Aislamiento de una cepa de campo de Babesia bigemina (Piroplasma: Babesiidae) y establecimiento del cultivo in vitro para la producción de antígenos

Roger I. Rodríguez-Vivas¹, Franklin J. Quiñones-Avila¹, Genny T. Ramírez-Cruz¹, David Cruz² & Gale Wagner²

Recibido 11-XII-2001. Corregido 05-IX-2005. Aceptado 12-V-2006.

Abstract: Isolation of a field strain of Babesia bigemina (Piroplasma: Babesiidae) and establishment of in vitro culture for antigen production. Bovine babesiosis, caused by Babesia bigemina, is a barrier for livestock development; it results in high economic loss to Mexican livestock. Control requires adequate antigens for diagnosis and vaccination programs. However, because of antigenic variation among Babesia strains, it is necessary to use antigens prepared from local strains. The purpose of the present study was to isolate a local field strain and to establish the in vitro culture of B. bigemina by the evaluation of the constituent’s concentration of culture media. Thirty engorged female Boophilus microplus were collected from cattle suffering clinical babesiosis (B. bigemina) in Yucatan state, Mexico. These ticks were sent to the laboratory for detection of Babesia sp. vermicules. Eggs were kept at 83-85 % humidity and 27 ºC until hatching. Larvae were transferred to an esplenectomized calf (B-1). The resulting nymphs were transferred to an esplenectomized calf (B-2). Twelve days later, B. bigemina (local strain) was detected in calf B-2 and its infected blood was frozen in liquid nitrogen to initiate the in vitro culture. The Microaerophilus Stationary Phase (MASP) in vitro culture method was used to reactivate the parasite. Three different concentrations of culture media (70, 60 and 50 %), serum (30, 40 and 50 %) and uninfected red blood cells (5, 10 and 15 %) were used in order to know the convenient concentrations to obtain the highest percentage of infected red blood cells (PEI). The cultured strain was used to prepare antigens for the Immunofluorescence Antibody Test (IFAT) and several concentrations of serum and conjugate were tested. Strain isolation was successful; 30 days were needed to obtain a PEI of 1.5 %. The isolated strain was frozen in liquid nitrogen and the parasites were reactivated with the in vitro culture MASP method. The concentration of culture media that produced the highest PEI (14 %) (p<0.05) was 30 % serum, 70 % M199 and 5 %. Uninfected Red Blood cells antigens were successfully used in the IFAT and the best dilutions to differentiate between positive and negative controls were serum 1:80 and conjugate 1:80. The isolated B. bigemina local strain requires particular conditions of in vitro culture by the MASP method to reach high numbers of infected red blood cells, needed to prepare and provide high quality antigens for serological diagnosis of B. bigemina. Rev. Biol. Trop. 55 (1): 127-133. Epub 2007 March. 31.

Key words: Babesia bigemina, isolation, in vitro culture, antigen, percentage, infected red blood cells.

En México, la babesiosis bovina ocasionada por Babesia bovis y Babesia bigemina produce pérdidas económicas a la ganadería nacional (Rodríguez et al. 2000), destacándose los impedimentos para la importación de ganado genéticamente superior al nativo, mermas en los niveles de producción de carne y leche, incrementos de los costos de producción por tratamiento y pérdidas económicas por mortali dad (Guglielmone 1992, Solís et al. 1998).

Las estrategias de control de la babesiosis se han enfocado al manejo del vector, quimioprofilaxis, uso de ganado resistente e inmunización empleando antígenos aislados de infecciones naturales o de cepas aisladas y cultivadas in vitro utilizando el Sistema Estacionario Microaerofílico (SEMA) (Rodríguez-Vivas 1992, Rodríguez-Vivas y Domínguez 1993, Solorio y Rodríguez-Vivas 1997). El SEMA ha facilitado el estudio del diagnóstico, inmunidad, detección de epítopes y quimioterapia de la babesiosis bovina. Debido a las variaciones antigénicas que se presentan en distintas cepas de B. bigemina es necesario que cada región cuente con antígenos locales para la realización de estudios seroepidemiológicos y de inmunización (Ramírez et al. 1998, Solorio et al. 1999).

Materiales y métodos

Tipo de estudio: Se realizó un estudio experimental en el Estado de Yucatán, México. Esta región se caracteriza por presentar un clima Aw (cálido subhúmedo). Se emplearon las instalaciones y facilidades de la Unidad de Diagnóstico de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma de Yucatán.

