Materiales y Métodos

Material vegetal: Se recolectaron 15 ejemplares de H. brasiletto,C. citratus, M. vulgare y S. molle de tres diferentes viveros del área metropolitana del estado de Nuevo León, México (25°40’17” N & 100°18’0” W), a una altitud promedio de 500 msnm de mayo a junio del 2014, a finales de primavera y parte del verano y con una temperatura anual que oscila entre los 20 °C con precipitaciones de 650 mm, con un clima que se considera semiárido cálido (INEGI, 2015). En este período, las plantas se encuentran en su mejor estado fisiológico y reproductivo, por ser temporada de lluvias y tener los fotoperiodos más largos del año. Los ejemplares frescos recolectados se colocaron en bolsas de plástico con hielo para transportarlos; la identificación se realizó en el Departamento de Botánica de la Facultad de Ciencias Biológicas de la UANL donde se depositaron los boucher con el registro de H. brasiletto (NL-0548), C. citratus (NL-5542), M. vulgare (NL-5555) y S. molle (NL-5567).

Preparación de los extractos: Se descartaron las plantas que tuvieran signos de infección o enfermedad, después se lavó con agua bidestilada estéril para eliminar las impurezas superficiales al chorro de agua; posteriormente, se procedió a secarlo a una temperatura de 30 °C por 24 h en una estufa (Cole Parmer, Inc.), una vez seco, se pulverizó con un molino Wiley, hasta obtener polvo fino. Se utilizaron diversas porciones de los ejemplares, como la parte aérea, tallos y hojas (^{Molina-Garza et al., 2014}). Se pesaron 50 g del material vegetal molido y se depositó en un cartucho de celulosa (Cartucho Whatman 33 x 80 mm) para la extracción con el aparato Soxhlet con 250 mL de metanol absoluto (J. T. Baker) como solvente de extracción, se colocó a reflujo a 60 ºC por 40 h. Posteriormente, se filtró el extracto con papel Whatman N°1 y se concentró con el rotavapor Buchi R-205. Se analizó el rendimiento de cada planta previo a realizar las pruebas contra el parásito (g de extracto/100 g de planta) (^{Quintanilla-Liceaet al., 2012}).

Parásitos: La actividad de los extractos fue evaluada en los epimastigotes de la cepa de T. cruzi obtenida a partir de las heces de Triatoma gerstaeckeri de la localidad de Cerralvo, Nuevo León (por la primera autora, KCPT), la cepa se cultivó en nuestro laboratorio en medio LIT (Liver infusion tryptose) con suero fetal bovino al 10 %, para incubarse a 28 °C y ser cosechada en la fase de crecimiento exponencial (^{Molina-Garza et al., 2014}).

Evaluación de la actividad tripanosomicida de los extractos: Se realizó una solución de cada extracto metanólico de 15 mg disueltos en dimetil sulfoxido 1 % (DMSO) e incubados por 24 h. Los bioensayos se realizaron por duplicado; para cada extracto se tomó como unidad experimental una microplaca de 96 pozos, donde se depositaron 200 μL de la suspensión del medio LIT con 1.5 x 10⁶ parásitos/mL, en cada pozo se agregó cada una de las cinco diferentes concentraciones del extracto con tres réplicas de cada uno de los tratamientos (1 000 μg/mL, 750 μg/mL, 500 μg/mL, 250 μg/mL y 100 μg/mL); simultáneamente, se colocaron el control positivo y negativo, se utilizó nifurtimox (Sigma-Aldrich) a 10 µg/mL y medio de cultivo con parásitos respectivamente, con un volumen igual al de los extractos de DMSO 1 % (^{Muelas-Serrano, Nogal-Ruiz, & Gómez-Barrio, 2000}). Las concentraciones expresadas en μg/mL de los extractos se prepararon en una balanza analítica con capacidad de 80 g a 0.0001 g (Nimbus 84i, Adam Equipment) y mediante diluciones con micropipetas (Eppendorf) con capacidad de 1 mL a 0.5 mL. Las microplacas se incubaron (Memmert, Inc.) por 96 horas a 27 °C (^{Pizzolatti, Koga, Grisard, & Steindel, 2002}). El número de epimastigotes vivos se determinó mediante recuento en cámara de Neubauer. Los resultados se expresan como la concentración inhibitoria al 50 % (CI₅₀), que corresponde a la concentración a la cual ocurre el 50 % de muerte celular. Se seleccionó el extracto con mayor actividad para identificar las familias funcionales mediante pruebas químicas coloridas (^{Pérez-Treviño, Molina-Garza, & Galaviz-Silva, 2016}). Se determinó la CI₅₀ de los extractos contra la cepa de T cruzi, mediante un análisis de regresión dosis-respuesta con el programa SPSS 17.0 (^{Al-Adhroey, Nor, Al-Mekhalfi, & Mahumud., 2010}) y con un intervalo de confianza (IC) del 95 %.

