Introducción

Entre los organismos utilizados en biorremediación destacan las microalgas, que se caracterizan por su rápido crecimiento y su capacidad de incorporar metales pesados. Debido a su alta tolerancia y tasa de absorción pueden ser usadas como indicadores biológicos debido a su alta sensibilidad a los cambios en el ambiente y la capacidad de detectar los efectos tóxicos de los metales pesados. Esta alta tolerancia se debe principalmente a la capacidad de las microalgas de desarrollar mecanismos de tolerancia capaces de reducir los efectos adversos que les pueden producir estos metales (^{Arica et al., 2005}; ^{Bozeman et al., 1989}; ^{Kaplan, 2013}; ^{Kumar et al., 2015}; ^{Kumar et al., 2019}; ^{Leong & Chang, 2020}; ^{Lomax et al., 2012}; ^{Monteiro et al., 2012}; ^{Perales-Vela et al., 2006}; ^{Radix et al., 2000}; ^{Suresh & Ravishankar, 2004}).

Algunas de las microalgas usadas en la remoción de metales y metaloides como vanadio, arsénico y níquel son las algas verdes Chlorella sp., Chlamydomonas sp., Desmodesmus pleiomorphus y Scenedesmus sp. (^{Alharbi et al., 2023}; ^{Awasthi et al., 2018}; ^{De-Bashan & Bashan, 2010}; ^{Xu et al., 2024}), las cuales han mostrado resultados favorables en la remoción y bioacumulación de metales pesados, considerándose alternativas eficientes, rentables y sostenibles (^{Leong & Chang, 2020}; ^{Pacheco et al., 2015}). Estudios realizados por ^{Jiang et al., (2011)} han cuantificado un 70 % de remoción de arsénico (As⁺⁵) en el agua utilizando la microalga Chlorella vulgaris; ^{Qiao et al., (2024)} destacan la eficiencia en adsorción de cadmio (9 000 mg/kg) de la microalga Scenedesmus acuminatus, ^{Arora et al., (2017)}, resaltan los beneficios del uso de microalgas de los géneros Chlorella sp. y Scenedesmus sp. debido a su capacidad de biotransformar metales pesados y metaloides como el arsénico en moléculas químicas con menor toxicidad; reduciendo de esta manera el riesgo de contaminación en los ecosistemas.

En Costa Rica, la contaminación en aguas superficiales debido a la presencia de arsénico es una problemática que afecta a las Asociaciones de Acueducto Rural Comunitarios (ASADAS) en distintos cantones de las provincias de Guanacaste y Alajuela (^{Instituto Costarricense de Acueductos y Alcantarillados (AyA), (2016)}, cuyo origen proviene principalmente de aguas subterráneas provocadas por fallas geológicas localizadas en las zonas afectadas (^{Arias-Barrantes, 2020}; ^{García & Azofeifa, 2020}). Debido a la problemática presente en la calidad del agua, el riesgo en la salud humana y daños en el ecosistema causadas por la presencia de arsénico en altas concentraciones, el presente estudio evaluó la capacidad de remoción de este metaloide por parte de dos microalgas Chlorella vulgaris (Beijerinck, 1890) y Scenedesmus dimorfus (Kützing, 1834) en condiciones de laboratorio.

Materiales y métodos

Aislamiento e identificación de las microalgas: Las muestras de microalgas fueron colectadas en las tomas de agua de la naciente vuelta Kooper Aguas Zarcas perteneciente a la Asada de Vuelta Kooper, Agua Zarcas, San Carlos, Alajuela, Costa Rica (10°28’38”N y 84°22’12” W). Posteriormente, las microalgas fueron aisladas en el laboratorio en cajas de Petri con agar en medio nutritivo. Colonias unialgales de cada especie se inocularon en medio nutritivo estéril. Las microalgas se identificaron morfológicamente mediante un microscopio de luz (Nikon®, Elipse) como Chlorella vulgaris y Scenedesmus dimorfus. Una vez identificadas fueron aisladas y cultivadas en medio BG11 (^{Rippka et al., 1979}). Actualmente, las cepas forman parte de la colección del Laboratorio de Biotecnología de Microalgas y Cianobacterias (LABIOMIC), Centro de investigación en Ciencias del Mar y Limnología (CIMAR), Universidad de Costa Rica.

