La teca (Tectona grandis L.f) es un árbol tropical con gran demanda por la alta calidad de su madera y rápido crecimiento. Los programas de mejoramiento genético para esta especie han ]]>
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La teca (Tectona grandis) (Verbenaceae) es un árbol del trópico que produce una de las maderas más valiosas, principalmente para la industria del mueble (CAB Internacional 2000, Fonseca 2004). La gran demanda de madera por el mercado ha promovido el establecimiento de plantaciones y programas de mejoramiento genético de esta especie. Estos programas producen semillas de mejor calidad a través del cruce de individuos sobresalientes o a través del uso de la clonación de individuos ]]>
et ál. 2010). Por lo general, las semillas de especies forestales son almacenadas en bancos convencionales de semillas a temperaturas que varían entre los 4ºC y 20ºC y si se mantienen con un bajo contenido de humedad, teóricamente, el periodo de conservación se incrementa. Sin embargo, aún en estas condiciones de almacenamiento, las semillas sufren una progresiva pérdida de viabilidad y calidad fisiológica con el tiempo, por lo que periódicamente el material debe ]]>
et ál. 2007, Cardoso et ál. 2000). Un método que puede utilizarse para complementar esta modalidad de almacenamiento y así disminuir el riesgo de pérdida de viabilidad y asegurar la calidad del material es la crioconservación. La crioconservación consiste en el almacenamiento de células, tejidos y órganos a ultra baja temperatura esto es de -150ºC a -196ºC, por lo general en nitrógeno líquido (LN) por tiempo indefinido (Engelmann ]]>
et ál. 2004). Las principales ventajas técnicas de esta metodología de conservación son el reducido espacio en infraestructura requerido, la independencia de la electricidad para mantener las ultra bajas temperaturas y la fácil adquisición del nitrógeno líquido. Además, una vez en almacenamiento, no se require manipular las muestras, lo que reduce los costos de labor y mantenimiento. Adicionalmente, las bajas temperaturas conservan la estabilidad genética del material por largos periodos (Abdelnour 2003, ]]>
et ál. 2007, González et ál. 2004).
El principal objetivo de esta investigación fue adaptar la técnica de crioconservación, por medio de la desecación y el congelamiento rápido en nitrógeno líquido en semillas aisladas del endocarpo (semillas) y semillas ]]>
Tectona grandis). El desarrollo de esta metodología permitirá la conservación a largo plazo del recurso genetico de esta especie como reserva y complemento de otras formas de conservación.
Materiales ]]>
Como material experimental se utilizaron semillas aisladas de endocarpos (semillas) y semillas contenidas en el endocarpo (semillas con endocarpo) (Figura 1), donadas por la empresa Maderas Preciosas de Costa Rica (MACORI). El contenido de humedad tanto de las semillas como ]]>
Crioconservación de semillas
Para determinar la sobrevivencia al nitrógeno líquido, se utilizaron semillas con un contenido de humedad de 6% y se evaluaron tratamientos: semillas congeladas (NL+) y semillas no congeladas (NL-). Para cada tratamiento, 3 grupos de 25 semillas fueron subagrupadas en 5 réplicas de 5 semillas cada una y cada replica fue colocada en un criotubo de polipropileno de 2 ml. El congelamiento se efectuó por inmersión directa de los criotubos en NL. Después de una hora, los materiales fueron descongelados por incubación de los viales en un baño de agua a 40ºC por 2 min (Engelmann 2010). Una vez descongeladas, las semillas fueron desinfectadas con hipoclorito de sodio (NaOCl) al 3% i.a., durante 10 min (Abdelnour y Muñoz 2005, Ramírez et ál. 2003). Para la germinación y recuperación de plantas in vitro, las semillas fueron cultivadas individualmente en un tubo de ensayo (150 mm x 25 mm) con 10 ml del medio de cultivo descrito por Murashige y Skoog (MS) (1962) enriquecido con 0,5 mg.l-1 BAP (6-Benzylaminopurina), 3% sacarosa; el pH fue ajustado a 5,7 antes de la esterilización en autoclave (21ºC, 1,2 ATM/cm2 de presión, 25 min) y como gelificante se adicionó 2,7 g.l-1 PhytagelTM (Sigma, St. Louis, MO, USA) (Ramírez et ál. 2003). Por último, los cultivos fueron colocados en el cuarto de crecimiento a 25ºC y mantenidos en la oscuridad durante una semana, después de este periodo, fueron expuestos a un fotoperiodo de 16 h luz y 24,2 µmol.m-2.s-1 de intensidad lumínica. El material fue evaluado semanalmente durante un mes, en relación con el porcentaje de germinación, número de hojas y longitud de brote y raíz.
