Introducción
La cebolla (Allium cepa L.) es uno de los cultivos más importantes de Costa Rica. Su producción satisface el consumo nacional y un porcentaje se destina a la exportación. La producción de este cultivo se concentra principalmente en la zona alta de la provincia de Cartago, en los cantones Central, Oreamuno y Alvarado, donde se ubican cerca del 79% de los productores, mientras que el porcentaje restante se distribuye entre las zonas de Santa Ana, Alajuela, Belén y Bagaces (Granados, 2005).
En Costa Rica, se estiman pérdidas económicas que rondan el 39% de la producción del primer ciclo de cultivo de la cebolla debido a la enfermedad fúngica conocida como pudrición blanca, que genera afecciones directamente en el bulbo. Esto hace que el control de esta enfermedad sea de vital importancia a nivel comercial (Granados & Wang, 2008; Rojas et al., 2010).
El cultivo de la cebolla se ve afectado por diversos patógenos causantes de pudriciones radicales, entre los que destacan Fusarium oxysporum f. sp. cepa, Sclerotium cepivorum, Pyrenochaeta terrestris y Pythium spp. (Herrera et al., 2012). Se ha reportado que la pudrición blanca en cebolla es inducida principalmente por el hongo Sclerotium cepivorum Berk, específico del género Allium y perteneciente al orden Mycelia sterilia (Herrera et al., 2008; Velásquez et al., 2011; Cortez, 2014).
Sin embargo, en otras hortalizas como lechuga, coliflor, repollo, cebolla, calabacín, apio, entre otras, se ha determinado que la pudrición blanca puede ser producida por otros hongos patógenos como Sclerotinia sclerotiorum y S. minor que son microorganismos capaces de formar esclerocios y desarrollar síntomas similares a los producidos por S. cepivorum (Granados, 2005; Pérez et al., 2009).
La particularidad de estos patógenos es que pueden persistir en el suelo hasta por 20 años, con un viabilidad promedio del 90%, gracias a la formación de estructuras resistentes llamadas esclerocios, que son además las estructuras reproductivas que funcionan como inóculo, tal es el caso del hongo Sclerotinia sclerotiorum (Granados, 2005).
S. sclerotiorum pertenece al filo Ascomycota, comúnmente habita el suelo, está distribuido mundialmente y afecta alrededor de 360 especies de plantas cultivadas, causando la enfermedad conocida como pudrición blanca o moho blanco (Smith, 2007).
Para la agricultura, esta enfermedad representa una gran amenaza, ya que prácticas como la rotación de cultivos no resultan eficaces, no existen variedades resistentes y el combate químico no es factible económicamente, porque se necesitan dosis muy altas que no aseguran una adecuada cobertura de los sitios de infección (Velásquez et al., 2011). Ante esta problemática, ha sido muy importante el apoyo al sector agrícola y el desarrollo de investigaciones con el fin de tener un mayor conocimiento de los agentes causales.
Con el fin de emplear estrategias más eficientes para la identificación, se han desarrollado diferentes investigaciones, como en el caso de S. cepivorum, mediante la detección molecular, amplificando las regiones ITS del hongo, lo que ha cobrado mayor importancia ya que representa una técnica más eficiente, específica y sencilla para su identificación tanto en muestras de plantas como de suelo (Cortez, 2014).
El objetivo de esta investigación se enfoca en el aislamiento e identificación del agente causante de la pudrición blanca en muestras de cebolla de la zona de Llano Grande, Cartago, mediante técnicas microbiológicas y el diagnóstico molecular.
Materiales y métodos
Localización y material experimental
Se tomaron muestras de cebollas que presentaron micelio de coloración blanca y esclerocios adheridos en la zona radical, en una finca ubicada en la zona de Varillal de Llano Grande, a 1850 metros sobre el nivel del mar (msnm). Las pruebas y procedimientos se llevaron a cabo en los laboratorios de la Escuela de Biología del Instituto Tecnológico de Costa Rica.
Aislamiento de los esclerocios
Los esclerocios fueron retirados de las cebollas cuidadosamente y se colocaron sobre una toalla de papel, luego se realizó un proceso de desinfección con hipoclorito de sodio al 3% durante 30 segundos, 1 minuto en alcohol al 70% y 2 minutos en agua destilada estéril. Se tomaron grupos de 10 esclerocios, se cultivaron en placas de Petri con medio de cultivo PDA acidificado y se incubaron durante siete días a 30 °C. Posteriormente, se seleccionaron esclerocios germinados y se transfirieron a placas de PDA acidificado y se incubaron a 30 °C durante 10 días.