Escalamiento de cultivos: C. vulgaris y S. dimorfus fueron cultivadas en condiciones unialgales en medio BG11 (^{Rippka et al., 1979}). Cada uno de los cultivos se mantuvieron a temperatura constante entre 28-30 °C, con aireación durante 10-12 días hasta que el crecimiento alcanzó la fase exponencial (^{Touloupakis et al., 2021}).

Diseño experimental:

Agua de la toma de agua de la ASADA Vuelta Kooper Agua Zarcas: se tomaron muestras de agua de este sitio y se cuantificó la concentración de arsénico mediante el empleo de equipo de espectrometría de masas con fuente de plasma de acoplamiento inductivo (Agilent Technologies 7700x ICP-MS por sus siglas en inglés), de acuerdo con los requisitos del Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (^{American Public Health Association, American Water Works Association, & Water Environment Federation, 2023}). La verificación de parámetros de desempeño y la calibración de masas se siguió lo indicado en el manual del fabricante.

La concentración inicial del arsénico en el medio de cultivo de las microalgas correspondió a 48.64 ± 3.6 μg/L. Esta agua se usó en los experimentos con cada especie de microalga. Los controles consistieron en un volumen de 500 ml de medio de cultivo con arsénico sin biomasa y otro volumen de medio de cultivo BG11 con biomasa, pero sin arsénico.

Crecimiento de los cultivos: Los inóculos iniciales de C. vulgaris y S. dimorfus crecieron en el medio nutritivo BG11 (^{Rippka et al., 1979}). Cuando alcanzaron la fase exponencial de crecimiento, la biomasa se centrifugó a 8 000 rpm durante cinco minutos y se colectó. La biomasa de cada microalga se lavó tres veces con agua destilada y se resuspendió en 500 ml con agua proveniente de la toma de agua de Aguas Zarcas. La concentración inicial de clorofila total en cada tratamiento correspondió a un promedio de 20 mg/L clorofila total.

Durante el crecimiento de los tratamientos, se utilizó una fuente de luz artificial blanca con una intensidad de 200 μmol de fotones m²/s y una temperatura constante de 28°C Cada cultivo se agitó con una mezcla de aire y CO₂ (97/3 v/v). El pH se midió cada 24 horas. La concentración de clorofila (mg/L) se cuantificó según el protocolo de ^{Vohra, (1966)} al inicio, durante la fase de crecimiento exponencial y al final del crecimiento de cada experimento. En el caso del tratamiento realizado con la microalga C. vulgaris se realizaron cinco ensayos: dos con un crecimiento de 8 días y tres ensayos correspondientes a un crecimiento de 12-13 días, al final de este periodo se observó una disminución de la concentración de clorofila. Para la microalga S.dimorfus se realizaron ensayos de 12-13 días por triplicado. Cada uno de los experimentos se realizaron bajo las mismas condiciones iniciales de concentración de clorofila, temperatura e intensidad lumínica y su respectivo tratamiento control.

Contenido de arsénico en el medio nutritivo de crecimiento de las microalgas: Se cuantificó el contenido de arsénico en el medio líquido al inicio y al final de cada uno de los experimentos. Para ello, el cultivo de 500 ml fue centrifugado a 8 000 rpm para colectar el sobrenadante que fue filtrado utilizando filtros de fibra de vidrio Whatmann de 47 mm de diámetro. Posteriormente, se realizó una digestión de las muestras del sobrenadante por triplicado y se cuantificó el contenido de arsénico presente (μg/L) mediante la técnica ICP-Masas (^{Llorente-Mirandes et al., 2010}; ^{Rubio et al., 2010}), (Agilent 7500 cx, Germany). Los análisis se realizaron en el Laboratorio de Química de Acueductos y Alcantarillados (AyA) siguiendo el protocolo de Agilent Technologies, (2011).