Determinación de la actividad citotóxica de los extractos en Artemia salina : El ensayo consistió en exponer grupos de larvas a las 48 h después de eclosionar, a las mismas concentraciones de extracto que se utilizaron contra T. cruzi (1 000 μg/mL, 750 μg/mL, 500 μg/mL, 250 μg/mL y 100 μg/mL) durante 24 h a temperatura ambiente y bajo régimen continuo de luz. Primero, se prepararon placas de 96 pozos, se añadió a cada uno 200 µL de agua de mar suplementada con extracto de levadura y con diluciones del extracto correspondiente. Posteriormente, se transfirieron 10 larvas a cada pozo. Al finalizar las 24 h de exposición, se contabilizó el número de organismos muertos y se realizó una prueba PROBIT. Las larvas se consideraron muertas si no exhibían movimiento durante varios segundos de observación al microscopio estereoscópico. El experimento se consideró válido si el porcentaje de mortalidad en los controles no excedió de 10 % (^{Fernández-Calienes Valdez et al., 2009}).

Fraccionamiento del extracto: Para separar los compuestos presentes en los extractos, se realizó cromatografía de capa fina, se utilizaron placas de sílica gel en soporte (TLC Sílica gel 60 Sigma Aldrich). La observación de la separación de los compuestos se realizó bajo la luz visible y ultravioleta (365 nm), en este último caso con el empleo de una lámpara portátil. Se realizó una separación mediante una fase móvil (v/v) de cloroformo: metanol (8:2) absolutos, tras evaluar las fracciones, se conservaron las dos con actividad tripanosomicida mayor, identificadas mediante su factor de retención (Rf), obtenido a partir de la fórmula R_f= Distancia del compuesto desde el origen/ distancia del solvente desde el origen (TomásAlonso, 1993). Las fracciones obtenidas se denominaron Fr21 (Rf: 0.25) y Fr22 (Rf: 0.8), mismas que fueron probadas contra T. cruzi, al siguir la metodología antes descrita(^{Murillo, Castro, Chavarría, & Poveda,2006}; ^{Volonté & Quiroga, 2013}; ^{Mijares-Bullaín, Torres-Rodriguez, & Hermosilla-Espinosa, 2014}).

Ensayo de citotoxicidad de la fracción con mayor actividad tripanosomicida en linfocitos humanos: Se emplearon linfocitos humanos de sangre periférica de un donante joven (26 años) no fumador, sin haber ingerido alcohol un mes antes de la donación y quien firmó el consentimiento informado para participar en este estudio. Los linfocitos se aislaron por el método tradicional en gradiente (^{Boyum, 1984}). Se recolectaron 5 mL de sangre en un tubo Vacutainer con heparina, se mezcló por inversión con 5 mL de amortiguador de fosfato de sodio (PBS) en proporción 1:1, se transfirió lentamente por las paredes, evitando la formación de turbulencia, en 10 mL de Ficoll®Paque Plus (Sigma-Aldrich), se verificó la formación de dos capas y se centrifugó durante 30 min a 3 000 rpm a 4°C. Se extrajo con precaución la capa de linfocitos y se transfirió a otro tubo limpio y seco. Finalmente, se centrifugó para descartar el PBS y se agregó 1 mL de medio modificado Dulbecco de Eagle (DMEM, Sigma-Aldrich). Se determinó la viabilidad inicial mediante la técnica de exclusión por azul de tripano, se incubaron en el mismo medio a 37ºC por 2 h. Posteriormente, se evaluaron las concentraciones de 0.15, 0.30, 0.45 y 0.6 mg/ mL de la fracción con mayor actividad tripanosomicida. Como control positivo se utilizó concavalina A. La prueba se realizó en una solución de 1 x 10⁶ linfocitos/mL, se cultivaron en medio DMEM y se colocaron en una microplaca con un volumen final de 200 μL. Se incubaron a 37°C por 4 h. Posteriormente, se evaluó la viabilidad celular mediante la formación de cristales de formazán, por medio del método de la reducción metabólica del Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT) (^{Cho et al., 2016}).

