Introducción

Los compuestos naturales representan un papel importante en el descubrimiento de fármacos y el desarrollo de nuevas terapias medicinales, pues, se ha demostrado que las propiedades bioactivas de los productos de plantas medicinales se atribuyen principalmente a los compuestos fitoquímicos (^{Altemimi, Lakhssassi, Baharlouei, Watson, & Lightfoot, 2017}). Existen informes que indican efectos antiparasitarios de algunos de los compuestos bioactivos naturales tales como el alcaloide berberina (Ber), siendo uno de los metabolitos más estudiados, el cual posee actividad contra una variedad microorganismos, hongos, virus y parásitos (^{Gull, Anwar, Sultana, Alcayde, & Nouman, 2015}). El polifenol curcumina (Cur), actualmente, está recibiendo considerable atención por sus beneficios para la salud y la capacidad de prevenir las enfermedades de la civilización moderna, como los trastornos cardiovasculares o diabéticos antitumorales y además posee actividad antihelmíntica. La curcumina ha sido ampliamente estudiada ya que posee propiedades en contra de Plasmodium berghei y Schistosoma mansoni además de poseer actividad sobre Biomphalaria pfeifferi caracol y hospedador intermediario de S. mansoni (^{Spencer, Peña-Quintero, Canudas, Bujosa, & Urdaneta, 2018}). La quercetina (Qr) es uno de los bioflavonoides más abundante en la naturaleza, el cual es un excelente antioxidante y es conocida por sus efectos antiinflamatorios, antihipertensivos, vasodilatadores, antibacterianas, y principalmente antioxidante (^{Sharifi-Rad, Epifano, Fiorito, & Álvarez-Suarez, 2020}).

Las parasitosis son un problema que afecta gran cantidad de la población humana. Los antiparasitarios derivados de fuentes naturales, pueden ser una alternativa para el tratamiento de infecciones parasitarias. Existen distintos tipos de parásitos que afectan al humano, los cuales están vinculados estrechamente con la pobreza, aislamiento socio-geográfico y la falta de financiamiento para su atención. Entre las parasitosis más comunes se encuentra la amebiasis, la tricomoniasis y la estrongiloidiasis (^{Pozio, 2020}).

Entamoeba histolytica es el causante principal de la amebiasis. Este parásito tiene la capacidad de penetrar en la mucosa intestinal para causar colitis amebiana y propagarse a través de la circulación portal a otros órganos, típicamente el hígado y el cerebro. La infección por este parásito es responsable de 50 millones de casos de amebiasis y 100 000 muertes anualmente (^{Dingsdag & Hunter, 2018}). El metronidazol es el fármaco de elección para el tratamiento de la amebiasis, el cual tiene más de 25 años de uso y hoy en día se conoce que E. histolytica ya ha mostrado resistencia a este fármaco (^{Ghosh, Aycock, & Schwebke, 2018}). Trichomonas vaginalis causa la tricomoniasis la cual es la enfermedad de transmisión sexual no viral más común en el mundo. La tricomoniasis se ha asociado con secuelas graves, las más notables son en mujeres embarazadas, el tratamiento de elección se basa en el uso de metronidazol en dosis altas (2-4 g), durante 7 a 14 días (^{Lee & Ryu, 2019}). La estrongiloidiasis es una enfermedad causada por nemátodos del género Strongyloides presentes en áreas tropicales y subtropicales con clima adecuado para la supervivencia de las etapas larvarias de las especies de este género. Se estima que entre 30 y 100 millones de personas están infectadas en todo el mundo. La ivermectina (IV) es el fármaco de referencia contra la estrongiloidiasis, pero ya se han registrado casos de cepas resistentes (^{Andersen et al., 2019}) and the Global Program to Eliminate LF delivers mass drug administration (MDA).

Conforme a los antecedentes mencionados, los objetivos del presente estudio fueron evaluar la actividad antiparasitaria in-vitro de berberina, curcumina y quercetina contra trofozoítos de E. histolytica, T. vaginalis y larvas de S. venezuelensis. Además, evaluar sus capacidades antioxidantes, hemolíticas y citoprotectoras.