Cuantificación de arsénico en la biomasa: Se realizó un análisis del contenido de arsénico de las microalgas en la biomasa inicial y final de cada uno de los experimentos. La cuantificación del contenido de arsénico en la biomasa se realizó en el laboratorio de Suelos y Foliares del Centro de Investigaciones Agronómicas (CIA), de la Universidad de Costa Rica. La muestra se liofilizó, se secó en la estufa a 80 °C y se filtró por criba de 1 mm. Se pesaron 0.5 g de la muestra y se realizó una digestión húmeda con ácido nítrico concentrado ultrapuro (^{Kalra, 1998}). Posteriormente, se cuantificó el contenido de arsénico (µg/g) por triplicado en cada una de las muestras mediante espectrometría de masas por plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) (^{Kalra, 1998}).

Análisis estadístico: Para analizar la tasa de crecimiento de la biomasa de las microalgas y evaluar la remoción de arsénico en el agua, se realizaron modelos lineales de efectos mixtos dónde las variables independientes fueron la concentración de clorofila (mg/L) y la concentración de arsénico (μg/L). Los factores fijos incluidos fueron tratamientos (control, C. vulgaris y S. dimorfus). Cada día de crecimiento y el número de experimentos fueron considerados como factores aleatorios. Para evaluar la bioacumulación de arsénico en la biomasa al inicio y al final de los tratamientos, se realizó una prueba T-student analizando los promedios de la concentración (µg/g) de arsénico presente en la biomasa seca antes y después de los ensayos. Estos análisis se realizaron utilizando el programa estadístico R versión 3.4.0 (^{R Core Team, 2024}).

Resultados

Crecimiento del cultivo (contenido de clorofila mg/L): El promedio de la concentración de clorofila obtenido al inicio de los experimentos en presencia de arsénico realizados durante un período de 8 días para la microalga C. vulgaris fue 30.82 ± 7.32 mg/L y la concentración final fue 40.70 ± 19.17 mg/L; mientras que para el periodo de 13 días se obtuvo una concentración inicial de 29.24 ± 5.70mg/L y final de 70.65 ± 11.50 mg/L. En los tratamientos realizados con S. dimorfus se obtuvo un promedio de clorofila inicial de 24.26 ± 2.84 mg/L y final de 60.42 ± 8.41 mg/L. Mientras que los cultivos control de ambas microalgas (ausencia de arsénico en el medio), se observaron diferencias significativas con respecto al crecimiento en presencia de arsénico (Tabla 1). El pH de todos los experimentos se mantuvo constante a 8.5 ± 0.5.

Se observó un aumento de la biomasa el cual se evidencia con el incremento de la concentración de clorofila (mg/L) durante los días del experimento. Basado en el modelo lineal, se observó un aumento del contenido de este pigmento a través de los días de crecimiento (P < 0.001). Además, la microalga C. vulgaris posee un mayor contenido de clorofila diaria que S. dimorfus (P < 0.001) (Fig. 1). Sin embargo, a partir del día 13 de experimento, el contenido de clorofila en las células de ambas especies no experimentó crecimiento. La Fig. 2A y Fig. 2B presentan la concentración de arsénico promedio en el medio nutritivo y de clorofila total de C. vulgaris y S. dimorfus durante 13 días de experimento.

Fig. 1 Relación entre la concentración promedio de clorofila (mg/l) y el número de días de crecimiento del cultivo. El área sombreada corresponde a un intervalo de confianza de 95 % en el modelo de regresión lineal. / Fig. 1. Relationship between average chlorophyll concentration (mg/l) and biomass growth duration (days). The shaded region represents the 95 % confidence interval of the linear regression model. 

Fig. 2 Distribución de la concentración de clorofila total (mg/L) y de arsénico (μg/L) en el medio nutritivo y control (agua con arsénico), A. C. vulgaris y B. S. dimorfus. / Fig. 2. Distribution of total chlorophyll concentration (mg/L) and arsenic concentration (μg/L) in the growth medium and control (water without microalgae), A. C. vulgaris y B. S. dimorfus. 

Contenido de arsénico en el medio de cultivo (agua de Aguas Zarcas): En los ensayos realizados con C. vulgaris durante ocho días de crecimiento, se obtuvo una concentración promedio de arsénico al inicio del experimento de 46.55 ± 0.45 (μg/L) y final de 37.00 ± 0.45 (μg/L), mientras que el tratamiento control se mantuvo con un promedio de 48.64 ± 3.6 (μg/L) durante todos los días del experimento. Los experimentos realizados durante los 12-13 días mostraron una concentración promedio inicial de arsénico de 30.09 ± 9.99 (μg/L) y una concentración promedio final de 20.56 ± 7.15(μg/L) (Tabla 2), el tratamiento control se mantuvo con un promedio de 38.81 ± 3.0 (μg/L). Adicionalmente, S. dimorfus obtuvo una concentración inicial de arsénico de 41.02 ± 8.12 (μg/L) y final de 21.66 ± 7.87 (μg/L) (Tabla 3).

