María F. Achinelly ¹ & Juan J. García ^1,2

1 Centro de Estudios Parasitológicos y de Vectores (CEPAVE). Calle 2, Nº 584 (1900) La Plata, Argentina. Fax: (54) 221-4-23-23-27; fernanda@museo.fcnym.unlp.edu.ar

2 Investigador CIC

Recibido 19-VII-2001.        Corregido 13-XI-2002.        Aceptado 28-III-2003.

Abstract

Strelkovimermis spiculatus is a common parasite of culicid species in Argentina. Effect of temperature on longevity and infectivity of juvenile preparasites of S. spiculatus was determined at 4, 10, 20 and 27ºC. Three containers with 100 ml of dechlorinate water and 300 preparasites (12 hour-old), were placed for each day and temperature, during 40 days (total = 480 containers). Survived preparasites were counted on 12 containers per day (three for each temperature). When number of survived preparasites was determined, second instar larvae of Aedes aegypti were added to each container in a 10:1 ratio (preparasites:mosquito) to determine infectivity of daily survived preparasites. Longevity of preparasites decreased at higher temperatures. Maximum longevity of preparasites maintained at 4, 10, 20 and 27ºC were 35, 30, 25 and 27 days, respectively. Survivorship of preparasites, exposed to the same temperatures, varied from 57% to 100% at day two, from 21% to 77% at day five and from 9% to 33% at day ten. Infectivity of preparasites maintained at temperatures from 4 to 27ºC was always higher than 70%. Extended longevity with maintenance of the infectivity capacity of preparasites, are important attributes to consider S. spiculatus an effective mean of controlling a large number of culicid species between 4 and 27ºC.

Strelkovimermis spiculatus Poinar y Camino, 1986 fue descrito parasitando larvas del mosquito neotropical, Ochlerotatus albifasciatus (Macquart) en la Argentina (Poinar y Camino 1986). Las epizootias producidas por S. spiculatus en poblaciones naturales de O. albifasciatus son comunes, constituyendo uno de los principales agentes reguladores de este culícido en la naturaleza (Micieli y García 1999). Strelkovimermis spiculatus presenta un espectro amplio de hospederos susceptibles (García et al. 1994) y puede ser producido masivamente in vivo en forma relativamente sencilla (Camino y Reboredo 1996). En la naturaleza se lo ha citado parasitando mosquitos en ambientes temporarios que han permanecido sin agua por largos períodos de tiempo (Maciá et al. 1995, Micieli y García 1999). Además, S. spiculatus fue citado parasitando larvas de Culex pipiens L. en ambientes permanentes y con elevado contenido de materia orgánica (García y Camino 1990). Estas características convierten a S. spiculatus en un candidato promisorio para ser utilizado como agente de control biológico de culícidos.

La temperatura es un factor importante, que generalmente afecta la actividad como agente de control de la mayoría de los parásitos y patógenos de insectos. La utilización eficiente de S. spiculatus en el manejo de culícidos, requerirá de estudios profundos, tendientes a determinar el efecto de los factores ambientales en la biología de este nemátodo. El presente trabajo pretende, determinar el efecto de la temperatura sobre la longevidad y la infectividad de los juveniles preparásitos de S. spiculatus.

En el estudio se utilizaron larvas de Ae. aegypti (L.) como hospedero alternativo para el parásito debido a la imposibilidad de colonizar en el laboratorio O. albifasciatus, el hospedero natural de S. spiculatus. Las larvas de Ae. aegypti se obtuvieron de la colonia instalada en el CEPAVE, Centro de Estudios Parasitológicos y de Vectores, La Plata, Argentina. Los mosquitos adultos se mantuvieron en jaulas (50 x 50 x 50 cm) y se les alimentó con una solución de sacarosa (10%) y una ingesta sanguínea semanal, sobre una gallina inmovilizada, colocada en el interior de la jaula durante 1 hr. Las hembras grávidas depositaron los huevos sobre un papel absorbente, colocado en el interior de un recipiente con agua, ubicado dentro de la jaula. Transcurridos tres días, los papeles con los huevos se colocaron en bandejas plásticas (40 x 30 x 5 cm) con agua sin cloro para la eclosión de las larvas, a las que se les

suministró alimento balanceado molido hasta llegar al estadío de pupa. Las pupas se colocaron en recipientes con agua y se ubicaron dentro de la jaula hasta la emergencia de los adultos.