Materiales y métodos

Reactivos: 2,2′-Azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride (AAPH), 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), Berberina (Ber), Curcumina (Cur), Dimetilsulfóxido (DMSO), Ácido-etilendiaminotetraacético (EDTA), Ivermectina (IV), Metanol absoluto (MeOH), Metronidazol (Met), Quercetina (Qr) y Vitamina E (VitE) se adquirieron en Sigma-Aldrich^® (Merck-Chemical^®, USA), el suero fetal bovino (SFB) se adquirió en Invitrogen, USA. Todos los reactivos fueron grado analítico.

Cepas: E. histolytica HM1-IMSS y T. vaginalis GT15 en medio PEHPS fueron proporcionada por el Centro de Investigación Biomédica del Noreste del IMSS. Las larvas filariformes (L3) de S. venezuelensis fueron proporcionadas por el Centro de Investigación de Enfermedades Tropicales de la Universidad de Salamanca, España, las cuales fueron obtenidas mediante el método de Baermann, de heces de ratas infectadas.

Ensayos de actividad biológica: En tubos de microcentrífuga (Eppendorf^®, Germany), se prepararon soluciones madre Ber, Cur y Qr (1 mg/ml) en DMSO el cual nunca fua mayor al 2 % p/v. Estas soluciones se esterilizaron con filtros de membrana de nylon de 0.22 μm (Millipore-Merck^®, Germany), a partir de estas, se hicieron las soluciones de trabajo (0.5 a 200 μM) para determinar las IC₅₀.

Para los ensayos con E. histolytica y T. vaginalis las soluciones se depositaron en viales de vidrio de 2 ml estériles, los cuales contenían una suspensión de trofozoítos de E. histolytica (2 x 10⁴ trofozoitos/ml) o T. vaginalis (1 x 10⁵ trofozoítos/ml) en fase logarítmica, en medio PEHPS + SFB-10 % y se incubaron a 37 °C durante 72 h y 24 h respectivamente. Después del tiempo de incubación los viales se enfriaron (4 °C / 20 min) para que los trofozoítos se despegaran, se realizó una tinción con azul tripán al 10 % y se realizó una dilución 1:10 con formalina para fijar, contar y medir la viabilidad de los trofozoítos, con un hemocitómetro. Como control positivo se utilizó metronidazol (10 μM) y como control negativo solo medio de cultivo. En cuanto a los ensayos con L3 de S. venezuelensis, en una microplaca de 96 pozos se agregaron 100 μl con 150 larvas por pozo las cuales se preincubaron 30 min (28 °C) y finalmente se agregaron 100 μl de los tratamientos previamente descritos. Como control positivo se usó IV (10 μM) y como control negativo agua destilada (^{Legarda-Ceballos et al., 2016}), el ensayo se llevó a cabo durante 72 h a 28 °C y la viabilidad fue evaluada directamente mediante el registro del movimiento larval después de la estimulación con luz natural directa durante dos minutos utilizando un microscopio invertido (CK2, Olympus, Japón), las larvas se consideraron muertas cuando no se detectó movimiento durante al menos dos minutos de examen detallado.

Actividad antioxidante: Se usó el método de reducción del radical DPPH. Los tratamientos (Tr) fueron evaluados a concentraciones de 20-2 500 μg/ml. El DPPH fue preparado a 125 μM en MeOH absoluto, se tomaron 100 μl de cada concentración respectiva y se agregaron 100 μl del DPPH. Las muestras se dejaron reposar por 30 min en ausencia de luz (^{Rodríguez-Magaña et al., 2019}). La absorbancia (Abs) fue medida a 517 nm con un espectrofotómetro Genesys (Thermo-Scientific™, USA). Como control positivo (C+), se utilizó una solución de VitE y como blanco (Bco) MeOH; el porcentaje de reducción se calculó utilizando la fórmula:

% Reducción = [(AbsBco - AbsTr) / (AbsBco)]×100

Ensayo de hemólisis y citoprotección en eritrocitos humanos: Se recolecto sangre de donadores sanos y el suero fue separado. Los eritrocitos, se lavaron con EDTA (1.5 mg/ml de sangre), se mezclaron y centrifugaron (1 000 rpm por 4 min) a temperatura ambiente. Después, la suspensión celular es lavada y centrifugada cuatro veces en solución amortiguadora de fosfatos en proporción 1:1 (PBS 10 mM a pH 7.4) eliminando los sobrenadantes y se prepara una suspensión al 5 % v/v en PBS. Para la evaluación de la hemólisis, la suspensión se incubó con diferentes concentraciones de Ber, Cur o Qr, y de soluciones testigo previamente preparadas en MeOH absoluto (50 a 1 000 μg/ml) en viales de 2 ml durante 30 min a 37 °C y en ausencia de luz, estos fueron catalogados como tratamientos (Tr). Como control negativo (C-) se utilizó eritrocitos sin tratamiento y como control positivo (C+) eritrocitos con agua destilada estéril para producir la hemólisis osmótica en los eritrocitos (^{Elizondo-Luevano et al., 2020}). Para la evaluación del efecto citoprotector, a los tratamientos se les añadió AAPH (150 mM en PBS) más la suspensión de eritrocitos y se incubaron a 37 °C (5 h a 200 rpm) utilizando una incubadora de rotación MaxQ™ (Thermo-Scientific™, USA), en ausencia de luz. El control negativo (C-), consistió en PBS con la suspensión de eritrocitos sin incluir AAPH y como control positivo (C+), la suspensión de eritrocitos con AAPH. Pasado el tiempo de incubación, los tratamientos se centrifugaron a 13 000 rpm por 4 min a 4 °C, se tomaron 200 µl del sobrenadante y se pusieron en una microplaca transparente de 96 pozos con fondo plano. La hemólisis se determinó mediante la lectura a 540 nm, con un lector de microplacas EPOCH™ (BioTek™, USA), para registrar la absorbancia de cada tratamiento menos la absorbancia presentada por el vehículo (AbsTr) y finalmente, se calculó el porcentaje de hemólisis = ([(AbsTr - AbsC-) / (AbsC+ - AbsC-)]× 100) y citoprotección = ([1 - (AbsTr - AbsC-) / (AbsC+ - AbsC-)]× 100).

Análisis estadístico: La prueba de análisis de varianza (Anova) de una vía se usó para determinar si existía diferencia significativa entre las concentraciones evaluadas y la prueba honesta de significancia Tukey para determinar la diferencia entre las medias en los tratamientos evaluados. La concentración inhibitoria media (IC₅₀) y la concentración efectiva media (CE₅₀) se determinó por la prueba de Probit, con un intervalo de confianza del 95 %. Los análisis se realizaron con el software SPSS, versión 23.0 (SPSS, Inc. USA). Las diferencias se consideraron significativas a P < 0.05. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

Resultados

Actividad biológica: Berberina, curcumina y quercetina in-vitro mostraron actividades significativas (P < 0.05) contra E. histolytica, T. vaginalis y S. venezuelensis (Tabla 1). Mediante la prueba de Tukey, se puede observar que no existe diferencia significativa (P ˃ 0.05) entre Ber y los fármacos control contra E. histolytica y S. venezuelensis; sin embargo, en contra de T. vaginalis si hubo diferencia significativa. También se observa que Cur y Qr, no fueron tan efectivos, en comparación con los fármacos control para los tres parásitos ensayados, ya que mostraron alta diferencia significativa (P < 0.001).

Capacidad antioxidante: Se observó un diferente desempeño en la capacidad antioxidante de cada uno de los metabolitos (Qr ˃ VitE ˃ Cur ˃ Ber), siendo Qr el más efectivo, incluso en comparación con el control positivo VitE (P < 0.001). La prueba de Tukey arrojó que existe diferencia significativa entre los tratamientos, excepto entre Cur y VitE (P ˃ 0.05), los cuales tuvieron capacidad antioxidante similar, pues estos no presentaron diferencia entre sus medias (Tabla 2).

Actividad hemolítica y citoprotectora: La actividad hemolítica de Qr in-vitro mostró que este metabolito no tiene capacidad lítica significativa de los hematíes (P = 0.264), en comparación con el control no tratado, el cual no presentó hemólisis. Para Ber y Cur se presentaron altas diferencia significativa (P< 0.001) en comparación con dicho control (Tabla 3). Además se pudo observar que con Ber, que la hemolisis va en aumento conforme aumenta la concentración. Para Cur y Qr no se presentaron altas toxicidades, siendo las hemólisis del 1.9 y 0.7 % respectivamente, las exhibidas la máxima concentración evaluada y sin toxicidad significativa a la concentración más baja. La actividad citoprotectora in-vitro de Ber, Cur y Qr, presentaron diferencia significativa (P < 0.05), en comparación con el control sin protección de los eritrocitos. Se puedo observar que Ber no fue tan eficiente como Cur y Qr, ya que estos metabolitos a partir de 50 μg/ml, mostraron citoprotección del 71 y 89 % respectivamente, en comparación al control, mientras que Ber presentó 2.2 %.

