Elizabeth García^1/*, Ronald Ferrera^**, Juan José Almaráz^**, Refugio Rodríguez^***, Edelmira García^*


correpsondencia

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Resumen

El queroseno afecta de manera negativa la actividad biológica del suelo, así como el crecimiento y desarrollo de las plantas. Para analizar lo anterior, se evaluó este contaminante en avena (Avena sativa), cebada (Hordeum vulgare), pasto (Chloris gayana) y trigo (Triticum aestivum), en las poblaciones microbianas de la rizósfera y el rizoplano, así como el porcentaje de degradación del contaminante en suelo rizosférico. Se empleó un diseño experimental completamente al azar con un arreglo factorial 2 x 4, con 8 tratamientos y 5 repeticiones en cada uno. Los factores fueron dosis de queroseno (0 y 2000 mg.kg^-1) y especie de planta. A los 56 días de haber establecido el experimento, el suelo contaminado redujo de manera significativa (p≤0,05) el área foliar, la materia seca total y el volumen radical de las 4 gramíneas, con respecto a las establecidas en el suelo sin contaminar. En el suelo contaminado se incrementaron las poblaciones de bacterias tota-les en el rizoplano y la rizósfera de las plantas; mientras que las que emplearon el hidrocarburo como fuente de carbono se incrementaron en el rizoplano. La colonización micorrízica fue del 28,8 al 15,7% y al contaminar el suelo se redujo del 11,4 al 5%; sin embargo, el hongo endomicorrízico realizó sus funciones aun con la presencia del hidrocarburo en el suelo. La rizósfera de avena permitió una degradación de queroseno del 84,4%, mientras que la de pasto sólo del 39,6%. Es conveniente ampliar los estu-dios rizosféricos con otro contaminante orgánico para determinar la efectividad de la rizósfera de avena y evaluar si el hidrocarburo se acumula en sus tejidos.

Palabras clave: Hidrocarburos, contaminación, gramíneas, poblaciones microbianas.

Abstract

Kerosene biodegradation in the grasses’ rizosphere under greenhouse conditions. Kerosene affects in a negative way the soil biological activity, also the growth and development of the plant. To examine the aforesaid, this contaminant was evaluated in oats plants (Avena sativa), barley (Hordeum vulgare), grass (Chloris gayana) and wheat (Triticum aestivum), in the microbial populations of the rizosphere and rhizoplane. Also determined was the contaminant’s degradation percentage in the rizospheric soil of the different grasses. A completely at random experimental design with a 2x4 factorial arrangement, was used, with 8 treatments and 5 repetitions each. The factors were kerosene doses (0 and 2000 mg.kg ^-1) and plant species. At 56 days after establishment of the experiment, the contaminated soil reduced significantly (p≤0.05), the foliar area, the total dry matter and the root volume of the 4 grasses, compared to those established in soil without contamination. In the contaminated soil the total microbial populations in the rhizoplane and the plant rizosphere increased; while those that used the hydrocarbon as carbon source increased in the rhizoplane. The mycorrhizal colonization went from 28.8 to 15.7%, and when the soil was contaminated it was reduced from 11.4 to 5%; however, the endomycorrizal fungus performed its functions even with the hydrocarbon present in the soil. The oats rizosphere allowed a kerosene degradation of 84.4%, while that of the grass only 39.6%. It is convenient to expand the rizospheric studies with another organic contaminant, to determine the oats’ rizospheric effectiveness and to evaluate if the hydrocarbon is accumulated in its tissues.

Keywords: Hydrocarbons, contamination, grasses, microbial populations.

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Introducción

La actividad petrolera en México es de suma importancia por las divisas que genera; sin embargo, es una fuente potencial de contamina-ción, en donde los mayores problemas ocurren durante la explotación, la ]]>

La rizósfera de las plantas proporcio-na condiciones favorables para las poblaciones microbianas y su diversidad, constituida prin-cipalmente por bacterias y hongos, provee un microambiente complejo y dinámico, donde la microflora en asociación con las raíces forman comunidades únicas que responden a exudados radicales (López et ]]> Medicago sativa), haba (Vicia faba) y pasto Ryegrass (Lolium perenne), aunque las plantas exhibieron un crecimiento normal con el 1% de hidrocarburos en el suelo; la degradación fue mayor en alfalfa y haba con el 36,6 y 35,6%, respectivamente, comparado con el 24% de la rizósfera de pasto. Por otro lado, Pérez et ál. (2000) y Hernández et ál. (2003) menciona-ron que en la rizósfera de frijol ]]> -1 de petróleo en el suelo favoreció el crecimiento de plántulas de maíz, debido a que en su rizósfera proliferaron rizobacterias, las cuales promueven el crecimiento de las plan-tas; mientras que con una ]]> -1 de petróleo y con la adición de enmiendas orgánicas, se beneficia el desarrollo de maíz (Marques et ál. 2010).