En la evaluación de remoción de arsénico en cada uno de los tratamientos se observa en el modelo lineal que ambas microalgas tuvieron un efecto positivo en la remoción de arsénico con respecto al tratamiento control (P < 0.001) (Tabla 4). Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en las concentraciones de arsénico removidas entre C. vulgaris y S. dimorfus (P = 0.852, Fig. 3).

Fig. 3 Relación entre la concentración de arsénico μg/L presente en el medio nutritivo y el día de crecimiento de los cultivos de las microalgas Chlorella vulgaris y Scenedesmus dimorfus con respecto al tratamiento control. / Fig. 3. Relationship between arsenic concentration (μg/L) in the medium and the growth days of Chlorella vulgaris and Scenedesmus dimorphus strains, according to the control treatment. 

Contenido de arsénico en la biomasa de las microalgas: Al analizar la concentración de arsénico en la biomasa microalgal antes y después de los experimentos se obtuvo una concentración inicial de arsénico en C. vulgaris de 0.12 ± 0.100 μg/g y final de 7.36 ± 3.46 μg/g. En los tratamientos realizados con la microalga S. dimorfus la concentración inicial de la biomasa fue 0.190 ± 0.200 μg/g y la concentración final 6.98 ± 4.8 μg/g. Mediante la prueba t-student, se evidencia que las concentraciones promedio de arsénico (μg/g) presentes tanto en C. vulgaris (T = -4.18, df = 4, P = 0.0114) como en S. dimorfus (T = -3.55, df = 3, P = 0.037) fueron significativamente diferentes, observándose un aumento al final de cada experimento (Tabla 5).

Discusión

Es ampliamente reportado en la literatura la capacidad de las microalgas C. vulgaris y S. dimorfus de remover arsénico del medio de cultivo o en su efecto, la capacidad de bioacumular este metal a nivel celular (^{Leong & Chang, 2020}), promoviendo estos microrganismos como pioneros en la biorremediación de metales pesados y metaloides en fuentes de agua (^{Ahmed et al., 2022}; ^{Plöhn et al., 2021}; ^{Podder & Majumder, 2015}; ^{Saavedra et al., 2018}; ^{Wollmann et al., 2019}). Ambas condiciones se han podido corroborar en el presente trabajo con dos microalgas nativas, las cuales fueron colectadas y aisladas en afluentes con altos niveles de arsénico como es el caso de la toma de agua de Vuelta Kooper, Agua Zarcas, Alajuela, Costa Rica ^{(AyA, 2017}). La propiedad de estas microalgas nativas del cuerpo de agua en estudio, les confiere ventajas con respecto a especies no nativas; debido a su capacidad de adaptación que pueden presentar las especies nativas en aguas contaminadas con arsénico. ^{Kalinowska & Pawlik-Skowronska (2010}) señalan una mayor capacidad de acumulación de metales pesados por parte de cepas de microalgas aisladas de sitios contaminados comparados con especies aisladas de sitios no contaminados. El uso de algas nativas no sólo puede reducir la toxicidad del arsénico, sino también el efecto tóxico en el medio ambiente (^{Lima et al., 2020}; ^{Mao et al., 2022}).

Los resultados obtenidos en esta investigación indican una disminución del crecimiento de la biomasa en términos de la concentración de clorofila y del arsénico en el medio nutritivo al final del treceavo día de cultivo; mientras que el cultivo de las microalgas creciendo en medio BG11 y en ausencia de arsénico (control) presentaron un crecimiento celular mayor de 13 días. La disminución del crecimiento de la biomasa al treceavo día de cultivo, parece indicar que la presencia del metal en el medio puede ser tóxico a las células, provocando la muerte o el deterioro de las organelas como ha sido confirmado por ^{Mao et al., (2022}). Este autor demostró una disminución de la clorofila en presencia de una alta concentración de arsénico, el cual se atribuye a una inhibición por parte del metal al ácido δ-aminolevulínico y la enzima deshidrogenasa del ácido δ-aminolevulínico implicados en la síntesis de clorofila a (^{Mao et al., 2022}).