Los juveniles preparásitos de S. spiculatus se obtuvieron de la colonia instalada en el CEPAVE. Para su mantenimiento se utilizó el método descrito por Camino y Reboredo (1996) para la producción de S. spiculatus, a su vez basado en el método original de Petersen y Willis (1972) para Romanomermis culicivorax Ross y Smith, 1976. El método consiste en recolectar los juveniles postparásitos emergidos de las larvas parasitadas, lavarlos con agua y separarlos en grupos de 1 g (peso húmedo; aproximadamente 2000 nemátodos). Cada grupo se colocó en cajas plásticas (15 x 10 x 2 cm) con 1 cm de arena lavada y esterilizada y se agregó agua sin cloro hasta 2 cm de profundidad. Luego de una semana, durante la cual los nemátodos se introdujeron en la arena, se eliminó el exceso de agua de las cajas y los cultivos con arena húmeda se mantuvieron a temperatura ambiente y en oscuridad durante cuatro semanas adicionales. A partir de la sexta semana, las cajas se inundaron con 200 ml de agua sin cloro, durante 12 hr, hasta la eclosión de los juveniles preparásitos. El agua con los preparásitos se colocó en una probeta graduada, la muestra se hizo homogénea por agitación y se realizaron diluciones volumétricas que facilitaron la cuantificación de los nemátodos. Se determinó, al estereoscopio, el número de preparásitos en diez alícuotas de 1 ml de la suspensión más diluida.

La longevidad de los preparásitos se investigó durante 40 días a cuatro temperaturas, 4, 10, 20 y 27ºC. Inicialmente, se colocaron tres recipientes plásticos de 250 ml para cada día y temperatura, en total 480 recipientes. Al día cero, se agregaron 100 ml de agua sin cloro y 300 preparásitos (de 12 hr de emergidos) en cada uno de los 480 recipientes. A intervalos de 24 hr se retiraron tres recipientes de cada temperatura, se dejaron 30 min a temperatura ambiente y se cuantificaron los preparásitos móviles en diez alícuotas de 1 ml. Determinada la mortalidad de los juveniles preparásitos para cada día, se incorporaron larvas de segundo estadío de Ae. aegypti a los recipientes, en una relación de una larva de mosquito por cada diez preparásitos móviles. Cuando el número de nemátodos fue menor a diez, se agregó una larva de Ae. aegypti por recipiente. Luego de 24 hr en contacto, se eliminaron los preparásitos haciendo pasar el agua de los recipientes por una red, que retuvo las larvas de Ae. aegypti y permitió el paso de los preparásitos. Las larvas se colocaron en recipientes similares con 100 ml de agua sin cloro y se les alimentó cada 48 hr hasta que llegaron a pupa. Las larvas de Ae. aegypti en cuarto estadío se colocaron individualmente en placas de cultivo de 24 celdas, con 3 ml de agua por celda, hasta la emergencia de los post-parásitos. Luego se determinó el porcentaje de parasitismo y la intensidad (número de nematodos por larva parasitada) para cada día y temperatura.

La longevidad máxima de los preparásitos a las diferentes temperaturas se comparó estadísticamente con el análisis de varianza de una vía y las comparaciones múltiples fueron estudiadas con la prueba de Tukey.

Resultados

La longevidad de los preparásitos decreció a temperaturas elevadas (Cuadro 1). La longevidad máxima presentó diferencias significativas (F=76, gl=3.8, p<.001), siendo mayor a la temperatura de 4 y 10°C (Tukey p<.05). Ésta presentó un máximo de 35 días a 4ºC (0.6%), 30 días a 10ºC (0.8%), 25 días a 20ºC (0.5%) y 27 días a 27ºC (0.7%). A las 48 hr 57%, 87%, 100% y 63% de los preparásitos sobrevivieron a 4, 10, 20 y 27ºC respectivamente. Entre 21% y 77% de los preparásitos, presentaron movilidad luego de expuestos a esas temperaturas durante cinco días, mientras que, a los diez días la longevidad de los preparásitos varió entre 9% y 33% (Fig.1).