Determinación cualitativa de metabolitos secundarios: Se realizó la identificación de metabolitos secundarios mediante reacciones químicas coloridas. La determinación de flavonoides se efectuó mediante la prueba de Shinoda; las cumarinas mediante hidróxido de sodio 10 %; se utilizó la prueba de Dragendorff para determinar la presencia de alcaloides; los esteroles y terpenos se identificaron mediante el ensayo de Lieberman-Buchard; la prueba de Balje se utilizó para analizar la presencia de sesquiterpenlactonas; quinonas y taninos mediante ácido sulfúrico y cloruro férrico 1 %, respectivamente; la determinación de saponinas se realizó mediante la prueba de la espuma (^{Ortega, Benitez-Bampo, & Cabezas-Fajardo, 2011}; ^{Rathore, Bhatt, Dhyani, & Jain, 2012};^{Sotomayor, 2014}).

Resultados

El extracto completo H. brasiletto fue el que tuvo mayor rendimiento con 21.3 %; en orden decreciente se encontró a S. molle (17.8 %), M. vulgare (16.3 %), y finalmente, C. citratus (14.8 %).

El extracto de H. brasiletto presentó la mayor actividad inhibitoria contra T. cruzi a una concentración de 1 mg/mL (90 %) con una CI₅₀ de 0.543 mg/mL: Este fue seguido por el extracto de M. vulgare, el cual también presentó buena actividad tripansomicida (CI₅₀ = 0.647) con baja toxicidad en A. salina. Aunque el extracto de C. citratus fue el menos tóxico en el modelo de Artemia, éste no presentó una buena actividad tripanosomicida; los extractos restantes tampoco mostraron una toxicidad notable anti T. cruzi (Cuadro 1). Con los controles positivos, la CI₅₀ del nifurtimox (10 µg/mL) presentó una inhibición del 80 % de los parásitos. En los controles negativos no se encontró efecto sobre los epimastigotes de T. cruzi.

La fracción Fr22 de H. brasiletto presentó una CI₅₀ de 0.238 mg/mL (IC = 0.174-0.301), la cual fue incluso más eficiente que el extracto completo (Cuadro 2). Por lo cual esta fracción fue la única seleccionada para determinar el ensayo de citotoxicidad en linfocitos humanos para determinar la selectividad de la misma. Esta fracción Fr22, a dosis de 0.6 mg/mL (la más concentrada) presentó un porcentaje de viabilidad de linfocitos del 81 %. Mientras que el efecto inhibidor medio de la fracción Fr22 contra los epimastigotes, se presentó a los 0.24 mg/mL, la cual fue marcadamente menor respecto al efecto citotóxico.

Posterior a la separación, se procedió a identificar las familias de compuestos presentes en cada fracción, así como en el extracto completo, lo cual permitió identificar como compuestos activos a los flavonoides, sesquiterpenlactonas y quinonas (Cuadro 3).

Discusión

Los extractos de plantas con antecedentes de uso medicinal han sido un referente constante en el tratamiento de la enfermedad de Chagas debido a los efectos adversos del benznidazol y el nifurtimox (Cuhna et al., 2003; ^{Paveto et al., 2004}; ^{Abdel-Sattar, Maes, & Salama, 2010}). Desde que se observó que existe una correlación positiva entre la actividad tripanosomicida contra epimastigotes in vitro y la actividad contra tripomastigotes in vivo, el uso de epimastigotes para estimar la actividad tripanosomicida se ha difundido más rápidamente (^{Schlemper, Chiari & Brener, 1977}; ^{Abe et al., 2002}).

El extracto de S. molle ha sido utilizado ampliamente como repelente de insectos, incluyendo para Triatoma infestans, vector de la enfermedad de Chagas, identificándose hasta 65 compuestos con actividad repelente, como son el limoneno, eucaliptol y terpenos; sin embargo, su uso antiparasitario se ha restringido solo al extracto completo (^{Ferrero, González, & Chopa, 2006}; ^{Abdel-Sattar et al., 2010}; ^{Molina-Garza et al.,2014}). Del extracto de M. vulgare se han identificado cinco compuestos de una fracción polar con actividad anti-inflamatoria no esteroidea: el ácido cafeoil-L-málico, verbascosido, forsitosida, arenariosido y ballotetrosido; de los cuales sólo los dos primeros compuestos se han reportado con actividad antibiótica importante (^{Sahpaz, Garbacki, Tits, & Bailleul,2002}). Otros 29 compuestos identificados con actividad biológica en el aceite escencial de C. citratus incluyen principalmentealmirceno, citronelal, R-limoneno, citral y β-citronelol, que presentan una buena actividad individual contra T. brucei brucei (^{Kpoviessi et al.,2014}).Sin embargo, no han sido probados contra T. cruzi, lo cual abre nuevas expectativas para futuros estudios y determinar si el efecto será igual de efectivo.