Crioconservación de semillas con endocarpos
Las semillas con endocarpo (contenido de humedad de 8%) fueron sometidas a 3 tratamientos pregerminativos y adicionalmente cada uno de estos fue sometido al congelamiento en NL, para obtener 6 tratamientos experimentales: semillas con endocarpo sin lijar (SL), semillas con endocarpo sin lijar + NL (SL+NL), semillas con endocarpo lijado con papel lija #100 (L), semillas con endocarpo lijado + NL (L+NL) y semillas con endocarpo lijado e incubados por 24 h en una solución de 10 mg.l-1 de AG3 (ácido giberélico) (L+AG3) y semillas con endocarpo lijado e incubadas en AG3 después del congelamiento en NL (L+AG3+NL). Las semillas con endocarpo fueron colocadas en crioviales de polipropileno de 15 ml y congelados por inmersión directa en NL, donde permanecieron durante una hora. El descongelamiento se llevo a cabo por incubación de los criotubos en un baño de agua a 40ºC durante 2 min. Los tratamientos sin la exposición al NL fueron cultivados inmediatamente después del tratamiento pregerminativo. La unidad experimental fue un endocarpo conteniendo de 1 a 3 semillas, cada tratamiento consistió de 25 endocarpos y cada tratamiento se repitió 3 veces. La germinación de las semillas con endocarpo se llevó a cabo en 2 condiciones diferentes: en cámara de germinación (30ºC y 100% humedad relativa) con Peat Moss (Sphagnum sp.) como sustrato en cajas plásticas y en condiciones de invernadero (aproximadamente 27ºC, 60% humedad relativa y 22,6 µmol.m-2.s-1 de intensidad lumínica) con arena de río lavado como sustrato.
Las variables evaluadas fueron el porcentaje de germinación, número de plantas por endocarpo, número de hojas y longitud del brote y raíz. Los ensayos se evaluaron semanalmente por un mes. Los resultados fueron analizados estadísticamente con el análisis de varianza. Las diferencias entre tratamiento fueron determinadas con la prueba de Tukey (Di Rienzo et ál. 2009, Statsoft, Inc. 2005).
Resultados
Crioconservación de semillas
Las semillas con un contenido de humedad de 6% sobrevivieron la inmersión en nitrógeno líquido por una hora. En condiciones de cultivo in vitro, el porcentaje de germinación de las mismas se incrementó con el tiempo y de acuerdo con el análisis estadístico, no se observaron diferencias significativas entre los tratamientos evaluados después de 28 días en cultivo. El porcentaje de germinación total fue 84% para las semillas congeladas (+LN) y 92% para las no congeladas (-LN) (Figura 2A).
Al evaluar las plántulas desarrolladas a partir de las semillas congeladas y no congeladas, no se observaron diferencias significativas entre tratamientos, con respecto al número de hojas, obteniéndose un promedio de 2 hojas verdaderas por planta después de 21 días en cultivo (Figura 2B). De igual manera, no se obtuvieron diferencias significativas entre tratamientos en términos de longitud de brote y la longitud promedio fue de 1 cm para ambos tratamientos, semillas congeladas y no congeladas (Figura 2C). Tampoco se observaron diferencias significativas para la longitud de la raíz, por ser la longitud promedio de 2 cm para ambos tratamientos, semillas congeladas y no congeladas (Figura 2D).
Crioconservación de semillas con endocarpo
Cuando las semillas con endocarpo fueron congeladas (8% contenido de humedad) y recuperadas en condiciones de cámara de germinación, no se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los diferentes tratamientos pregerminativos congelados en NL: SL+NL, SL+AG3 +NL, L+NL y el tratamiento que consistió de los endocarpos lijados sin congelar (L-NL), observándose alrededor de 40% de germinación a los 14 días de cultivo (Figura 3).
Por otra parte, se ]]>
3-NL (lijados e incubados en AG3) (60% de germinación). En general, se observó un efecto positivo en los porcentajes de germinación cuando se efectuó alguno de los tratamientos pregerminativos adicionales (Figura 3). El ]]>
Al comparar el desarrollo de las plantas, se encontraron diferencias significativas (p≤0,05) entre el tratamiento L+NL y los tratamientos SL+NL y L-NL, con respecto a la longitud de los brotes y la raíz, observándose las mayores longitudes promedio con el ]]>
Cuadro 1).
Las semillas con endocarpo germinadas en condiciones de invernadero, no mostraron diferencias estadísticas entre los tratamientos congelados y no congelados en NL, los tratamientos mostraron un ]]>
Figura 4A). Resultados similares fueron observados con respecto al número de plantas por endocarpo (1 planta por endocarpo) y con respecto al número de hojas por planta (2 hojas verdaderas por planta) (Figura 4B y C). En cuanto a la longitud de los brotes, a los 28 días de la siembra, no se encontraron diferencias ]]>
Figura 4D).
Discusión ]]>
Las semillas de teca con contenido de humedad de 6% no fueron sensibles a la exposición a las ultra bajas temperaturas del NL. De igual manera, las semillas con endocarpo, con contenido de humedad de 8%, fueron capaces de resistir el congelamiento en NL, pero la respuesta varió de acuerdo con las condiciones de germinación evaluadas.
