INTRODUCCIÓN

Entre 1992 y 2006, el Centro Agronómico Tropical de Investigación y Enseñanza (CATIE) y el Centro de Cooperación Internacional en Investigación Agronómica para el Desarrollo (CIRAD), en cooperación con el Programa Coo- perativo Regional para el Desarrollo Tecnológico y Modernización de la Caficultura (PROME- CAFE), desarrollaron 98 híbridos F1 de café, al cruzar variedades tradicionales de América Central (Caturras, Catuaí, Sarchimores) con accesio- nes silvestres de Etiopía y Sudán, con lo que se aprovechó la vasta colección de café del CATIE. El propósito del trabajo era producir híbridos que mostraran una combinación de las características sobresalientes de las variedades tradicionales, tales como su productividad y arquitectura, con las cualidades organolépticas y tolerancia a enfermedades de las accesiones silvestres. Luego de más de 15 años de evaluaciones en Améri- ca Central, fueron seleccionados y liberados 6 híbridos con base en su productividad, -20-58% más que las variedades tradicionales-, calidad de taza, y tolerancia a ciertas enfermedades y plagas, entre otros atributos (^{Bertrand et al. 2011}, ^{FONTAGRO 2005}, ^{Georget et al. 2017}, ^{Quijano 2007}), 3 de los cuales fueron utilizados en el presente trabajo.

Dada su condición altamente heterocigota, los híbridos F1 sólo deben ser propagados vege- tativamente. La técnica tradicional utilizada para su propagación ha sido la embriogénesis somática (^{Etienne-Barry et al. 1999}), pero sus altos costos de producción (hasta US$3 por planta) han sido un obstáculo para lograr una mayor disemina- ción de los híbridos al sector cafetalero. Por esta razón, en el 2014 el CATIE inició un programa de multiplicación mediante estaquillas enraizadas, al combinar el uso de “plantas madre” producidas SOSA-MORA et al.: Enraizamiento de tres híbridos F1 de café (Coffea arabica) 179 en laboratorio, con la técnica de enraizamiento de estaquillas a partir de estas. Las plantas madre producidas in vitro son establecidas en jardines clonales hidropónicos para la producción con- tinua de rebrotes, que son cosechados periódi- camente y puestos a enraizar. De esta manera, cada planta madre puede producir 24-30 nuevas plantas cada año, a lo largo de 3 a 4 años (^{Mesén y Jiménez 2016}), lo cual logra una reducción con- siderable en costos y tiempos de producción con respecto a la técnica de embriogénesis somática. En promedio, las estaquillas tardan 40 días en enraizar y su costo es de alrededor de un 10% del de una planta producida en el laboratorio. El proceso de reproducción de plantas por estaqui- llas ha sido relativamente exitoso, pero aún existe margen de mejora, enfocado a optimizar los por- centajes de prendimiento y reducir los tiempos de producción tanto en la fase de enraizamiento como en la fase de vivero.

El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto del ácido indolbutírico (AIB), un inoculan- te biológico y Pyraclostrobin (F-500), tanto solos como combinados, más un tratamiento conven- cional de enraizadores y estimuladores (usado en la actualidad por el programa de propagación del CATIE), sobre la capacidad de enraizamiento de estaquillas y crecimiento inicial en vivero de 3 híbridos F1 de café. El inoculante biológico estaba compuesto por hongos como Trichoderma viride, T. koningii, T. harzianum y T. polysporum, además, de bacterias como Bacillus subtilis, B. laterosporus, B. licheniformus, B. megaterium, B. pumilus y Paenibacillus polymyxa, que se promociona como estimulante de la germinación de semillas por aumentar el volumen y desarrollo del sistema radicular, y promover la absorción efi- caz de nutrientes (^{CustomBio 1992}). El Pyraclos- trobin (F-500) ha mostrado tener un efecto en el metabolismo de las plantas, lo que resulta en una mayor producción de biomasa (^{Kanungo y Joshi 2014}). Se ha reportado su efecto como promotor de la tasa fotosintética en hojas tratadas (^{Köehle et al. 1997}, ^{Grossman et al. 1999}, ^{Häuser-Hahn et al. 2004}, ^{Oerke y Dehne 2004}) y con efectos positivos sobre la productividad en trigo, maíz (^{Nelson y Meinhardt 2011}), soya (^{Henry et al. 2011}, ^{Hill et al. 2013}) y otros cultivos (Kanungo y Joshi 2014).