Aislamiento de la cepa: Se recolectaron 30 garrapatas Boophilus microplus (hembras repletas en estado adulto) de un animal clínicamente enfermo de babesiosis (B. bigemina) y se transportaron al laboratorio para determinar la presencia de kinetos de Babesia sp. (Cen et al. 1998); los huevos de una garrapata positiva fueron incubados hasta su eclosión para transferir las larvas emergidas a un becerro esplenectomizado (B-1), posteriormente las garrapatas en estadio de ninfa fueron transferidas a otro becerro esplenectomizado (B-2) para lograr la infección con B. bigemina. Una vez transferidas las ninfas, el animal B-2 fue monitoreado diariamente mediante frotis sanguíneos teñidos con Giemsa al 10 % para detectar la infección por B. bigemina. Además, se determinó el hematocrito y se midió la temperatura rectal del animal. Doce días después de transferidas las ninfas al animal B-2 se colectaron 120 ml de sangre en un frasco estéril con perlas de vidrio. La sangre fue desfibrinada mediante movimientos rotatorios del frasco durante 10 minutos. Se eliminó la capa flogística y se obtuvo 40 ml de glóbulos rojos los cuales fueron mezclados con 40 ml de PVP (Polivinilpirrolidona, Sigma chemical, USA) al 20 % para proceder a la congelación de la cepa en nitrógeno líquido (crioviales de 1 ml) según la técnica descrita por Vega et al. (1985).

Preparación de los medios de cultivo e inicio del cultivo in vitro: Para alimentar los cultivos celulares se utilizó un medio de cultivo con distintas proporciones de Medio-199 (M199) (Sigma chemical, USA), suero y eritrocitos de bovino. Los sueros y eritrocitos se obtuvieron de un bovino adulto (donador) proveniente de una zona libre de garrapatas y previamente probado como donador en la Universidad de Texas, USA (Holman y Wagner 1994).

Para iniciar el cultivo in vitro de B. bigemina se utilizó el SEMA descrito por Holman y Wagner (1994) empleando un medio de cultivo con M199 (60 %) y suero del donador (40 %).

La cepa aislada y congelada fue reactivada de acuerdo al método descrito por Holman y Wagner (1994). Para ello, el cultivo celular se trabajó en condiciones de esterilidad utilizando una campana de flujo laminar tipo II. Se utilizó una placa de cultivo de 24 pozos donde se depositó en cada pozo 1 ml del medio de cultivo, 10 % de eritrocitos del donador y 0.25 ml de la cepa congelada. La placa de cultivo fue transferida a una cámara húmeda con una mezcla especial de gases (93 % N, 2 % O₂ y 5 % CO₂) y conservada en una incubadora a 37 ºC y humedad del 80 %. Cada 24 h, 0.90 ml del medio sobrenadante fue eliminado de los cultivos y se adicionó la misma cantidad de M199 (60 %) y suero del donador (40 %). Para conocer el porcentaje de eritrocitos infectado (PEI) se procedió a realizar diariamente un frotis teñido con Giemsa al 10 % de cada pozo de cultivo.

Diseño del experimento: Después de 30 días de iniciar la reactivación de la cepa en congelación se inició el diseño para conocer las condiciones óptimas del cultivo. La decisión de realizar subcultivos de cada pozo (Holman y Wagner 1994) se realizó de acuerdo a los resultados obtenidos. Para ello se hicieron nueve tratamientos cinco repeticiones cada uno (Cuadro 1).

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Diariamente en cada pozo se eliminó 1.0 ml del medio de cultivo sobrenadante y se le adicionó la misma cantidad de medio de cultivo nuevo sin perturbar el sedimento celular, se tomó una muestra de 0.03 ml del sedimento para hacer un frotis en un portaobjetos. Los frotis fueron teñidos con Giemsa al 10 % y se obtuvo el PEI (Holman y Wagner 1994).

Análisis de los datos: Los PEI registrados de cada una de las cinco repeticiones de cada tratamiento fueron analizados mediante la prueba de análisis de varianza de mediciones repetidas. Como variable independiente se consideró el día en que se realizó el cultivo celular y como variable dependiente el PEI. Se determinó el PEI acumulado de los tratamientos que presentaron crecimientos estadísticamente significativos (p<0.05), mediante la medición de cuatro pases sucesivos. Posteriormente a través de un análisis estadístico de diferencias entre medias de los PEI de cada tratamiento se con determinó su significancia (p<0.05).

Producción de antígenos: El mejor tratamiento fue usado como fuente de antígeno para desarrollar la prueba de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) mediante el método descrito por Goff et al. (1982). Se hicieron 50 repeticiones de cinco sueros controles positivos y cinco negativos donados por la Red Internacional de Hemoparásitos de la FAO. Los sueros y conjugado tuvieron diluciones de 1:40, 1:80 y 1:120. El diagnóstico se realizó utilizando un micros copio de epifluorescencia (Goff et al. 1982).

Resultados

Aislamiento de la cepa: Una cepa de B. bigemina proveniente de una teleogina de B. microplus fue aislada en el estado de Yucatán, México. Kinetos de Babesia sp. fueron observados al día nueve post-recolección de la teleogina. B. bigemina fue detectada (BbigYUC-2002) en el animal B-2 el día 12 posterior a la transferencia de las ninfas recolectadas del animal B-1 (Fig. 1). Cinco días posteriores a la aparición de los primeros merozoitos de B. bigemina en sangre se alcanzó un PEI de 1.5 % y se procedió a la colección y congelación de la cepa, ya que el animal B-2 se encontraba en condiciones cercanas a la muerte, manifestando signos clínicos característicos de la infección (anemia, ictericia, fiebre, hemoglubinuria).