Las semillas con endocarpo germinadas en condiciones de invernadero mostraron similares porcentajes de germinación, sin importar el tratamiento pregerminativo o si fueron o no congeladas, lo que parece indicar que no hubo efecto negativo del congelamiento en su germinación. De manera similar, cuando las semillas con endocarpo fueron cultivadas en cámara de germinación, los resultados después de 14 días de cultivo indicaron que, no se presentó diferencia significativa entre los tratamientos, ]]>
De acuerdo con Pritchard and Nadarajan (2008), el contenido de humedad es un factor clave para la sobrevivencia a las ultra bajas ]]>
Por otra parte, el ]]>
3) es ampliamente utilizado en ensayos de germinación para romper la dormancia en semillas, ya que induce la actividad de enzimas hidrolíticas, como la αamylasa y proteasas, que permiten la movilización de las reservas del endospermo (George et ál. 2008). Otra función atribuida a este regulador del crecimiento es en el control del ciclo celular, ya que promueve la entrada de la célula a la fase de síntesis y mitosis (Taiz y Zeiger 2006, George et ál. ]]>
La crioconservación de semillas ha sido evaluada tanto en especies herbáceas como en especies maderables (Engelmann 2010). ]]>
Cedrela fissilis y Alnus glutionosa no se presentaron diferencias significativas entre la germinación de las semillas y el desarrollo de las plantas cuando se compararon semillas congeladas y no congeladas en NL (Da costa et ál. 2003, Chmielarz 2010). En el caso de Salix alba and Salix matsudana, el congelamiento no afectó la germinación propiamente dicha, pero la ]]>
et ál. 2000). También en Pinus sp., se ha demostrado la capacidad de las semillas de resistir el congelamiento sin ver afectada su viabilidad, sin embargo, el efecto sobre la germinación varió entre las diferentes especies de este género (Pita et ál. 1998, Beardmore et ál. 2008). ]]>
Por otra parte, Salomão (2002) mencionó que al trabajar con especies forestales que presenta semillas rodeadas por un endocarpo duro, por ejemplo, en Buchenavia tomentosa and Guettarda pohliana, su germinación no se vio afectada con el congelamiento. Sin embargo, en Byrsonima basiloba, ]]>
y Spondias mombin se observó una baja germinación de las semillas que no fueron congeladas y un incremento considerablemente en la germinación de las congeladas. Pritchard y Nadarajan (2008) explican que el descongelamiento rápido después del almacenamiento a las ultra bajas temperaturas del nitrógeno líquido reduce la dureza del endocarpo y lo desquebraja al reducir su impermeabilidad al agua, lo que facilita la ]]>
Por otra parte, en Gmelina arborea, el lijado del endocarpo y la incubación en una solución de 10 mg.l-1 de AG3, ]]>
et ál. 2007). En el presente estudio con teca, el AG3 no tuvo un efecto significativo sobre la germinación de las semillas con endocarpo que fueron congeladas, lo que confirma las observaciones de Salomão (2002) sobre la variabilidad en la respuesta de las diferentes especies forestales a los factores evaluados.
Al observar los resultados obtenidos con teca durante esta investigación y con respecto al desarrollo del brote (in vitro, en cámara de germinación y en invernadero) y la raíz (in vitro y en cámara de germinación) fue evidente que para potenciar la germinación de las semillas se deben proporcionar las condiciones apropiadas de temperatura (27°C ]]>
Los resultados de esta investigación indican que la técnica de crioconservación puede ser considerada como una estrategia complementaria para el almacenamiento a largo plazo de semillas de teca, para mantener duplicados de materiales valiosos conservados por otros medios, lo que asegura la existencia del recurso. Literatura Citada
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*Correspondencia a: Ana Hine Gómez. Autor para correspondencia. Correo electrónico: ana.hine.gomez@una.cr. Instituto de Investigaciones forestales (INISEFOR), Universidad Nacional, Heredia, Costa Rica. Pilar Vargas Castillo. Centro de Investigación en Biotecnología (CIB), Instituto Tecnológico de Costa Rica, Cartago, Costa Rica. Ana Abdelnour Esquivel. Centro de Investigación en Biotecnología (CIB), Instituto Tecnológico de Costa Rica, Cartago, Costa Rica. 1/ Autor para correspondencia. Correo electrónico: ana.hine.gomez@una.cr * Instituto de Investigaciones forestales (INISEFOR), Universidad Nacional, Heredia, Costa Rica. ** Centro de Investigación en Biotecnología (CIB), Instituto Tecnológico de Costa Rica, Cartago, Costa Rica.
Recibido: 19/09/12 Aceptado: 01/03/13
]]>200327200551-112007198-103200836171-185CAB INTERNACIONAL20002000267-71201031139-146200312837-84820092010475-162007267-791999II884200420083a ed2-320043341-351INTERNATIONAL SEED TESTING ASSOCIATION (ISTA)20087INTERNATIONAL UNION OF FOREST RESEARCH ORGANIZATION.^dFOREST GENETICS MEETING PROCEEDINGS.2004105-1102000861017-1021196215473-49719984220-2232008485- 49420033161-1672002928-92920022133-138STATSOFT INC200520064th ed47820101105-119