De los extractos analizados, las dosis (mg/ mL) en las que se observaron las óptimas actividades anti-T. cruzi (CI₅₀) fueron 1.21 para C. citratus; 0.647 para M. vulgare y 0.827 en el caso de S. molle, pero fue H. brasiletto (conocido como palo de Brasil en esta región), el que presentó una actividad marcada a los 543 µg/ mL. Otros resultados parciales se presentaron en el LI Congreso Nacional de la Sociedad Mexicana de Entomología, pero este estudio muestra los resultados completos (^{Pérez-Treviño et al., 2016}).

En reporte anteriores, se describen pruebas preliminares con 20 familias y 37 especies de plantas de uso medicinal de México y Guatemala contra epimastigotes de T. cruzi, reportándose la “fijación” del parásito a dosis de 2 mg/mL con la inmovilización del mismo en un 90-80 % a dosis de 1 mg/mL con el extracto de H. brasiletto, sin embargo, no se mencionan los compuestos activos (^{Abe et al., 2002}). Así mismo, el efecto antibiótico de H. brasiletto ha sido probado contra bacterias como Escherichia coli y Staphylococcus aureus; pero con mejores resultados contra el último (^{Yasunaka et al., 2005}). El extracto de H. brasiletto también ha sido probado contra 12 cepas de bacterias antibiótico resistentes y un eucariota (Candida albicans); y fueron identificados ocho compuestos con actividad biológica: hematoxilina, brazileina, floroglucinol, 5-metoxipsoraleno, metil galato, ácido gálico, ácido 4-hidroxicinamico y ácido caféico (^{Rivero-Cruz, 2008}).

En el extracto de palo de Brasil se encontró la presencia de flavonoides, compuestos que en estudios previos han sido asociados con actividad contra diversos géneros de parásitos cómo Plasmodium, Leishmania, Entamoeba, Giardia, Trichomonas y Trypanosoma; además de características antioxidante (MartínezFlórez, González-Gallego, & Culebras, 2002). También se han identificado quinonas y triterpenos reportados con actividad antimicrobiana (^{Muñoz-Jáuregui, Ramos-Escudero, AlvaradoOrtiz, & Castañeda-Castañeda, 2007}; ^{Ramírez, Mendoza, Arreola, & Ordaz, 2010}), así como también en el presente estudio, identificamos la presencia de sesquiterpenlactonas, las cuales se han reportado con actividad contra los parásitos de la malaria y la leishmaniasis en ensayos in vitro (^{Oketch-Rabah et al., 1998}; ^{Sülsen, 2012}; ^{Cano de Terrones, 2014}; ^{Galarraga, Luis, Rojas, Offer, & Dobois, 2014}).

Con respecto al modelo de citotoxicidad con A. salina descrito en este estudio, este ha sido ampliamente utilizado en toxicología para evaluar los riesgos del uso de diversas sustancias, entre ellas los extractos de plantas, por ser una técnica fácil y económica, que además puede orientar sobre la toxicidad de muchos compuestos (^{Pino-Pérez & Jorge-Lazo, 2010}). Sin embargo, al comparar datos de toxicidad obtenidos de A. salina frente a cultivo celular, se aprecia que la CI₅₀ resulta mayor, lo cual posiblemente sea debido a la mayor complejidad bioquímica de las larvas, por lo que se hace necesario el uso de células para evaluar la toxicidad de un compuesto (^{Vega-Menchaca et al., 2013}; ^{Espitia-Baena, RobledoRestrepo, Cuadrado-Cano, Duran-Sandoval, & Gómez-Estrada, 2014}). Los compuestos presentes en el extracto de H. brasiletto abren una nueva alternativa como una posible vía de tratamiento, de acuerdo a los resultados obtenidos con la fracción Fr22. Es importante verificar mediante ensayos de toxicidad con A. salina y linfocitos humanos, si su uso se puede dirigir a organismos superiores, similar a los resultados aquí descritos y los reportados por ^{Déciga-Campos et al. (2007}), H. brasilleto es una planta no tóxica.

En conclusión, este trabajo presenta la primera caracterización parcial del extracto de H. brasiletto y la evaluación de la capacidad tripanosomicida de cada fracción del extracto, además de ser la primera evaluación de toxicidad en un modelo más complejo, cómo lo es en linfocito humano, por lo que se recomienda estudios más detallados para identificar la(s) molécula(s) responsable(s) de la actividad. De acuerdo con nuestros resultados, el extracto de H. brasiletto podría ser usado como tratamiento alternativo para la enfermedad de Chagas, sin embargo, se necesitan estudios adicionales para probar su actividad y dosis en un modelo murino con la completa identificación de los compuestos activos, sobre los cual se está investigando. También se concluye la presencia y la actividad tripanosomicida de la familia de las sesquiterpenlactonas; y se consolida la capacidad tripanosomicida del extracto de M. vulgare para futuros estudios de nuevas estrategias para el tratamiento de la enfermedad de Chagas.