Los híbridos incluidos en el estudio fue- ron el L4A5, el L2A30 y el L12A28, conocidos comercialmente como Esperanza, H2 y Milenio, respectivamente.

MATERIALES Y MÉTODOS

La investigación se realizó en las ins- talaciones del Banco de Semillas Forestales del CATIE, ubicado en el cantón de Turrialba, provincia de Cartago, Costa Rica, del mayo a diciembre del 2016. El sitio se ubica dentro de la zona de vida del bosque pre-montano muy húmedo (^{Bolaños et al. 2005}), a una altitud de 646 msnm, con una temperatura media anual de 21ºC y una precipitación media anual de 2593 mm (^{CATIE 2016}).

Híbridos incluidos

Para el estudio se utilizaron 3 híbridos seleccionados por el Programa de Café del CATIE: el L4A5 (“Esperanza”), el L2A30 (H2) y el L12A28 (“Milenio”). El híbrido L4A5 se originó del cruce entre Sarchimor T5296 y Etío- pe 25. Es un híbrido muy vigoroso, recomenda- do para altitudes de 800-1500 msnm. El híbrido L2A30 es el resultado del cruce de Caturra 9 x Etíope 15, de muy alta producción a altitudes superiores a los 1200 msnm. El híbrido L12A28 es el resultado del cruce de Sarchimor T5296 x un Rume Sudan. Ha dado muy buenos resultado de adaptación y productividad a altitudes de 800-1500 msnm, con calidad de taza similar o mejor que Caturra y Catuaí cuando se plantan en condiciones agroecológicas similares, ade- más, de una productividad excepcional (^{Mesén y Jiménez 2016}).

Fase de enraizamiento

Las plantas madre fueron producidas por embriogénesis somática en el Laboratorio de Biotecnología del CATIE (^{Etienne-Barry et al. 1999}) y se establecieron en camas hidropónicas con medio sólido. Las camas tenían una profun- didad de 18 cm, un ancho de 1,2-1,5 m y longitud variable, ubicadas a 80 cm del suelo, dentro de invernaderos plásticos cerrados. Como sustrato de las camas se utilizó una mezcla de grava (0,5 -1 cm diámetro) y fibra de coco en proporción 70:30, respectivamente. A lo largo de las camas se colocaron mangueras de goteo con una sepa- ración de 10 cm entre sí y las plantas madre se establecieron a una densidad de 10 x 10 cm. La fertilización de los jardines clonales se realizó tanto mediante el sistema de riego por goteo, a través aplicaciones foliares y al sustrato, según el esquema descrito por ^{Mesén y Jiménez (2016}). A partir de las plantas madre se hicieron laS cosechas de rebrotes para la preparación de las estaquillas, una vez que formaron 3 nudos (una altura de aproximadamente 6-8 cm). Los rebrotes se cortaron con tijeras podadoras y se trasladaron de inmediato al área de propagación sumergidos en recipientes con agua a 25ºC.

Una vez en el área de propagación, se pre- pararon las estaquillas de 5-7 cm de longitud, se cortaron justo arriba del tercer nudo y podaron las 4 hojas de cada estaquilla para dejar 2,5-3 cm2 de cada hoja. Las estaquillas preparadas se iban depositando en otro recipiente con agua y, de ahí, se tomaron para hacer la aplicación de los dife- rentes tratamientos con auxinas y los productos a evaluar. Se evaluaron 9 tratamientos, detallados en el Cuadro 1.