Por lo anterior, el objetivo del estudio fue evaluar el efecto de 2000 mg.kg-1 de queroseno sobre el crecimiento y el desarrollo de avena (Avena ]]> ), cebada (Hordeum vulgare), trigo (Triticum aestivum) y pasto Rhodes (Chloris gayana), y su degradación en la rizósfera.

Materiales y Métodos
]]> El experimento se desarrolló bajo condiciones de invernadero; el suelo se colectó en el campo experimental de Lomas de San Juan, per-teneciente a la Universidad Autónoma Chapingo, Municipio de Texcoco, Estado de México. Una vez que el suelo se trasladó al laboratorio, se tomó una muestra para determinar pH, materia orgáni-ca, capacidad de intercambio catiónico, textura, densidad aparente, N-inorgánico, P, K, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn y Mn, ]]>

Se emplearon semillas de avena, cebada, trigo y pasto, con un porcentaje de germinación de 80, 85, 95 y 95%, respectivamente. Se agregó a charolas de plástico una mezcla estéril de suelo-germinaza (1:1 v/v) y se colocaron las diferentes semillas. Después de la emergencia de las plántulas (7 días) se realizó el ]]> Glomus intraradix, propagado en plantas de sorgo; el inóculo consistió en raíces con 81,7% de colonización total y 680 esporas por 100 g de arena.

El diseño experimental fue completamente al azar con un arreglo factorial 2 x 4 (8 tratamientos ]]> -1) y tipo de planta (avena, cebada, pasto y trigo). Para la contaminación del suelo, se realizó una mezcla homogénea de agua y queroseno mediante una agitación rápida, para enseguida incorporarla al suelo. Se trasplantaron las plántulas a cada unidad experimental y al mismo tiempo se agregaron 15 g de inoculó del hongo endomicorrízico. El suelo se mantuvo a humedad constante por 56 días. Al término, las plantas se cortaron a ras de suelo, se separaron ]]> oC hasta obtener peso constante. Las raíces libres de suelo de las diferentes gramíneas se colocaron en cápsulas esterilizables y se depositaron en un vaso de precipitado al que se le agregó KOH al 10%, el clareo se realizó en una olla de presión por 10 ]]> 2O₂ al 10% por 3 min (blanqueo); se realizó un enjuague y se cubrieron las cápsulas con HCl al 10% por 3 min (acidificación); se agregó azul de tripano con lactoglicerol al 0,05% y se colocó el vaso de precipitado con las cápsulas en una olla de presión por 10 min a 10 lb (tinción). Los segmentos de raíz se colocaron en un portaobjetos para observarlos al microscopio óptico; se registró la presencia o ausencia de hifas, vesículas y arbúsculos ]]>
Las poblaciones microbianas totales (bac-terias, bacterias fijadoras de nitrógeno atmosféri-co de vida libre y hongos) y aquellas que toleran queroseno se determinaron por el método de dilución y cuenta viable de unidades formadoras de colonias (UFC) crecidas en cajas Petri con medio de cultivo específico para cada grupo microbiano (Clark 1965 y Parkinson ]]> 2PO₄; 0,8 g K₂HPO₄; 0,1 g NaCl; 4,9 ml FeEDTA; 0,025 g Na₂MoO₄.2H₂ O; 0,2 g MgSO₄.7H₂O; 0,06 g ]]> 2 .2H₂O; 0,1 g extracto de levadura; 5 g manitol; 5 g sacarosa; 0,5 ml lactato de sodio (60% v/v): 5 µg biotina y 10 µg ácido p-amino benzoico; pH 7). Para las poblaciones de bacterias tolerantes al queroseno se usó el medio mine-ral (Morales 1969) (por l: 5 g KH₂PO₄; 2,5 g MgSO₄.7H₂O; 0,8 g CaCl₂.2H₂O; 7 g NH₄ Cl; 80 µg CuSO₄.5H2 O; 200 µg ]]> µg FeCl₃.6H₂O; 800 µg MnSO₄.7H₂O; 800 µg ZnSO₄.7H₂O; 400 µg Na₂ MoO₄.7H₂O: 30 µg actidiona; pH 7. Para las bacterias fijadoras de nitrógeno tolerantes al contaminante el medio carbón combinado; modificado por Hernández et ál. (2003) (por l: 0,2 g KH₂PO₄; 0,8 g K₂HPO₄; ]]> 2MoO₄.2H₂O; 0,2 g MgSO₄.7H₂O; 0,06 g CaCl₂.2H₂O: 5 µg biotina y 10 µg ácido p-amino benzoico; pH 7) y finalmente para las poblaciones de hongos tolerantes a queroseno el medio mineral agar+rosa de bengala (por l: 3 g NH₄NO₃; 1 g KH₂PO₄; 0,5 g MgSO₄.7H₂O; 0,5 g KCl: ]]> µg de estreptomicina; pH 7). En los 3 casos el queroseno se aplicó en papel embebido y adherido en el interior de la contratapa de la caja de Petri. Las cajas se incu-baron de 24-72 h a 28ºC.