Discusión

Los resultados obtenidos en este estudio indican que berberina, curcumina y quercetina poseen actividad en contra de la viabilidad de Entamoeba histolytica, Tricomonas vaginalis y Strongyloides venezuelensis in-vitro (Tabla 1). En cuanto a la actividad biológica destaca Ber siendo el más efectivo, arrojando IC₅₀ de 1.7, 1.2 y 1.9 μM en contra de E. histolytica, T. vaginalis y S. venezuelensis respectivamente. Lo que indica que posiblemente la estructura química alcaloide favorece la actividad biológica. Existen estudios en productos naturales con extractos ricos en este metabolito que muestran este comportamiento (^{Elizondo-Luévano et al., 2018}). Se ha demostrado que Ber ejerce efectos inhibidores contra G. lamblia, T. vaginalis y E. histolytica, en los que se observó que los trofozoítos se hincharon con presencia de depósitos de glucógeno y con la aparición de vacuolas de forma irregular en el citoplasma con cambios morfológicos en los parásitos, incluyendo agregación de cromatina en el núcleo y agregaciones de pequeñas vacuolas en el citoplasma (^{Shen, Jiang, Yang, Wang, & Zhu, 2017}). Al momento se tienen estudios de la berberina en contra de S. mansoni, Echinococcus multilocularis y E. granulosus pero no sobre S. venezuelensis. En dicho estudio Ber mostró ser significativamente igual de eficaz que el fármaco control (^{Siles-Lucas, Casulli, Cirilli, & Carmena, 2018}), muy similar a lo encontrado en nuestro estudio donde se comporta significativamente igual que los fármacos control (metronidazol e ivermectina).

En este contexto, este estudio mostró que moléculas que no pertenecen a la familia de los alcaloides presentan buena actividad biológica en contra de E. histolytica, T. vaginalis y S. venezuelensis a dosis relativamente bajas (IC₅₀ con IC₅₀ 55.3, 40.6 y 13.7 μM respectivamente) como es el caso de curcumina un conocido antioxidante. A diferencia de Ber con esta molécula no existen muchos estudios de su actividad contra parásitos, se conocen más algunos efectos sobre ciertos microorganismos y hongos (^{Aquino et al., 2016}; ^{da Silva et al., 2020}). Existen reportes que indican que en concentraciones de hasta 50 µM atenúan la virulencia de E. histolytica sin afectar el crecimiento de trofozoítos ni desencadenar daño hepático, además disminuye la expresión de genes asociados con su virulencia (lectina gal/galnac, ehcp1 y ehcp5) lo cual fue correlacionado con una invasión amebiana significativamente menor (^{Rangel-Castañeda et al., 2019}). Existen otros estudios con Cur en contra de S. mansoni en fase adulta y se reporta un 100 % de letalidad a 50 µM, donde se observó reducción de la oviposición, separación inducida de machos y hembras y reducción de la actividad motora (^{Ndjonka, Rapado, Silber, Liebau, & Wrenger, 2013}).

Por otro lado, las afecciones por parásitos están relacionadas con el estrés oxidativo, por ejemplo de forma crítica, en la etiopatología del absceso hepático amebiano. Por tal motivo, este estudio también se evaluó la capacidad antioxidante y los resultados proporcionaron una clara evidencia que los agentes antiparasitarios pueden además ser antioxidantes, pero que no necesariamente amabas actividades se encuentran relacionadas. Así, en esta investigación se compararon las actividades antioxidantes de los metabolitos estudiados contra VitE, control en este tipo de ensayos, debido a su alta actividad antioxidante. Se observó que el mejor antiparasitario, Ber, fue el compuesto menos efectivo como antioxidante (EC₅₀ 42 μg/ml), por otro lado, Qr resultó ser altamente antioxidante (EC₅₀ 1.1 μg/ml), incluso presentó actividad superior a la VitE (EC₅₀ 16.9 μg/ml), sin embargo, este compuesto prácticamente no presentóactividad contra los parásitos. Cabe mencionar, que esta falta de actividad no puede adjudicarse a la incapacidad de penetración ya que ha sido reportado que Qr posee actividad intracelular como antioxidante debido a sus efectos sobre el glutatión (GSH), la actividad enzimática, las vías de transducción de señales y las especies reactivas de oxígeno (ROS) causadas por factores ambientales y toxicológicos, además de que mantiene el equilibrio oxidativo en la célula (^{Xu, Hu, Wang, & Cui, 2019}).

