En 1934 Ernest Ruska desarrolló un sistema de electroimanes para concentrar y enfocar un haz de electrones de manera análoga a la acción que ejerce un lente de vidrio sobre un haz de luz. Este dispositivo, que luego se denominaría "lente electromagnético" le permitió construir el primer microscopio electrónico, cuyo aumento máximo era de 16 X. Sin embargo, este fue el inicio de la era de la microscopio electrónica, que se bifurcaría en os grandes corrientes, la microscopio electrónica de transmisión y la microscopio electrónica de rastreo. En paralelo se desarrolló otra metodología, que permite el análisis elemental de la muestra mediante el patrón de dispersión de rayos X generados por la interacción del haz de electrones con la muestra ( 2 ).El objetivo de esta revisión es mostrar la aplicación biomédica de la microscopio electrónica en conjunto con el microanálisis elemental, empleando un detector de rayos X, que permite conocer la composición química de la muestra en la micro-área irradiada sin que esta tenga que ser destruida.
Microscopio electrónico de transmisión ]]>
El microscopio electrónico de transmisión (MET), al igual que ocurre en el microscopio de luz, forma una imagen con el haz de energía que atraviesa la muestra; que en el caso de MET se trata de electrones acelerados a muy alto voltaje y en el microscopio de luz se trata de luz visible. Por eso, a este microscopio electrónico se le denominó de transmisión y siguiendo tal razonamiento, al microscopio de luz: microscopio de luz transmitida ( 3 ).
Para que los electrones atraviesen la muestra sin destruirla por calentamiento debe seguirse un procesamiento, que resulta un tanto similar al que se sigue para obtener los cortes histológicos para microscopio de luz. En resumen, los tejidos deben fijarse químicamente, deshidratarse e incluirse en un medio de soporte para hacer los cortes. En el caso de microscopia electrónica, la fijación se realiza con aldehídos (usualmente glutaraldehído y paraformaldehído) y el medio de inclusión más corriente son resinas epóxicas de gran dureza. Los cortes deben tener un grosor máximo de unos 100 nm; recordemos que para luz se usa parafina como medio de inclusión y los cortes usualmente son de alrededor de 5 ìm de espesor, o sea unas 50 veces más gruesos que lo requerido en MET. Luego los cortes deben contrastarse, lo que usualmente se denomina "tinción", aunque en microscopio electrónica no se maneja el concepto de color, pues este corresponde a una pequeña porción del espectro electromagnético ( 
de 0,4 a 0, 7 ìm). El contraste en realidad consiste en una impregnación del tejido con sales de metales pesados, como acetato de uranilo o citrato de plomo, que aumentan la electrondensidad en el sitio de deposición, esto hace que algunas zonas aparezcan oscuras o negras en la pantalla, lo que contrasta con lo claro de las zonas no impregnadas con esos metales ( 4 ).La gran diferencia en los aumentos logrados en el MET estriba en el límite de resolución (d). Tanto en et microscopio de luz como el MET la resolución obedece ala ecuación de Abbe: d = 0,62 / 2 AN. Donde ~ se refiere a la longitud de onda empleada para generar la imagen y AN es la abertura numérica del lente. En el caso del microscopio de luz, corresponde a 0,55 ìm (promedio del espectro visible humano) y la AN oscila alrededor de 1,3. El valor 2 se refiere a que suma la AN del objetivo y la del condensador que deben ser iguales según la ley de Rayleigh. Esto produce un límite de resolución de aproximadamente 0,22 ìm para el microscopio de luz (1). La limitante en el poder de resolución del microscopio de luz es la propia longitud de onda de la luz; lo que fue superado en el ME empleando electrones acelerados a gran velocidad (alto voltaje) de manera que se mueven en forma ondulatorio, con una que depende del voltaje de aceleración. A 100 000 v, es de aproximadamente 0,1 ; no obstante, debido a las imperfecciones o aberraciones de los lentes electromagnéticos, la resolución del MET es de 1,4 Å (5 ). Se comparan las imágenes obtenidas de secciones de colon de un caso de balantidiasis, observadas al microscopio de luz ( Fig. l ), al MER (Fig. 2 y 3 ) y al MET (Fig 4 y 5 ).