Como sustrato de enraizamiento se uti- lizaron pellets “Jiffy” de 2 cm de diámetro por 4,5 cm de altura, colocados en bandejas de 200 celdas. Luego de las aplicaciones respectivas, las estaquillas se insertaron una profundidad de aproximadamente 1,5 cm en los pellets.

Para el enraizamiento, las bandejas con las estaquillas fueron colocadas en cámaras cerradas a manera de mini túneles, que consis- tían de un marco metálico de 3 m de largo, 1 m de ancho y 60 cm de altura, con malla metálica en la base y con patas para dar una altura de 80 cm desde el suelo. Las cámaras fueron forradas en su totalidad con plástico, incluyendo la base, e internamente se colocaron 3 aspersores para irrigación en el techo de la cámara. Las paredes laterales colgaban a manera de cortina para permitir el acceso al material o realizar las apli- caciones y evaluaciones. El riego dentro de las cámaras se realizó de manera automatizada, con aspersiones de 36 segundos cada 2 horas, entre las 7 am y las 3 pm. Además, se proporcionó sombra al área de enraizamiento con sarán del 50%. La temperatura y humedad relativa den- tro de las cámaras se mantuvo entre 21-27°C y 85-90%, respectivamente, a lo largo de toda la fase de enraizamiento.

Al final del enraizamiento se les dio un periodo de aclimatación a las estaquillas, que consistió en elevar las cortinas de los túneles de manera permanente para bajar la humedad relati- va, durante 5 días, antes de su trasplante a bolsas para la fase de vivero.

Fase de vivero

Para la fase de crecimiento en vivero, las estaquillas ya aclimatadas, fueron trasplantadas a bolsas plásticas de almácigo de 9x20 cm, llenas con una mezcla de sustrato de 80% suelo negro de bosque, más 20% de granza de arroz, y se mantuvieron durante 3 meses en invernaderos con techo transparente, con riegos una vez al día. A cada bolsa se aplicó el paquete básico de fertilización para almácigo, recomendado por el ^{ICAFE (2011}), que consistió en aplicar men- sualmente junto al borde de la bolsa 2 gramos de fertilizante (NPK) de la fórmula 10-30-10. No se realizaron fertilizaciones foliares ni se aplicó nin- gún tipo de químico adicional. Durante los meses que duró la fase de vivero, la humedad relativa se mantuvo entre 85 y 90%, la temperatura entre 18,6 y 30,4ºC y la luminosidad entre 13,5 y 16,2 MJ m-2, según datos de la Estación Meteorológi- ca del CATIE (CATIE 2016).

Diseño experimental, variables y análisis estadístico

Para la fase de enraizamiento se utilizó un diseño irrestricto al azar con arreglo de trata- mientos en parcelas divididas, donde las parcelas grandes fueron los tratamientos a evaluar y la parcela pequeña los 3 híbridos, con 4 repeticiones y unidades experimentales de 15 estaquillas.

Las variables evaluadas durante la fase de enraizamiento fueron:

porcentaje de sobrevivencia.

porcentaje de plantas que enraizaron sema- nalmente, se tomó como planta enraizada aquella que mostrara una o más raíces emergiendo a través del Jiffy.

tiempo requerido por las estaquillas para la emisión de raíces.

número y longitud mayor de raíces por estaquilla.

pesos frescos y secos de raíces y parte aérea.

Para la evaluación de las variables 'd’ y 'e’ se utilizó una única muestra destructiva de 4 plantas por combinación de tratamiento x híbrido al final de la fase de enraizamiento. Para la obten- ción del peso seco, las muestras fueron secadas en estufa a 65ºC por 24 horas.

Para la fase de vivero se utilizó un diseño similar al anterior, con 4 repeticiones y unidades experimentales de 8 estaquillas, se considera la reducción por los análisis destructivos y mortali- dad durante la fase previa.