Reactivación de la cepa local de B. bigemina: La cepa BbigYUC-2002 fue reactivada de su estado de congelación en nitrógeno líquido al ser transferida al cultivo in vitro. Se requirió 30 días para tener una PEI del 1.5 % e iniciar el diseño experimental para conocer las condiciones óptimas del cultivo.

Debido a que la concentración de eritrocitos al 5 % (variable b1) en los pozos de cultivo fue el factor decisivo para alcanzar mayores PEI (p<0.05), se realizaron cuatro mediciones adicionales de los tratamientos a1b1, a2b1 y a3b1 para observar la repetibilidad de los datos (Fig. 2).

Durante 16 días de cultivos continuos de la cepa BbigYUC-2002 el tratamiento a1b1 alcanzó mayor PEI acumulado (44.3 %), siendo significativamente diferente (p<0.05) a los demás tratamientos (a2b1 y a3b1).

Producción de antígenos e implementación de la prueba de IFI: En la implementación de la prueba de IFI, todas las diluciones realizadas permitieron que los controles positivos presentaran fluorescencia al momento de la lectura; sin embargo, la mejor apreciación de la fluorescencia se encontró con las diluciones 1:80 del suero y 1:80 del conjugado.

La cepa aislada fue congelada y reactivada con éxito. El periodo de reactivación fue de 30 días, coincidiendo con estudios previos donde se registraron 35 días (Monroy et al. 1987). Este periodo de adaptación es prolongado si se compara con estudios que inician el cultivo a partir de sangre fresca de un animal infectado, demorando tan solo seis días para iniciar la realización del primer subcultivo (Vega et al. 1985).

El tratamiento que presentó mayor PEI fue el a1b1 (70 % de M199, 30 % suero y 5 % eritrocitos) alcanzando hasta un 14 % al día 4 del cultivo. Estos resultados son superiores al compararlos con otros estudios realizados en México, donde los PEI obtenidos no llegaron al 3 % (Vega et al. 1985, Monroy et al. 1987), a pesar de tener las mismas condiciones de cultivo del presente estudio. Es posible que la cepa local aislada (BbigYUC-2002) tenga una mayor capacidad para invadir eritrocitos que se refleja en una mayor patogenicidad.

Los tratamientos a1b1, a2b1 y a3b1 (con 5 % de eritrocitos) presentaron PEI superiores al 9 %, mostrando con esto que el factor que permitió mayor reproducción de B. bigemina en el cultivo in vitro fue la concentración de eritrocitos. En el presente estudio la concentración de suero del donador no fue un factor decisivo para favorecer la reproducción de B. bigemina, aunque Monroy et al (1982) encontraron que B. bigemina puede crecer eficientemente en concentraciones de suero que varían de 20 a 50 % en el medio de cultivo.

El tiempo requerido para efectuar los subcultivos (cuatro días) en el presente estudio fue similar a lo reportado en otros estudios (Monroy et al. 1982, Kellermann et al. 1989). En 16 días de cultivo, el tratamiento a1b1 acumuló 44.3 % de eritrocitos parasitados, siendo este una buena fuente de antígenos para estudios serológicos y producción de vacunas.

Los eritrocitos infectados con B. bigemina producidos mediante el cultivo in vitro mostraron ser una buena fuente de antígeno para estudios serológicos, ya que en la prueba de IFI se pudo observar numerosos parásitos con fluorescencia definida para diferenciar los controles positivos de los negativos. La mejor apreciación de la fluorescencia se observó con las diluciones 1:80 (suero y conjugado). Resultados similares han sido obtenidos en diversos lugares donde se ha empleado esta técnica con antígenos producidos in vitro (Kellermann et al. 1989, Ramírez et al. 1998, Solís et al. 1998, Regassa et al. 2003, Mtshali et al. 2004). Este método de producción de antígenos elimina las reacciones inespecíficas de la respuesta humoral que ocurre con antígenos provenientes de la infección in vivo, principalmente cuando se usa la prueba de IFI.

Aunque los alcances prácticos del cultivo in vitro del presente estudio se limitaron únicamente a la producción de antígenos para la técnica de IFI, la investigación realizada deja la puerta abierta para la producción de inmunógenos en estudios posteriores y al estudio molecular y fisiológico de B. bigemina.

Se agradece a la International Foundation for Science de Suecia (B/2789-1) por el financiamiento del presente estudio. Asimismo se agradece a Iván Osorio Avilés por el apoyo en el manejo de animales y durante los cultivos celulares.

Palabras clave: Babesia bigemina, aislamiento, cultivo in vitro, antígeno, porcentaje, eritrocitos infectados.

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