Microscopio electrónico de rastreo o barrido
El haz de electrones que impacta a la muestra interacciona con ella, unos electrones la atraviesan y son los utilizados en MET, otros emergen de la superficie; entre éstos están los electrones secundarios, que son arrancados de los orbitales de átomos de alto número atómico y generan las imágenes con carácter tridimensional que caracterizan a la microscopio electrónica de rastreo (MER). Para generar estás imágenes el haz de electrones debe desplazarse sobre la superficie de la muestra de un lado a otro, haciendo un barrido o rastreo de su superficie, de donde deriva el nombre de este equipo (6 ). La figura 1c corresponde a una muestra de colon del mismo caso ilustrado en las figuras 1a y 1b, pero en esta ocasión fotografiada al MER.
La resolución del MER depende del diámetro final de la sonda electrónica que barre la superficie de la muestra, pues la señal generada lleva ese diámetro. La mayoría de los MER tienen resolución es que oscilan entre 70 y 30 A (7 a 3 nm), dependiendo entre otras cosas de la distancia de trabajo y el recubrimiento metálico que se dé a las muestras ( 6 ).
Rayos X característicos
La generación de los rayos X característicos depende de los electrones del átomo que los generan. Recordemos que un átomo es neutro, pues tiene un número de electrones igual al número de protones del núcleo (designado como Z) y que esos electrones están dispuestos en orbitales con diferentes niveles energéticos, que ordenados del núcleo hacia fuera, son denominados K, L, M etc, y que esos orbitales deben irse llenando ordenadamente. El orbital K acepta dos electrones, el L 8, el M 18, el N 32 y así sucesivamente. Esto significa que un elemento con doce electrones, debe llenar primero las dos plazas en el orbital K que serían ocupadas por los electrones cuya energía de en lance es mayor y luego se alojarían los otros ocho electrones del orbital L y finalmente los dos electrones con menos energía de enlace ocuparían su lugar en el orbital M. Cuando un electrón es removido de un orbital, su lugar será ocupado por otro electrón de un orbital más externo, o sea que su energía de enlace aumentará. Esa diferencia energética es eliminada como un fotón de rayos X cuya energía es equivalente a la diferencia existente entre ambos orbitales (6 ). Por ejemplo, si la vacante quedó en el orbital K y fue llenada por un electrón que provenía de L se estaría generando una emisión de rayos X denominada Ká; pero si fue llenado por un electrón de dos orbitales más atrás, o sea de M, la radiación será Ká otra posibilidad sería una emisión Kâ si proviene de tres orbitales atrás. Si la vacante hubiese quedado en L, los ejemplos anteriores corresponderían a Lá , Lâ Lã y así sucesivamente. Esas diferencias energéticas son características de cada elemento; por lo tanto, si la cuantificamos sabremos de qué elemento proviene. Por ejemplo para el hierro tenemos los siguientes valores en kiloelectrones voltio (KeV) Fe Ká 6 403, Fe Kâ 6 390, Fe Kã 7 057, etc ( 5 ).
Los equipos analizadores de rayos X en microscopio electrónica cuentan con programas de computación cuya base de datos tiene esta información, de manera que el programa identifica automáticamente el elemento responsable de la emisión. Esto significa, que empleando un detector de rayos X en un microscopio electrónico es posible hacer un análisis químico de la muestra en escala puntual, indicando qué elementos están presentes en determinada área de la muestra.
Los detectores de rayos X más utilizados en microscopio son el "Energy Dispersive Spectroscopy" (EDS) y el "Wavelength Dispersive Spectroscopy" (WDS) éste permite un análisis rápido y simultáneamente puede detectar varios elementos, gracias a que segrega o dispersa las diferentes señales de. Acuerdo a su energía empleando un detector de cristal semiconductor. La figura 6 muestra un equipo EDS acoplado a un MER y la figura 7 muestra unos cristales obtenidos de orina de un paciente.
Cuando los fotones de rayos X golpean el cristal semiconductor, este absorbe una cantidad de energía determinada, que es convertida en una señal eléctrica, la cual es emitida, amplificada y digitalizada para alimentar un analizador multicanal, que identifica los elementos que originaron esa señal y la despliega gráficamente, como se muestra en la figura 8 que corresponde a un cálculo renal.