Las variables evaluadas durante esta fase fueron: a) altura de las plantas, b) diámetro al cue- llo de raíz, c) número de hojas totales, y d) peso seco de la parte aérea y raíces, basado en una muestra destructiva de 4 plantas por combinación tratamiento x híbrido. En este caso, se realizó una sola evaluación luego de 3 meses de crecimiento en vivero.

Los datos se analizaron mediante Análisis de Varianza, y en caso de encontrarse diferencias, se procedió a realizar pruebas de LSD (5%) para la comparación de medias de tratamientos. Para datos de porcentaje se utilizó la transformación arcsen √%. Para los datos que no cumplieron los supuestos básicos y brindaron datos no paramé- tricos, se procedió a realizar la prueba no para- métrica Kruskal Wallis (=0,05).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La aparición de raíces a través de los pellets, se inició en la semana 6, y al término de 11 semanas, todas las estaquillas vivas habían emitido raíces, con lo cual se dio por finalizada la fase de enraizamiento. No hubo diferencias entre tratamientos ni entre híbridos para por- centaje de enraizamiento, con valores superiores a 71% en todos los casos y un promedio global de 86,36% (Cuadro 2). Los altos valores obte- nidos demuestran que, con cuidados y técnicas adecuadas, los híbridos pueden ser fácilmente propagados mediante la técnica de enraizamiento de estaquillas.

Un tema central en el enraizamiento de estaquillas con hoja es que, al carecer de raíces durante los primeros días o incluso semanas, fácil- mente pueden desarrollar déficits hídricos, lo que les causa marchitez e incluso la muerte (^{Grange y Loach, 1983a},b; ^{Leakey 1985}; Loach 1988). Por lo tanto, la importancia de mantener la turgencia de la estaquilla, hasta que regenere el nuevo sistema radicular, no puede ser subestimada. Una de las formas de reducir la transpiración en la estaquilla es la poda foliar, práctica que fue realizada en el presente estudio. Una poda excesiva reduce la producción de auxinas, asimilados y otros co- factores foliares importantes para la generación y desarrollo de raíces (^{Hartmann y Kester 1983}, ^{Leakey y Coutts 1989}, ^{Mesén 1993}, ^{Newton et al. 1992}). Por lo tanto, con la poda foliar se buscó lograr un balance óptimo entre los efectos benéficos de la fotosíntesis y otros co-factores foliares y los efectos negativos de la pérdida de agua por transpiración. En este caso, se confirmó que el área foliar, que se dejó en cada estaquilla (2,5-3 cm2) fue adecuada, la cual se definió con base en una serie de estudios anteriores (Mesén y Jiménez 2016).

Por su parte, el ambiente durante la fase de enraizamiento juega un papel fundamental en el éxito del proceso. Los sistemas de propagación deben cumplir 3 requisitos básicos (^{Loach 1988}): mantener una atmósfera con baja demanda eva- porativa, a fin de minimizar la traspiración de las estaquillas; mantener una temperatura adecuada, que estimule el metabolismo en la base de las estaquillas; y mantener una iluminación, que permita la fotosíntesis, pero sin causar aumen- tos excesivos de temperatura. En este sentido, favoreció el uso de las cámaras cerradas con una alta humedad relativa (85-90% a lo largo de todo el periodo), el uso de sombra de sarán del 50%, que permitió el ingreso de luz sin calentamiento excesivo (temperaturas de 21-27ºC) y la irrigación periódica dentro de las cámaras, la cual tiene un doble efecto: por un lado, reduce la temperatura foliar y, además, al mantener una lámina de agua sobre las hojas la mayor parte del tiempo ayuda a reducir la cantidad de agua perdida por transpira- ción. No es de extrañar, entonces, que los sistemas cerrados con irrigación, como los usados en este trabajo, se hayan utilizado extensivamente desde los años 1930 para enraizamiento de un gran número de especies (Loach 1988) y siguen siendo de los sistemas más utilizados en la actualidad.