Los ensayos de toxicidad demostraron que la hemólisis causada por Ber fue directamente proporcional a la concentración. Se destaca que a concentraciones menores a 2 μM, esta molécula es efectiva en contra de los parásitos evaluados, y está muy por debajo de la concentración hemolítica en concordancia con otros estudios En cuanto a Cur y Qr, estos no presentaron diferencia significativa entre ellos (P ˃ 0.05), resultando en una hemolisis menor al 2 % inclusive en la concentración más alta evaluada, por consiguiente, podrían ser clasificados como no tóxicos, ya que la posible hemólisis presentada es relacionada al estrés mecánico al momento de la agitación durante el periodo de incubación (^{Pozzo et al., 2020}). Estos resultados podrían sugerir que las actividades antiparasitaria y de toxicidad celular se relacionan y que presumiblemente el efecto antioxidante está más relacionado con la inocuidad. Además la literatura menciona que compuestos alcaloides como Ber pueden ser tóxicos en altas concentraciones y que incluso puede llegar a intercalarse en el ADN. En contraste, compuestos con grupos fenólicos como Cur y Qr, poseen una alta actividad citoprotectora (^{Pongkittiphan, Chavasiri, & Supabphol, 2015}). En este estudio dicha actividad se evaluó mediante la descomposición térmica del AAPH, ya que es un modelo efectivo para estudiar la inhibición de radicales libres por antioxidantes. Esta prueba es ampliamente utilizada para la evaluación de la disrupción de las membranas celulares inducida por radicales libres de oxígeno (^{Pozzo et al., 2020}). Los resultaron mostraron que efectivamente aquellos compuestos que se habían destacado como antioxidantes, es decir Qr y Cur, brindaron una mejor protección (P < 0.001) en comparación con Ber, ya que éste no alcanzó más de 3.5 % de protección. Diferentes investigaciones, mencionan que la resistencia de los eritrocitos al estrés oxidativo es debida a la presencia de polifenoles o flavonoides, ya que obstaculizan la difusión de los radicales libres, disminuyendo en gran manera las reacciones de oxidación (^{Caddeo et al., 2019}). Finalmente, los resultados en cuales Cur y Qr no provocaron hemólisis significativa pero presentaron protección sobre la membrana eritrocitaria, aunados a aquellos que demuestran que Ber no presentó protección sobre los eritrocitos, indican que posiblemente la acción biológica de Ber no es ejercida a nivel de membrana, sino dentro de la célula (^{Hatia et al., 2014}).

Existe un renovado interés en los productos naturales como punto de partida para el descubrimiento de medicamentos para combatir las parasitosis, ya que son escasos los recursos para tratarlas (^{Yones et al., 2016}). Por lo cual es necesario desarrollar nuevos medicamentos contra estas enfermedades que afectan al hombre mundialmente. El uso de productos de origen naturales para el tratamiento de las parasitosis va en aumento, esto debido a que el control y tratamiento, está basado en la aplicación de los mismos medicamentos desde hace varias décadas, es por tal motivo el aumento en el número de investigaciones para el uso de diversas sustancias de origen natural, ya sea vegetal o animal (^{Hayat, Azam, & Shin, 2016}). En la presente investigación se demostró que Ber, Cur y Qr, prometedoras en cuanto a la inhibición de la viabilidad de E. histolytica, T. vaginalis y S. venezuelensis además poseen propiedades antioxidante y citoprotectora. El mecanismo de la actividad de Ber, Cur y Qr, aún no están elucidados, se requieren experimentos en distintas etapas de los parásitos, además de los mecanismos de acción en esas etapas y experimentos en modelos in-vivo, para dilucidar los mecanismos de acción. Así mismo, estos estudios podrán llegar a validar el uso de extractos vegetales donde posiblemente las acciones combinadas resulten en beneficios terapéuticos que deberían explorase.

Declaración de ética: Los autores declaran estar de acuerdo con esta publicación y se han hecho aportes que justifican su autoría. No hay conflicto de interés y se han cumplido los procedimientos éticos pertinentes. El financiamiento viene detallado en la sección de agradecimientos. Los procedimientos empleados cumplen las normas de la Unión Europea y Mexicanas (No.reg.PAE/SA/001).