A los 56 días se determinó la degradación del queroseno en suelo rizosférico; la extracción se realizó con hexano ]]> 18. Para la lectura de las muestras se utilizó un cromatógrafo de líquidos (HPLC) marca Varian 9012 con un detector UV-VIS Varian 9050, columna C18; la fase móvil fue ace-tonitrilo (CH3CN) 80% y agua 20% con un flujo de 0,5 ml min^-1, la longitud de onda utilizada ]]>

Resultados y Discusión

]]> Efecto del queroseno en la planta

En el (Cuadro 1) se presentan los valores de los parámetros edáficos y nutrimentales del suelo utilizado en el experimento.
]]> El suelo presentó una baja fertilidad, el pH fue medianamente alcalino; la materia orgánica, capacidad de intercambio catiónico, N-inorgánico y P se encontraron en concentraciones bajas, K, Ca y Mg fueron aceptables. Fe y Cu se encontraron en niveles adecuados, mientras que Zn y Mn en concentraciones deficientes, de acuerdo con la clasificación que establece la NOM-021- SEMARNAT-2000 (DOF 2002). La textura del suelo empleado presentó un contenido de ]]>

Las plantas a los 56 ]]> Cuadro 2). La interacción especie de planta X dosis fue significativa (p≤0,05) en todas las variables, lo que indica que por lo menos alguna de las especies evaluadas es más sensible al efecto negativo del queroseno. Las plantas al ]]> -1, Pérez et ál. (2010) reportaron que plantas de maíz presentaron una mayor altura; sin embargo, existió un menor desarrollo radical. Thompson et ál. ]]> -1 el pasto Cynodon dactylon L., tuvo una reducción en el crecimiento del tallo, biomasa radical y la longitud de la raíz. Por otro lado, las plantas de trigo y maíz son gramíneas que mostraron un mayor crecimiento en un suelo contaminado con una mezcla de hidrocarburos (1% diesel/aceite) a diferencia de lo encontrado en este trabajo con la planta de trigo.
]]> Poblaciones microbianas

El tipo de planta, la dosis de queroseno y la interacción de ambos factores tuvieron un efecto significativo en la población total de bacterias, las BFNA y los hongos totales (p≤0,05) tanto en el suelo de rizoplano como en el ]]> Cuadro 3). En el suelo de rizoplano sin contaminar, las bacterias fueron significativamente mayores en trigo, las BFNA en cebada y el número de hongos totales en avena (p≤0,05). En el suelo rizosférico, las bacterias y las BFNA fueron significativamente más altas en el pasto, mientras que los hongos en cebada (p≤0,05). Por otro lado, en el suelo de rizoplano contaminado las bacte-rias y hongos totales fueron significativamente mayores en trigo (p≤0,05) y las poblaciones de BFNA en cebada (p≤0,05). Al comparar las poblaciones microbianas en el rizoplano entre los ]]> Cuadro 3). En tanto, en la rizósfera la población de bacterias fue significativamente mayor en trigo y las BFNA en el pasto; mientras que, los hongos en cebada. La rizósfera provee un microambiente complejo y dinámico, donde las bacterias y hongos en asociación con las raíces forman comunidades únicas que responden a exudados radicales, los cuales cumplen un ]]> 3 a 3,4 x 10⁶ UFC/g de bacterias y 1,4 x 10² a 2,3 x 10⁴ UFC/g de ]]>

En el (Cuadro 4) se observan las pobla-ciones de microorganismos que utilizan a los hidrocarburos del queroseno como fuente de carbono y energía. En el suelo sin contaminar, en el rizoplano del pasto se observó un mayor ]]> -1 de queroseno las poblaciones totales de bacterias fueron mayores en el rizopla-no del pasto, con respecto a las otras gramíneas y no existieron diferencias significativas entre plantas con respecto a las poblaciones de BFNA; en cambio, las ]]> Sphingobacterium sp., Bacillus sp., y ]]> Achromobacter sp., aisladas de la rizósfera de maíz (Marques et ál. 2010), Pseudomonas aeruginosa AT18 (Pérez et ál. 2010) y Pseudomonas sp., bacteria que se desarrolla favorablemente en un suelo con 6400 mg.kg^-1 de queroseno (Kabelitz et ál. 2009), Pseudomonas desmolyticum NCIM 2112 (Pd 2112) y ]]> Nocardia hydrocarbonoxydans NCIM 2386 (Nh 2386) (Kalme et ál. 2008), Cladosporium, Candida, Bacillus y Microoccus (Etuk et ál. 2012) que toleran y son capaces de realizar su metabolismo a través del empleo de los hidrocarburos del petróleo como fuente de carbono y energía. Respecto a las BFNA, se ha reportado que Azotobacter nigricans (García ]]> Nitrosomonas y Nitrobacter (John y Okpokwasili 2012), son bacterias nitrificantes capaces de utilizar el queroseno como fuente de carbono. Por otro lado, Muratova et ál. (2005) reportaron que poblaciones de Azospirillum sp., aisladas de la rizósfera de la planta de trigo incre-mentaron la degradación de los hidrocarburos del petróleo, además de promover el desarrollo del sistema ]]>