Los productos evaluados en este estudio, si bien de distinta naturaleza, fueron seleccionados por sus conocidos o promocionados efectos de importancia fundamental en el proceso de enrai- zamiento, y por el interés de evaluarlos, tanto solos como en distintas combinaciones, sobre lo cual no existía literatura en el caso de enraiza- miento de estaquillas de híbridos café. Asimismo, era importante evaluar si diferencias en la fase de enraizamiento tendrían efectos posteriores en el desempeño temprano de las plantas en vivero.

Es interesante que no se encontraran dife- rencias entre tratamientos en la fase de enraiza- miento de las estaquillas e, incluso, las estaquillas sin ningún tratamiento mostraron un alto porcen- taje promedio de enraizamiento (88%, Cuadro 2). Si bien en este estudio no se midió la tasa fotosintética directamente, la irradiación en el área de propagación, al parecer, fue la óptima para mantener la turgencia en las estaquillas y a la vez permitir una tasa fotosintética adecuada, al estimular así su enraizamiento. Por estudios con otras especies se sabe que, incluso bajas tasas fotosintéticas, pueden influir significativamente en el éxito del enraizamiento en estaquillas y que los mayores valores de fotosíntesis se obtienen a irradiaciones relativamente bajas, en el orden de 400 μmol m-2 s-1 (^{Mesén et al. 1997}, ^{Mesén et al. 2001}), es decir, que el aparato fotosintético en estaquillas se satura a irradiaciones mucho menores que en una planta normal de la misma especie. Esto representa una gran ventaja en este tipo de propagación, ya que es posible, entonces, reducir considerablemente la irradiación, como se realizó en el presente estudio, lo cual logra reducir la transpiración en las estaquillas y, aun así, permitir una tasa fotosintética importante para estimular la producción y crecimiento de nuevas raíces.

Aunado a esto, es posible que las estaqui- llas de los híbridos contengan cantidades inter- nas de auxina y otros co-factores suficientes para estimular el enraizamiento, sin necesidad de aplicaciones externas. Este mismo comporta- miento ha sido observado en otras especies, por ejemplo Vochysia guatemalensis, que poseen suficiente auxina endógena, tanto así que cual- quier aplicación adicional de auxina resulta nociva para el enraizamiento de las estaquillas (^{Mesén y Trejos 1997}).

Con respecto a los híbridos, se encontraron diferencias significativas para todas las variables evaluadas en el muestreo destructivo (Cuadro 3), generalmente debidas a la superioridad de los híbridos L2A30 y L12A28. Estos híbridos fueron los más precoces para enraizar, muy posiblemen- te, debido a sus características genéticas, lo cual se vio reflejado posteriormente en mayores valo- res en estas variables de crecimiento.

Si bien durante la fase de enraizamiento no se encontraron diferencias significativas entre tratamientos, sí se notó su efecto posteriormente en el desarrollo de las plantas a nivel de vivero. Se encontraron diferencias significativas entre tratamientos para las variables altura de plantas (Cuadro 4), número de hojas (Cuadro 5) y peso fresco de la parte aérea (Cuadro 6). En general destacó el desempeño superior del tratamiento convencional de uso actual por parte del progra- ma de propagación del CATIE. Esto confirma que las investigaciones que se han llevado a cabo desde el inicio del programa han sido efectivas en seleccionar los productos óptimos para garantizar el enraizamiento efectivo de las estaquillas, que se tradujo luego en un buen desempeño en vivero (^{Mesén y Jiménez 2016}). Este tratamiento inclu- ye tanto AIB, como otros productos promotores del enraizamiento, además, de un complemento nutricional (Cuadro 1), todo lo cual contribuyó al buen desarrollo de las plantas en vivero.

El AIB, por lo general, aumenta el número y calidad de los sistemas radiculares en esta- quillas de muchas especies (^{Hartmann y Kester 1983}, ^{Leakey et al. 1990}, ^{Leakey 2014}, ^{Mesén et al. 1997}, ^{Ruiz-Solsol y Mesén 2010}). Los efec- tos del AIB en el proceso de enraizamiento son múltiples y complejos: además, de estimular la división celular, al promover la síntesis de ADN, incrementa el transporte de carbohidratos y otros cofactores foliares hacia las regiones tratadas, lo cual promueve la iniciación y desarrollo de raíces (^{Gaspar y Hofinger 1988}, Leakey 2014).