Aunque los medios de cultivo donde crecían las microalgas presentaron una remoción de arsénico, este metal no fue removido totalmente del medio de cultivo. Este comportamiento fue observado por ^{Leong & Chang (2020}). Entre las microalgas estudiadas, S. dimorfus presentó un porcentaje de remoción mayor del 50 % al final de la fase de crecimiento de la biomasa; mientras que Chlorella vulgaris removió menos de la mitad de la concentración de arsénico. Estas observaciones parecen indicar que es más eficiente la primera especie que la segunda; no obstante, el porcentaje de bioacumulación a nivel celular es similar entre ambas microalgas (98.36 % y 97.27 % respectivamente), evidenciándose en un incremento del contenido de arsénico en la biomasa viva al final del experimento.

Los mecanismos usados por las microalgas para la remoción del arsénico del agua no fue estudiada en el presente trabajo; sin embargo, probablemente están relacionados con las siguientes capacidades de remoción reportados en la literatura: 1) incorporación dentro de las células (tolerancia) a través de la membrana celular, denominado incorporación activa, 2) acumulación/precipitación extracelular proceso que puede ser facilitado por microorganismos vivos y 3) bioadsorción o incorporación pasiva en la superficie celular facilitada por material extracelular como polisacáridos y mucílago (^{De Philippis et al., 2011}) y componentes de la pared celular como sulfatos y fosfatos (^{Naja & Volesky, 2011}). Estos mecanismos mencionados podrían explicar teóricamente el aumento de arsénico cuantificado en la biomasa final de las microalgas usadas, con respecto a la biomasa del inóculo inicial en el presente trabajo.

Aunque la concentración de arsénico presente en el medio nutritivo se mantiene superior a los niveles permitidos en el agua señalados por la Organización Mundial de la Salud (10 µg/L) (^{Montero-Campos et al., 2010}), los resultados demostraron una disminución importante de este metal en el medio donde crecen las microalgas C. vulgaris y S. dimorfus; así como también una bioacumulación a nivel celular. Probablemente, un mecanismo para aumentar y optimizar la remoción de arsénico en el medio de cultivo consiste en incrementar la concentración celular inicial, condición importante para el posterior desarrollo del cultivo. Sin embargo, también es importante optimizar las variables ambientales como pH, temperatura y luz en el medio de cultivo que faciliten la remoción por medio de mecanismos de bioacumulación de adsorción o absorción celular. La importancia del pH ha sido estudiada por ^{Tuzen et al., (2009}), quienes demostraron un 98 % de bioasorpción por parte del alga U. cylindricum a pH 6.0; esta variable es fundamental en los mecanismos de adsorción en procesos de fitorremedación.

En este estudio se aislaron dos microalgas nativas de una fuente de agua caracterizada por poseer alto contenido de arsénico (Chlorella vulgaris y Scenedesmus dimorfus). Ambas microalgas han demostrado una buena capacidad para disminuir el contenido de arsénico en el medio nutritivo por medio de algún proceso de bioacumulación en sus componentes celulares. Los resultados; por consiguiente, aportan posibilidades de estudios de biomonitoreo y biorremediación con microalgas nativas provenientes de aguas contaminadas con arsénico. De esta manera, provee un aporte para entender la problemática de contaminación de fuentes de agua potable en pro de la salud pública del país y de los ecosistemas acuáticos, como una solución económica y respetuosa con el medio ambiente, donde se espera que las microalgas representan organismos deseables para la biorremediación de ecosistemas contaminados con el metaloide arsénico.

Declaración de ética: los autores declaran que todos están de acuerdo con esta publicación y que han hecho aportes que justifican su autoría; que no hay conflicto de interés de ningún tipo; y que han cumplido con todos los requisitos y procedimientos éticos y legales pertinentes. Todas las fuentes de financiamiento se detallan plena y claramente en la sección de agradecimientos. El respectivo documento legal firmado se encuentra en los archivos de la revista.