Resistencia genética de híbridos de tomate (Solanum lycopersicum L. (Mill.) Al virus del bronceado (TSWV)
Genetic resistance of tomato hybrids (Solanum lycopersicum L. (Mill.) to tomato spotted wilt virus (TSWV)
Julio Gabriel1/*+, Daniel Sanabria**+, Silene Veramendi*, Giovanna Plata*, Ada Angulo*, Mario Crespo*
*Dirección para correspondencia: ]]>
Resumen La presente investigación se realizó en el invernadero y laboratorio de la Fundación PROINPA en Cochabamba - Bolivia en el 2012. El objetivo fue evaluar la resistencia y suscep-tibilidad de plantas a los virus Tomato spotted ]]>
+). Solamente la variedad PROINPA 7 (Redonda), el padre 71 89S LACHING SW-5 y la variedad Shannon mostraron el gen de suscep-tibilidad (S) al TSWV a 900 bp en estado homo-cigoto recesivo (Sw-5+/Sw-5+). Los análisis de severidad y de DAS-ELISA fueron confirmados con el análisis molecular. ]]>
Palabras clave: DAS-ELISA, severidad, homocigosis, heterocigosis, susceptibilidad, alelo.
Abstract This research was conducted at the PROINPA Foundation’s greenhouse and laboratory in Cochabamba, Bolivia in 2012. Its objective was to evaluate the resistance and susceptibility to Tomato spotted wilt virus – TSWV, Tomato cholorotic spot virus– TCSV and Groundnut ringspot virus – GRSV in 10 tomato hybrids. Phenotypic and molecular pattern (SCAR marker SW-421) evaluations were performed in order to differentiate homozygous and heterozygous resistant from susceptible plants. Results ]]>
+). Only PROINPA 7 (Redonda), the male parent 71 LACHING 89S Sw-5 and the variety Shannon showed TSWV susceptibility ]]>
+/Sw-5+). The results of the severity analysis and of DAS-ELISA were confirmed by the molecular analysis.
Las enfermedades causadas por virus son consideradas un obstáculo para el cultivo del tomate [(Solanum lycopersicum L. (Mill,)] ya que causan pérdidas significativas en la producción. En Bolivia, como lo indica una reciente investigación (Plata 2011) el Tomato spotted wilt virus – TSWV, el Tomato cholorotic spot virus – TCSV y el Groundnut rigspod virus – GRSV son los más importantes virus causantes del Tospovirus (virus del bronceado o peste negra), y confirma lo ya indicado por Abad (2005). Similar situación se ha reportado en otros países como Brasil, donde además tienen al Crysanthemum stem necrosis virus – CSNV que afecta al tomate (Lima et ál. 2002, Ferraz et ál. 2004, Lau et ál. 2006).
Se debe mencionar que la resistencia genética del tomate al virus TSWV se ha visto en distintas accesiones en el género Lycopersicum (García y Lozoya 2004, Robertson y Labato 2007). Algunos alelos de resistencia se introdujeron en cultivares comerciales, como el Rey de los Tempranos que tiene resistencia de Lycopersicum ]]>
y Stevens que tiene resistencia de L. peruvianum. Estos cultivares son las 2 principales fuentes de resistencia utilizadas en el control genético del TSWV en los programas de mejoramiento en Brasil y otros países (Ferraz 2004, Rodrigues do Nascimento et ál. 2009). La resistencia en el cultivar Stevens es controlado por un gen, denominado Sw-5 con interacción alélica dominante (Rosello et ál. 1998, Stevens et ál. 1992, Juliatti y Maluf 1995), mientras que para el cultivar Rey de los Tempranos la resistencia es ]]>
Se atribuyeron muchas ventajas a la selección asistida por marcadores moleculares (SAMM) (Moon y Nicholson 2007, Foolad 2007) como efecto de la ausencia del efecto medio ambiental y la independencia del desarrollo de la planta, que es considerado por algunos autores como uno de los principales problemas ]]>
Referente a la resistencia al virus es posible piramidar múltiples alelos de resistencia. En el caso de TSWV, el marcador SCAR SW- 421 podría ser una herramienta importante para la SAMM. Varios marcadores moleculares ]]>
Stevens et ál. (1995) ]]>
El objetivo del presente estudio fue evaluar la resistencia y susceptibilidad de plantas en híbridos de tomate por evaluación fenotípica y del patrón molecular a través del marcador SCAR (Sw-421), que distingue los homocigotos (Sw-5/ Sw-5) y heterocigotos (Sw-5/Sw-5+) ]]>
+/ Sw-5+).