Se notó también el efecto positivo sobre el crecimiento de las plantas en los tratamien- tos que incluyeron Pyraclostrobin (F 500) o el inoculante biológico junto al AIB, pero no así cuando los 2 primeros productos se aplicaron de manera conjunta. Esto sugiere la importancia de utilizar en la fase de enraizamiento productos con efectos complementarios, auxínicos (AIB) junto a estimulantes de raíz (inoculante biológico) o de la fotosíntesis (Pyraclostrobin (F 500), lo cual logra así un mejor desempeño que cuando se aplicó cada producto por separado. El hecho de que hubo un menor desarrollo de las plantas cuando se aplicaron los 3 productos juntos, o bien cuan- do se aplicó únicamente Pyraclostrobin (F 500) junto al inoculante biológico, sugiere, quizás, un efecto de toxicidad por exceso de aplicaciones y/o alguna sinergia negativa. Sin embargo, se requie- ren estudios más detallados para confirmar o descartar este efecto y sus posibles causas, lo cual no estuvo dentro de los alcances de este trabajo.

También hubo diferencias significativas entre los híbridos en la fase de vivero, para las variables altura de planta, diámetro al cuello de raíz y número de hojas (Cuadro 7). Sin embargo, las diferencias en términos prácticos fueron muy pequeñas; por ejemplo, la diferencia de altura de la planta entre el mejor híbrido (L2A30) y el peor (L12A28) fue de solo 1 cm; algo similar ocurrió para las otras variables evaluadas, con una diferencia de 0,11 mm en diámetro al cuello de la raíz y de 0,56 en número de hojas. Incluso el híbrido L4A5, que mostró valores relativamen- te inferiores para casi todas las variables en la fase de enraizamiento, mostró una recuperación notable en vivero, tanto que fue estadísticamente igual al L2A30 en cuanto a altura de la planta y número de hojas.

Como se detalló anteriormente, estos híbri- dos fueron seleccionados a partir de 98 híbridos iniciales, luego de una extensa investigación de más de 15 años. Su origen a partir de cruces de materiales tan genéticamente diversos, -Caturras o Sarchimores americanos con accesiones silves- tres de Etiopía y Sudán-, vino a aumentar con- siderablemente la base genética tan estrecha de los cafés cultivados en América Central, en algu- nos casos derivados de una sola planta original (^{Anthony et al. 2002}). Su vigor y excelente creci- miento son similares y han sido comprobados en numerosos ensayos y plantaciones a los largo de América Central (^{Bertrand et al. 2011}, ^{Georget et al. 2017}, ^{PROMECAFE 2011}, ^{Quijano 2007}), lo cual parece manifestarse de igual manera desde la fase temprana de crecimiento en vivero.

Hasta ahora, la técnica que se ha utiliza- do tradicionalmente para la propagación de los híbridos, la embriogénesis somática, se ha visto limitada por varios cuellos de botella: una tasa muy baja de conversión de embrión a planta, pérdidas excesivas durante los procesos de acli- matización, lo cual incide en altos costos de pro- ducción (^{Etienne et al. 2013}) y un largo tiempo, hasta 2 años, desde el inicio del cultivo hasta la generación de las nuevas plantas clonadas (^{Mesén y Jiménez 2016}).

El presente trabajo demuestra que la téc- nica de enraizamiento de estaquillas es per- fectamente factible, con altos porcentajes de enraizamiento y excelente desempeño de las plantas producidas. De esta manera, resulta un eficiente complemento a la embriogénesis somática, en los esfuerzos por producir los híbri- dos de manera simple, a menor costo y en mucho menor tiempo, y facilitar su distribución al sector cafetalero regional, que es necesitado de materia- les de alta producción y calidad.