En la (Figura 1) se muestra que en el suelo sin contaminar el pasto y avena presentaron el mayor porcentaje de colonización micorrízica, respecto a lo encontrado en las plantas de cebada y trigo (p≤0,05). En cambio, con la presencia de queroseno, las plantas de cebada y avena tuvieron una colonización por el hongo Glomus ]]> significativamente mayor que en las plantas de trigo y pasto.

Por lo que con base en estos resultados, las gramíneas cebada y avena se pueden considerar para incrementar la biodegradación de sitios contaminados por queroseno. En este sentido, Chen et ál. (2013) mencionan que actualmente la rizoremediación es un proceso de ]]> Glomus mosseae P2, BEG69 en el pasto Ryegrass establecido en un suelo contaminado con una mezcla de 500 mg.kg^-1 de antraceno, 500 mg.kg^-1 de criseno y 50 ]]> -1 de dibenzo(a,h) antraceno, encontraron una colonización total del 4%, menor a lo reportado en este trabajo con el pasto Rhodes y Glomus intraradix. Alarcón et ál. (2006) reportaron que la disipación del benzo[a] pireno de la rizosfera fue mayor en plantas no inoculadas en comparación con plantas micorrizadas con Gigaspora margarita. Echinochloa polystachya (pasto alemán) ]]> Glomus geosporum y Glomus intraradices pueden absorber fenan-treno y antraceno del suelo y acumularlo en sus esporas. Sin embargo, cuando se absorbe por las hifas el contaminante no se degrada, se mantiene sin modificaciones; por lo que al inmovilizarse el contaminante en las esporas se reduce la con-centración alrededor de las raíces de las plantas.

Degradación de queroseno

A los 56 días se observó una degradación de queroseno en avena del 84,4% y en cebada del 81,5%; mientras que en pasto fue del 39,6% y en trigo del ]]> 200 mg.kg^-1 de antraceno a través de la rizósfera de maíz. A los 30 días se logró una degradación del 54,9%. En otro estudio, se reporta que en la rizósfera de maíz existió una degradación de diesel del 84,5% y al inocular el suelo con la bacteria Gordonia sp. S2RP-17 más la presencia de la planta existió una degradación del 95,8%, por lo que ambos, la planta de maíz y Gordonia sp. S2RP-17 son una prometedora estrategia para incrementar la eficiencia de la ]]> Azospirillum brasilense a un suelo contaminado con 30 mg.kg^-1 de fenantreno, la rizósfera del pasto alemán (Echinochloa ]]> ) presentó una degradación del 57% (Martínez et ál. 2007). Agarry et ál. (2010) mencionaron que una baja población microbiana en un proceso de degradación se puede deber a la deficiencia de nutrimentos en el suelo, los cuales son necesarios para el crecimiento bacteriano e incrementar la biodegradación. En este sentido, Ghulam et ál. (2008) evaluaron la biodegradación de queroseno en el suelo (4% p/p) con un cultivo bacteriano mixto estimulado con la adición de N, P y K. A las 6 semanas se obtuvo una degrada-ción del 65% y el contenido de N se redujo del 54 al ]]>

Conclusiones

El queroseno provocó una disminución significativa del área foliar, la materia ]]>

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Literatura Citada

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Correspondencia a:
*Elizabeth García: Centro de Investigación en Genética y Ambiente de la Universidad Autónoma de Tlaxcala, Tlaxcala, México.1 Autor para correspondencia. Correo electrónico: gallegoseg@hotmail.com
**Ronald Ferrera: Instituto de Recursos Naturales, Colegio de Posgraduados en Ciencias Agrícolas, Montecillo, Estado de México.
**Juan José Almaráz:Instituto de Recursos Naturales, Colegio de Posgraduados en Ciencias Agrícolas, Montecillo, Estado de México.
***Refugio Rodríguez: Departamento de Biotecnología y Bioingeniería del CINVESTAV-Instituto Politécnico Nacional, México, D.F.
*Edelmira García: Centro de Investigación en Genética y Ambiente de la Universidad Autónoma de Tlaxcala, Tlaxcala, México.

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