Aplicaciones biomédicas
Entre las aplicaciones del análisis elemental con rayos X en la biomedicina está la identificación de depósitos de metales pesados en tejidos, como el cobre en tejido hepático de pacientes con enfermedad de Wilson (7 ), el plomo en eritrocitos de pacientes con saturnismo, el mercurio en piel (8 ), el arsénico en las intoxicaciones y carcinomas de piel, el tetraóxido de osmio en traumatismos de piel (9 ), etc. También, es posible analizar la composición de cristales urinarios y litiasis renal y vesicular (10 ). El análisis de la etiología de la microlitiasis renal representa un ejemplo de aplicación de esta técnica. Esta patología puede ser multicausal y representa uno de los problemas de salud cuya importancia se reconoce cada día más. Entre las posibles causas se mencionaron las infecciones bacterianas debidas a agentes ureasa positivos, principalmente Klebsiella penuemoniae, Proteus spp y Ureaplasma urealyticum. La ureasa de estas bacterias hidroliza la urea excretada por la orina, produciendo amonio que eleva el pH, lo que favorece la precipitación de cristales de fosfato de calcio. Esto unido a otros problemas subyacentes como alteraciones anatómicas o reducción del flujo urinario induce la formación de microlitiasis y cálculos renales ( 11 , 12 ). Actualmente, otra teoría infecciosa involucro a Nanobactería, un género de bacterias 10 a 100 veces más pequeñas que la mayoría de las bacterias conocidas. En todo caso, se destaca que el tamaño y número de cristales urinarios de oxalato de calcio o fosfato de calcio, cuya relación con la porosidad de las células de los canalículos pueden llevar a la formación de núcleos de precipitación sobre los que se seguirá depositando más calcio, lo que agrava el problema (13 , 14 ). Para comprender mejor la génesis de las urolitiasis es importante conocer la composición y distribución del calcio en la matriz de los cálculos y poder demostrar los sitios de deposición de fosfato de calcio amorfo en relación con la deposición de cristales de oxalato de calcio ( 10 ). Este tipo de información se puede obtener con un espectrómetro de Rayos X acoplado a un microscopio electrónico de rastreo. Pues el análisis químico solo brinda la composición ya sea cualitativa o cuantitativa de¡ elemento en cuestión; pero no brinda información sobre su distribución en la muestra. En tanto, las imágenes de MER brindan una visión tridimensional de la muestra, incluyendo su patrón cristalino y el espectrómetro de rayos X indica la composición química en el área seleccionada. Al mismo tiempo, el análisis de materiales de cirugía o autopsia, en los cuales se obtenga el tejido renal con el cálculo puede brindar información concerniente a la deposición de cristales dentro de los canalículos. Las figura 7 muestra un cristal urinario cuyo análisis elemental puede ser obtenido mediante un analizador EDS. En la figura 8 se muestra el patrón de composición de un cálculo renal.
Cuando los fotones de rayos X golpean el cristal semiconductor, este absorbe una cantidad de energía determinada, que es convertida en una señal eléctrica, la cual es emitida, amplificada y digitalizada para alimentar un analizador multicanal, que identifica los elementos que originaron esa señal y la despliega gráficamente, como se muestra en la figura 8 que corresponde a un cálculo renal.
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Conclusión
El avance acelerado de los conocimientos científicos y la tecnología han permitido a la microscopio electrónica tener una gran capacidad de análisis ultraestructural en organelas, células, tejidos y materiales inorgánicos. Se ha podido llegar a aumentar imágenes hasta casi un millón de veces con una resolución de 1.4 A. Esto ha permitido conocer ultraestructuralmente los materiales y sistemas biológicos ayudando a entender mejor su funcionamiento. Sin embargo, esta técnica no permitía conocer la composición química elemental de los objetos que estábamos viendo. Para ello necesitábamos realizar un análisis químicos de la muestra lo que implicaba su destrucción. El desarrollo de sistemas de detección de rayos X y programas de computación de inteligencia artificial que permiten analizar gran cantidad de información en forma eficiente y amigable, ha permitido que la microscopio electrónica de un gran salto en su capacidad de análisis. Debido a que el microscopio electrónico produce un has de electrones que impacta la muestra que estamos observando y que en este proceso se liberan rayos X, los cuales son característicos de cada elemento, podemos entonces determinar qué elementos están presentes en la imagen que estamos viendo en el microscopio. Además, podemos ver su distribución en la muestra, lo cual nos permite hacer diagnóstico de intoxicación por metales o elementos inorgánicos debido a que la presencia de estos no natural en los tejidos. También, nos permite entender mejor la fisiopatogenia de procesos que incluyen el depósito de materiales orgánicos o inorgánicos como es el caso de la formación de cálculos en diferentes órganos.