Identificación microscópica
Para la identificación microscópica se tomó un segmento del micelio de los esclerocios germinados, se colocó en un portaobjetos con una gota de azul de lactofenol y se observó en el microscopio hasta un aumento de 100X. Los esclerocios formados en la placa de medio de cultivo se observaron en el estereoscopio.
Análisis molecular
Extracción de ADN
Se utilizó el kit Power Soil® DNA Isolation y se siguió el protocolo establecido por el fabricante. Se realizó una variante en el proceso de lisis, para lo cual las muestras se calentaron sin aditivo 1, posteriormente se adicionó a cada muestra el volumen de aditivo 1 y se procedió a realizar el proceso de calentado.
Amplificación del ADN
Se utilizaron las siguientes mezclas de reactivos para realizar la Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de cada muestra: 30,7µl de agua para PCR, 5 µl de Buffer Dream Taq 10X, 5µl dNTPs (2mM), 2µl de cada primer (10μM), 0,3 µl de Dream Taq polimerasa (5U/μl) y 5µl de la muestra. El volumen total de la reacción fue 50µl. Se utilizó el perfil térmico para primers universales del dominio Eukarya descrito por Gutiérrez et al. (2010). Se utilizaron los primers GC-FUNG y NS1 y agua destilada como control negativo. Los fragmentos de ADN amplificados se analizaron mediante secuenciación y se analizó la información obtenida con el propósito de encontrar diferencias o similitudes entre las muestras.
Resultados y discusión
Aislamiento e identificación de estructuras
El cultivo de los esclerocios del bulbo de la cebolla permitió el aislamiento del hongo Sclerotinia sclerotiorum, ya que el esclerocio produce micelio y el desarrollo de abundantes estructuras reproductivas (Figura 1).

Figura 1 Aislamiento de Sclerotinia sclerotiorum en medio de cultivo PDA mediante el cultivo de esclerocios extraídos de muestras de cebolla.
En la plantación de cebolla muestreada en Llano Grande de Cartago fue posible observar los diferentes síntomas característicos del desarrollo de la enfermedad. Entre estos se destacan primeramente el amarillamiento general de la planta, sobre todo cuando se inicia el proceso de bulbificación, así como la muerte descendente de las hojas externas, la aparición de una pudrición basal seca o ligeramente acuosa, paralelamente en las hojas inferiores y en las raíces la acumulación de micelio blanco y lanoso que produce esclerocios negros esféricos tanto en la superficie como de manera interna en los tejidos enfermos y que culmina con la pudrición completa del bulbo (Figura 2). La enfermedad se desarrolla a una temperatura de 16-20 °C y una humedad relativa menor al 90%, principalmente en suelos con alta humedad, ya que este es un factor de predisposición que favorece el desarrollo de la infección (Carranza, 2006).
El micelio blanco algodonoso con presencia de esclerocios oscuros de tamaño reducido obtenidos tras el cultivo de los esclerocios aislados del bulbo es característico de S. sclerotiorum. Según Pérez et al. (2009), una particularidad importante es el tamaño de los esclerocios, que son más grandes que los de S. minor, con un diámetro de entre 2 y 10 mm (figura 3). Las hifas que germinan a partir de esclerocios presentan anastomosis, un fenómeno que permite el intercambio por fusión entre ellas, lo cual lleva a observar la formación de fíbulas o clamps, por su nombre en inglés (Figura 3).

Figura 3 Estructuras vistas en el microscopio. A) Micelio de S. sclerotiorum, B) presencia de clamps en el micelio (100X), C) esclerocios observados en el estereoscopio.
Tras el análisis de los resultados de la secuenciación mediante herramientas bioinformáticas, se logró determinar que el hongo aislado corresponde a S. sclerotiorum con un 99% de identidad, descartando así que el patógeno causante de la pudrición blanca fuera Sclerotium cepivorum, que, según Granados (2005), es el patógeno causante de esta enfermedad con mayor incidencia en las zonas altas de Cartago; además, de igual manera, este hongo se caracteriza morfológicamente por un micelio blanco, la formación de esclerocios y clamps. A esto se le suma la similitud de la forma de infección en el cultivo y los respectivos síntomas presentes en la planta.