Materiales y Métodos
El estudio se realizó en la campaña 2012 en el invernadero y laboratorio de biología ]]>
Se utilizaron 10 híbridos y 2 parentales de tomate obtenidos en el programa de mejoramiento genético de la Fundación PROINPA (Gabriel et ál. ]]>
QTLs y genes de resistencia conocidos
Se utilizó el marcador Sw-421 que fue compendiado en una lista de marcadores potenciales que están ligados y co-localizados con el gen de resistencia al ]]>
Cuadro 1 se describe el gen de resistencia a TSWV mientras que en el Cuadro 2 los marcadores en los híbridos para el cribado del gen Sw-5 de resistencia a tospovirus (TSWV) en tomate.
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Extracción de ADN
Se colectaron foliolos jóvenes y sanos de 10 híbridos y 2 parentales de tomate, provenientes de invernadero y almacenadas a -20ºC.
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El ADN genómico total fue extraído a partir del material vegetal molido mediante el método CTAB 2X (hexadecil bromuro de trimetil amonio) desarrollado por Doyle y Doyle (1990). La calidad y concentración del ADN obtenido fue evaluado después de la tinción con bromuro de etidio en geles de agarosa al 1% y transluminador UV marca Biorad.
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Condiciones de la PCR
Para el análisis de PCR se siguió el protocolo desarrollado por Rodrigues do Nascimento et ál. (2009) con algunas modificaciones, donde la mezcla de reacción contenía 15 ng de ADN genómico, buffer PCR 10X, 0,2 mM dNTP, 1 pmol.µl-1 de cada iniciador y ]]>
-1 de la enzima Tag polimeraza.
Las condiciones de reacción consistieron en 94ºC por 5 min, 35 ciclos de 94ºC por 1 min, 60ºC por 45 s y 72ºC por 60 s. (T100 Thermal Cycler marca BioRad). Los productos de amplificación fueron separados en geles de agarosa. ]]>
Análisis de alelos
La presencia o ausencia del marcador molecular validado en cada híbrido, se anotó y almacenó en archivos con formato EXCEL para su posterior análisis. ]]>
Resistencia en plantas
Se lavaron 10 semillas de cada uno de los híbridos en investigación con solución de Metil-1-(butilcarbamoil)-2-bencimidazol-carbamato (Benomyl) y se las colocó en cámara húmeda esto es, cada semilla en ]]>
-1) y un insecticida con ]]>
-1).
Inoculación
Para el experimento se utilizaron 65 plantas sanas de tomate con 90 días de edad distribuidas en ]]>
Como testigos se utilizaron 6 plantas entre las mismas accesiones, las cuales se trataron únicamente con el abrasivo y el buffer fosfato, y se las mantuvo en otro invernadero durante todo el experimento. ]]>
Se realizó la serología a 3 plantas infectadas y con sintomatología en invernadero, y se confirmó un DAS-ELISA positivo (+) para una única planta, las otras 2 presentaron resultado negativo (-). Con base en estos resultados se volvió a extraer el inóculo solo de la planta confirmada y se efectuó una segunda inoculación a los 7 días después la primera inoculación y una tercera inoculación a los 9 ]]>
Análisis de la severidad
En las plantas inoculadas en invernadero se realizaron evaluaciones de severidad con la escala recomendada por López et ál. (2003) para ubicar las ]]>
Cuadro 3).
Análisis serológico por DAS-ELISA
Inoculación
El inoculo, con TSWV previamente identificado por DAS-ELISA, se preparó por maceración de hojas sintomáticas en una dilución de 1/10 (P/V) en tampón fosfato 0,01 M con Sulfito de Na al 0,1% y pH 7,22 con adición final de carburundum. El inoculo se mantuvo en un baño de hielo durante todo el proceso de la inoculación ]]>
Se realizó el análisis serológico en 65 plantas inoculadas con síntomas de TSWV y en 5 plantas testigo, mediante el DAS-ELISA (Double Antibody Sándwich – enzyme linked immunosorbent assay). Se llevo a cabo un análisis serológico para GRSV y TSCV en las mismas plantas. Se utilizaron antisueros de la línea ]]>
Se colectaron 2 g de 5 plantas por híbrido, obteniéndose un total de 14 muestras para la prueba.
Para sensibilizar la placa se disolvió 0,146 g de NAHCO3 y 0,079 g de NA2CO3 ]]>
3 y finalmente se agregó 100 µl de la gamma globulina purificada y se incubó a 4ºC toda la noche.
Preparación de las muestras para su análisis
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Según protocolo del fabricante la muestra se utilizó en relación 1:4 (Cuadro 4). Se utilizó 100 µl de la muestra diluida y testigos (Blanco y control para TSWV).
Se incubó la placa con los ]]>
-1 se incubó a temperatura ambiente por 30 min. Las lecturas se realizaron a 450 nm en lector de ELISA.
Resultados
Análisis de la resistencia
Los resultados mostraron que los híbridos cuyo padre fue la especie silvestre 70 89R Sw-5/ Sw-5 ]]>
Solanum peruvianum) portador del gen Sw-5 en estado homocigoto transfirió exitosamente el gen de resistencia a TSWV (Cuadro 5). Cabe mencionar que tampoco se observaron síntomas típicos de GRSV y TCSV, lo cual se confirmó con la prueba de DAS-ELISA que no detectó la presencia de estos virus (Cuadro 5).
