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Introducción
El membrillo (Cydonia oblonga) es un árbol frutal nativo del sur de Europa y Asia, perteneciente a la familia de las rosáceas (Postman, 2009). Comercialmente es reconocido como una fuente dietética, ya que posee propiedades antioxidantes, además de propiedades antimicrobianas y antiulcerosas (Fiorentino et al., 2008; Silva et al., 2008).
Para la discriminación de los genotipos existentes de membrillo se han establecido descriptores de parámetros morfológicos basados principalmente en el tipo de ornamentación del gránulo de polen (Luque y Díez, 2002), ya que las características anatómicas del tallo, hoja y fruto son muy similares entre las accesiones, por lo que es difícil obtener una clasificación fiable (Toshiya et al., 2004). El número reducido de descriptores dificulta en algunos casos la separación de fenotipos en distintos grupos (Hebda y Chinnappa, 1990). Aunado a esto, la plasticidad fenotípica y la variabilidad genética de los caracteres utilizados pueden inducir a clasificaciones incorrectas, ya que las claves morfológicas suelen ser eficaces sólo para una etapa particular del desarrollo (Jarman y Elliott, 2000; Luque y Díez, 2002).
El uso de secuencias de ADN como sitios diagnóstico han evidenciado la existencia de algunas regiones del genoma que podrían comportarse de manera invariable en las poblaciones de una especie, a tal punto que se generen variaciones entre especies (Nicolalde et al., 2011).
En animales existen genes ampliamente estandarizados como códigos de barra para la determinación eficiente y precisa de especies. No obstante, en plantas la situación es más compleja, ya que se han propuesto una gran variedad de regiones del genoma para la identificación de especies vegetales, sin lograr obtener una secuencia que cumpla con las características de un código de barras de ADN (Pang et al., 2012).
El Grupo de Trabajo de Plantas en el Consorcio para el Código de Barras de la Vida (CBOL Plant Working Group, 2009), examinó la idoneidad de siete marcadores: tres espaciadores no codificantes (atpF-ATPH, trnH-psbA y psbK-PSBI) y cuatro regiones codificantes (matK, rbcL, rpoB y rpoC1), provenientes del genoma plastídico, con el fin de evaluar la capacidad de discriminación entre especies que presenten estas regiones.
El objetivo de este trabajo fue evaluar el uso del espaciador plastídico trnH-psbA y la secuencia codificante matKcomo posibles marcadores para la caracterización molecular en dos accesiones de membrillo (C. oblonga).
Materiales y Métodos
Extracción de ADN total, reacción de amplificación y secuenciación
La presente investigación se efectuó en el primer semestre del 2014 en el Centro de Investigación en Biotecnología del Instituto Tecnológico de Costa Rica (ITCR).
Se realizó la extracción de ADN total a partir de tejido foliar juvenil de dos accesiones de C. oblonga, "Golden" proveniente de Argentina y "Costarricense" presente en Costa Rica, utilizando el DNeasy plant extraction mini kit (Qiagen(r)). Se cuantificó la concentración y pureza del ADN mediante espectrofotometría determinando los valores de absorbancia a 260 nm y 280 nm.
Se realizaron reacciones de PCR de 25 μl utilizando el DreamTaq(tm) Master Mix 2X (Fermentas(r)); 1,5 ng de los oligos y 0,7 μl de ADN genómico. Para la amplificación del espaciador trnH-psbA se emplearon los oligos psbA3'f ytrnH, así como los oligos KIM3F y KIM1R para matK. Se determinó la temperatura de hibridación de los oligos mediante una prueba de gradiente de temperatura (∆T) entre 61 °C y 63,5 °C con aumentos de 0,5 °C para las reacciones del espaciador trnH-psbA, empleando un perfil térmico de 95 °C por 2 min, (94 °C por 30 seg, ∆T por 20 seg, 72 °C por 40 seg), por 35 ciclos, y entre 58 °C y 61 °C con aumentos de 1 °C para matK, utilizando un perfil térmico de 95 °C por 3,5 min (95 °C por 30 seg, 60 °C por 1,5 min, 72 °C por 2,5 min), por 35 ciclos. Los productos amplificados fueron enviados a la empresa Macrogen(r) (USA) para su secuenciación.
Análisis filogenético
Los productos de PCR secuenciados, fueron editados y ensamblados con el software bioinformático BioEdit(r) y CAP3(r) respectivamente, posteriormente fueron alineados junto con sus homólogos mediante la herramienta MUSCLE del EMBL-EBI. Se determinó el porcentaje de sitios variables y la distancia genética entre las accesiones empleando el modelo Tamura-Nei, el cual se basa en el número de sustituciones de bases entre las secuencias y la eliminación de posiciones con datos faltantes empleando el MEGA v6.0.
Resultados y Discusión
Extracción de ADN total, reacción de amplificación y secuenciación
De las extracciones de ADN total realizados a las dos accesiones de membrillo, se obtuvo una concentración media de 35,54 μg/ml con una relación promedio de A260/A280 de 1,76.
La relación promedio de A260/A280 obtenida, evidenció la existencia de contaminantes proteicos, los cuales presentaron altas absorbancias en 280 nm, debido probablemente, a la presencia de residuos de triptófano como lo informó (Glasel, 1995). No obstante, el valor de esta relación se encontró cercano al rango de 1,8 a 1,9 indicado por (Orozco et al., 2010), como ADN de buena calidad, razón por la cual no hubo problema con la reacción de amplificación.
Con respecto a las pruebas de optimización de las reacciones de PCR, se lograron bandas con mayor intensidad a temperaturas de 61,5 °C y 62 °C para trnH-psbA, mientras que para matK los mejores resultados se obtuvieron a los 60 °C y 61 °C (Figura 1).
Figura 1: Bandas obtenidas durante la optimización de la PCR para la amplificación del espaciador trnH-psbA (a) y matK (b) de C. oblonga. Centro de Investigación en Biotecnología (CIB), Instituto Tecnológico de Costa Rica. 2014.
Las secuencias Fasta de cada accesión editadas y ensambladas indicaron que el loci analizado de trnH-psbApresentó un producto amplificado de 384 pb, similar al reportado por (Lo y Donoghue, 2012) quienes obtuvieron 302 pb. Con respecto al porcentaje G+C de los locus en las accesiones en estudio fue de 28,9, congruente con el 25,16 obtenido por (Lo y Donoghue, 2012).
La secuencia matK presentó un tamaño de 832 pb y un porcentaje G+C de 33,2, similar al reportado por (Fazekas et al., 2008) quienes obtuvieron un dato promedio de 946 pb al realizar un estudio en 92 especies de plantas.
Análisis filogenético
Se determinó mediante una búsqueda BLAST en la base de datos del GenBank, que las secuencias obtenidas del locus trnH-psbA (KM456212 de "Costarricense" y KM456213 de "Golden") presentaron en promedio un 99% de identidad con la secuencia JQ390697.1. Los locus matK (KM456210 de "Costarricense" y KM456211 de "Golden") presentaron en promedio homologías de un 97,5% con las secuencias DQ860459.1, JQ390994.1 y JQ390995.1, accesiones de Cydonia oblonga correctamente identificadas en esta base de datos. No obstante, esta comparación no permitió hacer una separación de variedades o cultivares.
Los análisis de porcentajes de sitios variables y de distancia intraespecífica, evidenciaron que las secuencias del locus matK presentaron las mayores tasas de variación, seguido de la combinación multilocus trnH-psbA + matK(Cuadro 1).
