada dilución en cajas de Petri con agar King B y agar nutritivo, respectivamente, estas se incubaron por 72 h a 28 °C. La concentración endófita se expresó en UFC/g muestra vegetal, solo se usaron las cajas con recuentos entre 20-200 colonias para asegurar reproducibilidad.

Diseño experimental

Se aplicó un diseño de bloques completos al azar con tres repeticiones. Los tratamientos evaluados fueron: B. amyloliquefaciens y P. migulae, estos aplicados en plántulas de 7 días y refuerzos a los 21 y 35 días, en concentración de 1x10⁸ UFC/mL. Se utilizó un control absoluto, en el cual no se inocularon las rizobacterias.

Análisis estadístico

Los datos experimentales se sometieron a un análisis de varianza y una prueba de comparación de medias entre tratamientos de mínima diferencia significativa (LSD) (p<0,05), se usó el programa estadístico SPSS® v.17.

Resultados

Promoción del crecimiento

En general, se observaron diferencias significativas con la aplicación de las rizobacterias y su interacción con plántulas de uchuva con respecto a las plantas no inoculadas (control). Sin embargo, con B. amyloliquefaciens Bs006 se obtuvo mejor respuesta del material vegetal, expresado como promoción de crecimiento (altura de plántula y biomasa seca) y área foliar.

Para la altura, las plántulas tratadas con las rizobacterias mostraron una mayor longitud (≥ 16 cm) con respecto al control, presentaron diferencias significativas; en tanto que, para la longitud de la raíz, aunque no se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos, presentaron mayor longitud las plántulas tratadas con las rizobacterias (≥ 17 cm) (Cuadro 1).

Cuadro 1 Peso seco (g) y longitud (cm) de plántulas de P. peruviana (Pp) inoculadas o no con B. amyloliquefaciens (Bs006) o P. migulae (Pf014), después de 45 días de crecimiento en semillero. Invernadero, Centro de Investigación Tibaitatá, Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA). Mosquera, Cundinamarca, Colombia. 2018. Table 1. Dry weight (g) and length (cm) of P. peruviana (Pp) seedlings inoculated or not with B. amyloliquefaciens (Bs006) or P. migulae (Pf014) after 45 days of growth in nursery. Greenhouse, Tibaitata Research Center, Corporacion Colombiana de Investigacion Agropecuaria (AGROSAVIA). Mosquera, Cundinamarca, Colombia. 2018. 

Con respecto al peso seco, las plántulas inoculadas con B. amyloliquefaciens Bs006 presentaron los mayores valores para el peso seco del tallo, hojas y raíz, fueron estadísticamente superior (p<0,05) al tratamiento inoculado con P. migulae Pf014 y aún más comparado con el control (Cuadro 1).

La aplicación de B. amyloliquefaciens Bs006 incrementó 58 % la longitud de los tallos, 16 % la longitud de la raíz, 119 % el peso seco aéreo y 178 % el peso seco de la raíz de plántulas de uchuva en comparación con el control. La aplicación de P. migulae Pf014 aumentó 45 % la altura, 23 % la longitud de la raíz, 57 % el peso seco aéreo y 70 % el peso seco de la raíz de plántulas de uchuva en comparación con el control.

Para el área foliar no se observaron diferencias significativas (p>0,05) entre los tratamientos (Cuadro 2), sin embargo, con la aplicación de B. amyloliquefaciens Bs006 se obtuvo el mayor incremento en el área foliar comparado con P. migulae Pf014 y el control en un 12 % y 11,4 %, respectivamente. En cuanto al número de hojas, B. amyloliquefaciens Bs006 mostró un incremento significativo de 1 a 1,4 hojas comparado con el control y con P. migulae Pf014, respectivamente (Cuadro 2).

Cuadro 2 Área foliar (cm²) y número de hojas de plántulas de P. peruviana (Pp) inoculadas o no con B. amyloliquefaciens (Bs006) o P. migulae (Pf014) después de 45 días de crecimiento en semillero. Invernadero, Centro de Investigación Tibaitatá, Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA). Mosquera, Cundinamarca, Colombia. 2018. Table 2. Foliar area (cm2) and number of leaves of P. peruviana (Pp) seedlings inoculated or not with B. amyloliquefaciens (Bs006) or P. migulae (Pf014) after 45 days of growth in the nursery. Greenhouse, Tibaitata Research Center, Corporacion Colombiana de Investigacion Agropecuaria (AGROSAVIA). Mosquera, Cundinamarca, Colombia. 2018. 

Endofitismo

Cuando se cuantificaron las bacterias al interior de las plántulas de uchuva y en las diferentes secciones en que fue dividida (raíz, tallo y hoja), se demostró que P. migulae Pf014 no es endófita en uchuva; en contraste, B. amyloliquefaciens Bs006 demostró capacidad endófita en todos los tejidos vegetales de uchuva, con un claro efecto de dilución acropétala (Figura 1). La concentración endófita promedio más alta se encontró en las raíces de la plántula con un valor de 8,16 x 10⁴ UFC/g, mientras que la concentración más baja se encontró en las hojas con un valor de 1,34 x 10² UFC/g.

Figura 1 Concentración endófita de B. amyloliquefaciens Bs006 en plántulas de uchuva (Physalis peruviana L.). Laboratorio Planta Piloto de Bioproductos, Centro de Investigacion Tibaitatá, Sede Central, Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA). Mosquera, Cundinamarca, Colombia. 2018.Las barras de error representan la desviación estándar, N = 10. Figure 1. Endophytic concentration of B. amyloliquefaciens Bs006 in cape gooseberry (Physalis peruviana L.) seedlings. Bioproducts Pilot Plant Laboratory,Tibaitata Research Center, Main Centre, Corporacion Colombiana de Investigacion Agropecuaria (AGROSAVIA). Mosquera, Cundinamarca, Colombia. 2018.The error bars represent the standard deviation, N = 10. 