Relación entre la movilidad de los juveniles preparásitos y su infectividad: La relación entre la movilidad de los preparásitos y la capacidad para parasitar larvas de Ae. aegypti, fue estudiada a 4, 10, 20 y 27ºC. Los preparásitos expuestos a 4ºC infectaron larvas de Ae. aegypti durante los 35 días que permanecieron móviles; el porcentaje de larvas parasitadas varió entre 85% y 100% con intensidades entre 1 y 2 nemátodos por larva parasitada. Los preparásitos mantenidos a 10ºC parasitaron entre 80% y 100% de las larvas expuestas durante los 30 días de longevidad, oscilando la intensidad entre 1 y 2.4 nemátodos por larva. El parasitismo producido por los preparásitos, mantenidos a 20ºC, fluctuó entre 70 y 100% durante los 25 días que se observaron preparásitos móviles; en este caso la intensidad del parasitismo por S. spiculatus varió entre 1 y 4 nemátodos por larva de Ae. aegypti. Los juveniles preparásitos que permanecieron viables durante 27 días a 27ºC fueron infectivos y produjeron porcentajes de parasitismo entre 83% y 100%; el número de parásitos varió entre 1 y 2.3 nemátodos por larva de Ae. aegypti parasitada (Cuadro 1).

La longevidad de los juveniles preparásitos de S. spiculatus varió con la temperatura. Los preparásitos expuestos a temperaturas en-tre 4 y 27ºC conservaron la movilidad entre 35 y 27 días posteriores a su eclosión, respectivamente. Estos datos coinciden con las observaciones previas de Micieli y García (1999), sobre una población natural de S. spiculatus en la que recolectaron juveniles preparásitos libres y móviles durante períodos superiores a 7 días, incrementándose la longevidad de los preparásitos en los meses con temperaturas bajas. Estos datos difieren notablemente de los resultados aportados por Camino y Reboredo (1994) que determinaron que los preparásitos de S. spiculatus mantenidos en condiciones de

laboratorio y a temperatura de 20ºC fueron viables 24 hr, mientras que, los preparásitos que no penetraron en larvas de mosquito murieron entre 30 y 48 hr. Brown y Platzer (1977) demostraron que la movilidad de los preparásitos de R. culicivorax decreció más rápidamente a temperaturas elevadas, variando entre dos días a 37ºC y seis días entre 1 y 12ºC.

Romanomermis culicivorax produjo porcentajes de parasitismo más elevados a temperaturas entre 21 y 33ºC que a temperaturas menores (12-18ºC), aunque el parasitismo disminuyó más rápido a temperaturas mayores que a menores (Brown y Platzer 1977). Petersen (1975), en un estudio sobre la variación del parasitismo de R. culicivorax a temperaturas entre 24 y 27ºC, encontró que el porcentaje de parasitismo en larvas de Cx. pipiens declinó rápidamente luego de 24 hr, siendo casi nulo a las 72 hr.

La longevidad prolongada, acompañada por la conservación de la capacidad infectiva de los preparásitos de este mermítido, indican que S. spiculatus sería un agente efectivo para el control de un número importante de especies de culícidos a temperaturas entre 4 y 27ºC.

El nemátodo mermítido S. spiculatus es un parásito común de culícidos de la Argentina. Presenta características que lo distinguen de otros mermítidos parásitos de culícidos y lo convierten en un promisorio candidato como agente de control biológico de mosquitos. La temperatura es un factor importante en la eficiencia de muchos entomopatógenos y su efecto debe ser determinado previo a la evaluación de campo de los mismos. En este trabajo, se investigó el efecto de la temperatura sobre la longevidad e infectividad de los juveniles preparásitos de S. spiculatus. Se expusieron preparásitos a 4, 10, 20 y 27ºC durante 40 días. Diariamente se cuantificó el número de juveniles preparásitos móviles a cada temperatura y luego se agregaron larvas de segundo estadío de Ae. aegypti para determinar la capacidad infectiva de los preparásitos. La longevidad máxima de los preparásitos fue 35, 30, 25 y 27 días a 4, 10, 20 y 27ºC, respectivamente. A las 48 hr, el porcentaje de preparásitos móviles varió entre 57% y 100% a las temperaturas citadas, disminuyendo entre 21% y 77% al día 5 y entre 9% y 33% al día 10. El porcentaje de parasitismo de los preparásitos fue superior a 70% a las cuatro temperaturas y la intensidad parasitaria varió entre 1 y 4 nemátodos por larva. La prolongada longevidad de los preparásitos, sin disminución de la capacidad infectiva, constituye una característica importante de S. spiculatus como potencial agente de control biológico de numerosas especies de culícidos a temperaturas entre 4 y 27ºC.

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