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Se observó que el híbrido PROINPA 7 (Platus x 71 89S LACHING Sw-5) mostró un síntoma leve de atrofiamiento en el crecimiento (escala 1) y fue positivo en la prueba de DAS-ELISA con un valor de 0,139 de absorbancia (Cuadro 5), dicho aspecto indica que este híbrido fue susceptible a TSWV. En cambio, el híbrido PROINPA 6 (Martha x 71 89S LACHING Sw-5), no mostró síntomas de severidad a ]]>
+) (Cuadro 6), pero si mostró reacción al GRSV y TCRV (Cuadro 5), lo que denota que tuvo susceptibilidad a ambos tipos de virus.
Análisis molecular
La temperatura de hibridación (Tm) del iniciador al ADN genómico se realizó en una PCR de gradiente, determinándose una Tm de 60ºC como la más optima y en la cual se logró una ]]>
El análisis molecular (Figura 1 y Cuadro 6) mostró que las variedades PROINPA 2 (Aguaí), y PROINPA 9 (Bonita) tienen el gen de resistencia (R) a ]]>
+) y se las ubicó entre 900 -940 bp. Solamente en la variedad PROINPA 7 (Redonda), el padre 71 89S LACHING Sw-5 y la variedad Shannon, presentaron el gen de susceptibilidad (S) al TSWV en estado homocigoto recesivo (Sw-5+/ Sw-5+) y se la detectó a ]]>
Discusión
El método de ADN con el uso de CTAB, fue eficiente y conveniente para la extracción a partir de pequeñas muestras de tejido (Ferreira y Grattapaglia 1998), ]]>
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Cabe mencionar que investigaciones realizadas por Boiteux y De Giordano (1993) encontraron que el mismo gen de resistencia al TSWV le confiere resistencia a GRSV y TCSV, lo cual nos hace ver la gran importancia de incorporar genes de especies silvestres emparentadas con el tomate. En nuestra investigación los análisis han mostrado que aparentemente se ha logrado el control efectivo de los 3 virus con el gen Sw-5 introducido de Solanum peruvianum en algunos de los híbridos evaluados.
También se identifica que la enfermedad evoluciona y como solución más práctica se identifica la necesidad de buscar y seleccionar nuevas fuentes de material con resistencia natural contra las nuevas variantes de TSWV. En este sentido, esta investigación ha procurado obtener nuevas fuentes de resistencia, mediante inoculación mecánica de aislados virales que superan la resistencia, en entradas de diferentes ]]>
Solanum habrochaites, S. chilense, S. pennellii, S. peruvianum y S. pimpinellifolium (Peralta et ál. 2007). En el futuro se espera determinar el control genético de estas resistencias para, transferir luego, los genes responsables, a ]]>
Por otra parte también se observó que la evaluación fenotípica confirmó la eficiencia en el proceso de inoculación y mostro reacción diferencial de los genotipos de acuerdo con la presencia o ausencia del alelo Sw-5. El marcador molecular permitió la identificación de homocigotos Sw-5/Sw-5 y ]]>
+ en las plantas resistentes, resultados similares a los encontrados por Rodrigues do Nascimento et ál. (2009) al evaluar progenies isogénicas segregantes de tomate.
Agradecimientos
Se agradece al apoyo ]]>
Lycopersicon spp., para su utilización en mejoramiento genético de Solanáceas frente a estrés biótico y abiótico (ID: 8071) y “Fortaleciendo capacidades de innovación participativa para luchar contra la pobreza rural” (IP – Holanda).
Literatura Citada
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*Correspondencia a: Julio Gabriel. Fundación PROINPA, Casilla 4285, Cochabamba, Bolivia. Autor para correspondencia. Correo electrónico: j.gabriel@proinpa.org Daniel Sanabria. Facultad de Bioquímica y Farmacia de la Universidad Mayor de San Simón, Cochabamba, Bolivia. Silene Veramendi. Fundación PROINPA, Casilla 4285, Cochabamba, Bolivia. Autor para correspondencia. Giovanna Plata. Fundación PROINPA, Casilla 4285, Cochabamba, Bolivia. Autor para correspondencia. Ada Angulo. Fundación PROINPA, Casilla 4285, Cochabamba, Bolivia. Autor para correspondencia. ]]>
Mario Crespo. Fundación PROINPA, Casilla 4285, Cochabamba, Bolivia. Autor para correspondencia. 1. Autor para correspondencia. Correo electrónico: j.gabriel@proinpa.org * Fundación PROINPA, Casilla 4285, Cochabamba, Bolivia. ** Facultad de Bioquímica y Farmacia de la Universidad Mayor de San Simón, Cochabamba, Bolivia.