Discusión

Los resultados obtenidos en el presente estudio demostraron que la aplicación de B. amyloliquefaciens Bs006 incrementó la longitud de la planta relacionado con tallo y raíz, la biomasa total y el área foliar (Cuadro 1), variables importantes en la calidad del material vegetal, con un aumento de 0,248 g en el peso seco aéreo y de 0,066 g en peso seco de la raíz de plántulas de uchuva, en comparación con el control convencional sin aplicación de microorganismos benéficos. El género Bacillus ha mostrado su alta capacidad de promoción del crecimiento vegetal en múltiples sistemas vegetales (^{Olanrewaju et al., 2017}; ^{Tiing Lau et al., 2020}; ^{Tzec-Interián et al., 2020}).

Los resultados obtenidos en el presente trabajo fueron similares a los reportados por ^{Xu et al. (2019)}, quienes demostraron que Bacillus sp. cepa CW16-5 aplicada a plantas de morera bajo condiciones de invernadero promovió el crecimiento vegetal en longitud de los brotes y en el peso fresco de la raíz con magnitudes de aumento del 83,4 % y un 217,7 %, respectivamente.

La aplicación de P. migulae Pf014 aumentó la longitud de la planta y la biomasa seca de plántulas de uchuva, en comparación con el control sin la aplicación de los microorganismos benéficos. Este incremento fue de 0,118 g en el peso seco aéreo y de 0,026 g en el peso seco de la raíz por cada plántula de uchuva. En ese sentido, al inocular Pseudomonas putida cepa PCI2 (10⁹ UFC/mL) en semillas de tomate durante 30 min, ^{Pastor et al. (2016)} obtuvieron aumentos del peso seco de brotes y raíces en 0,066 y 0,022 g, en comparación con plántulas sin inocular, cinco semanas después de sembrar las semillas. La inoculación de semillas con PCI2 aumentó el peso seco de los brotes de las plantas en 0,055 g y el peso seco de las raíces en 0,040 g, en comparación con un control inoculado con F. oxysporum.

La mayor área foliar presentada en el tratamiento con B. amyloliquefaciens Bs006, estuvo relacionada con el peso seco y le permitió a la plántula tener una capacidad fotosintética mayor por área, lo que ayuda a entender la acumulación de biomasa, lo cual es favorable en condiciones de campo con buen brillo solar para obtener mejor calidad, tamaño y maduración del fruto (^{Fischer & Melgarejo, 2020}).

En el presente trabajo, se demostró que B. amyloliquefaciens Bs006 presentó concentraciones endófitas entre 10² UFC/g y 10⁴ UFC/g en hojas y tallos de uchuva, respectivamente, densidades acordes con lo reportado en la literatura. Tanto B. amyloliquefaciens como P. migulae son habitantes naturales del suelo y es usual que las concentraciones de estas bacterias halladas en la rizosfera y el rizoplano estén en el orden de 10³ a 10⁶ UFC/g, según la especie vegetal y del ambiente en el que se encuentren (^{Hallmann, 2001}; ^{Hallmann et al., 1997}). Dentro de la primera a la tercera semana después de la siembra, la densidad de esta población, por lo general, aumentó a una capacidad de carga óptima de 10⁵ UFC/g y luego permaneció en este nivel durante el resto del período de crecimiento (^{Hallmann et al., 1997}). Después de entrar en las raíces, las bacterias endófitas pueden colonizar de manera sistemática los tejidos por encima del suelo (^{Hardoim et al., 2008}). Sin embargo, la densidad de población disminuye de manera acropetal, alcanza 10⁴ UFC/g en tallo y 10³ UFC/g en hojas. Órganos como flores, frutos y semillas son colonizados por cantidades aún menores de bacterias cultivables, incluso por debajo del límite de detección, que son solo una parte de la comunidad bacteriana endófita total (^{Hallmann & Berg, 2006}).

La aplicación de rizobacterias como B. amyloliquefaciens Bs006 y P. migulae Pf014 mejoraron el crecimiento de las plántulas de uchuva, lo que puede representar una alternativa de desarrollo biotecnológico y de manejo sustentable en etapas iniciales de semillero. Lo anterior debido a que la obtención de plántulas de buena calidad está relacionada con su mayor adaptación a condiciones de campo. La colonización endófita de tejidos, además, conlleva a una tolerancia al estrés biótico causado por fitopatógenos; por ejemplo, se demostró que B. amyloliquefaciens cepa SN16-1 inoculada en suelo donde crecían plantas de tomate, no solo promovió significativamente el crecimiento vegetal (altura de la planta, biomasa fresca y seca), sino que cambió de forma temporal la composición y diversidad de los microorganismos de la rizosfera nativa por su efecto sinérgico, además de tener un gran potencial biocontrolador de F. oxysporum con una eficacia del 55,5 % sobre la incidencia del marchitamiento vascular (^{Wan et al., 2018}).

Conclusiones

La inoculación de B. amyloliquefaciens Bs006 promovió el crecimiento (altura de tallo y longitud de raíz, el área foliar y el peso seco) de las plántulas de uchuva en condiciones de invernadero, con diferencias significativas sobre el tratamiento control sin la aplicación de microorganismos benéficos.

La aplicación de B. amyloliquefaciens Bs006 en semillero de uchuva, contribuyó a producir plántulas con mayor calidad fisiológica, así como a reducir el tiempo de obtención de plántulas óptimas para el trasplante a campo y su capacidad endófita, lo que podría permitir una mayor adaptabilidad a las condiciones de estrés biótico y abiótico.