Francisco Hernández-Chavarría1,2, Felipe Salas-Hernández1, Pablo Ortiz1, Marlen Herrera1,3
Resumen:
Nanovesículas o nanoestructuras que semejan pequeñas bacterias de menos de 0,5 μm de diámetro han sido encontradas como contaminantes de sueros comerciales provenientes de fetos bovinos y fueron responsables de efectos citotóxicos en monocapas celulares cultivadas in vitro. Posteriormente el agente fue cultivado y clasificado como Nanobacterium sanguineum, el cual se ha relacionado con la formación de cálculos renales y más recientemente con otras patologías asociadas a calcificación de tejidos. Por otra parte, otros científicos no aceptan la existencia de tal bacteria. Se requiere más investigación para determinar si esas nanoestructuras son realmente bacterias.
Abstract:
Nanovesicles or nanostructures that resemble tiny bacteria of less than 0.5 μm in diameter were finded as contaminants in commercial fetal bovine serum, and were responsible for the cytotoxicity on cell monolayer cultured in vitro. Then, the agent was isolated and classified as Nanobacterium sanguineum, it was associated with kidney stone formation and more recently with other pathologies producing calcification. In the other hand, none researchers do not accepted the existence of these bacteria. More studies must be done to determine whether the nanostructures observed are bacteria.
Introducción:
El descubrimiento de nuevos agentes infecciosos o el hallazgo de microorganismos con características que se apartan de lo que aceptamos usualmente como normal, genera controversias en la comunidad científica. Ese nuevo conocimiento muchas veces es recibido con tal escepticismo, que los informes de esos hallazgos tienden a ser rechazados por la comunidad científica. Esto conduce a procesos tediosos y a veces largos durante los cuales es necesario acumular la información científica necesaria, para que poco a poco se vayan rebasando las barreras que se oponen al nuevo conocimiento existente. Algunos ejemplos de este tipo de descubrimiento se ilustran con el descurbrimiento de agentes infecciosos como el Agente de Eaton (1) o Helicobacter pylori (2) En ambos casos hubo un rechazo inicial de la comunidad científica; el primero fue finalmente aceptado como una causa importante de neumonías atípicas; aunque transcurrieron unos 20 años entre los primeros informes del doctor Eaton y su aceptación, que luego fue clasificado como Mycoplasma peumoniae. En el caso de Helicobacter también hubo rechazo por la comunidad científica, que se dividió entre creyentes y no creyentes en el nuevo agente; hasta que años después se confirmó su asociación con las gastritis, las úlceras pépticas y algunos tipos de cáncer gástrico; en este caso la controversia se resolvió en menos de un quinquenio.
]]> Algo un tanto similar ha estado ocurriendo durante la última década con los informes del hallazgo y cultivo de nanobacterias. En este caso, la reticencia ante los informes de este agente surgen por dos vías diferentes; por una parte, como su nombre lo indica, se trata de bacterias extremadamente pequeñas, cuyo tamaño se traslapa con el de algunos virus, lo cual las coloca entre los agentes filtrables. El segundo motivo de incredibilidad es su relación con las litiasis renales y los ateromas; en ambas patologías el factor común es la formación de estructuras calcificadas.Descubrimiento de las nanobacterias:
En los inicios de la década de 1990 se introdujeron los términos nanovesículas, nanofósiles y nanobacterias para referirse a estructuras similares a bacterias, tanto bacilares como cocoides, pero en el ámbito de los 25 a los 300 nm, o sea mucho más pequeñas que las bacterias conocidas hasta entonces, recordemos que un Staphylococcus tiene un diámetro de aproximadamente 1 000 nm. Esas nanoestructuras fueron descubiertas inicialmente en depósitos calcáreos de rocas volcánicas en Italia (3-4) Posteriormente, se hizo el hallazgo de estructuras similares en el meteorito ALH84001, proveniente de Marte, lo cual incrementó el interés científico en los buscadores de vida extraterrestre (5-6)
Los análisis de fragmentos del meteorito Tataouine que cayó en 1931 en el sur de Tunisia muestran agregados en forma de colonia de estructuras bacilares de 200 a 800 nm de largo por 30 a 80 nm (7) Obviamente existe mucha reticencia y escepticismo sobre la naturaleza microbiana de las nanoestructuras descubiertas en meteoritos, por lo que se han propuesto los siguientes cinco criterios para asociarlas con formas bacterianas: a) Disposición en agregados similares a colonias, b) variaciones de tamaño en un ámbito compatible con tamaños de diversos estados metabólicos, c) dimensiones menores de 2 m m, d) que no posean el aspecto de agregados minerales previamente descritos, y e) mineralización de esas nanoestructuras similar a la encontrada en fósiles microbianos (7)
Por esos mismos años, mientras los científicos espaciales y geofísicos realizaban los hallazgos de nanoestructuras en rocas y meteoritos, se iniciaba otra serie de descubrimientos relacionados con nanoestructuras similares; pero esta vez asociados a la biomedicina, lo que generó la serie de controversias que motiva esta revisión.
El descubrimiento de las nanobacterias en biomedicina está ligado al hallazgo de efectos citopáticos en cultivos de células, que en principio se identificaron como posibles efectos tóxicos que alteraban las monocapas celulares; pero, más tarde, al observar que ese efecto se transmitía con los nuevos pasajes de las células afectadas, se interpretó como el efecto citopático de algún virus no identificado y los métodos microbiológicos empleados fallaron en su identificación o cultivo. Se identificó al suero fetal bovino empleado como suplemento de enriquecimiento de los medios de cultivo como la fuente del nuevo agente; el cual aparecía en más del 80% de los lotes comerciales de suero fetal bovino (8-9) Los sueros bovinos comerciales eran esterilizados por filtración; por lo tanto, el nuevo agente era "filtrable"; recordemos que el término "agentes filtrables" había sido acuñado a inicios del siglo XX para referirse a los virus. Sin embargo, el nuevo agente era capaz de atravesar membranas con porosidad de 0,1 μm. La observación microscópica de las monocapas afectadas mostró la presencia de biopelículas, cuyo análisis por espectrometría de rayos X reveló la presencia de calcio; además, al microscopio electrónico de rastreo la biopelícula calcificada aparecía compuesta por nanoestructuras esferoides con aspecto de iglú en cuyo interior se encontraron estructuras similares a bacterias con dimensiones que oscilaban entre 0,1 y 0,5 μm o sea de 100 a 500 nm; lo que explicaba el porqué el nuevo agente podía aparecer en los lotes comerciales de sueros bovinos esterilizados por filtración (9) Actualmente y a raíz de estos descubrimientos, los sueros fetales certificados como estériles se someten a irradiación con partículas gama para asegurar la destrucción de nanobacterias. Hasta la fecha, las nanobacterias han sido aisladas de suero bovino y a partir de humanos en suero, orina, cálculos renales, placa dental y tejidos calcificados (9)
Biología de las nanobacterias:
Se trata de bacterias atípicas, muy pequeñas (<0,5 μm), citotóxicas, filtrables y Gram negativas con un tiempo de generación de 3 a 5 días y que incorporan iones de calcio en su glicocalix, el cual precipita formando depósitos de hidroxiapatita; de esta forma las colonias resultantes son conglomerados de nucleoides de calcio, por lo cual se detectan adheridas a las paredes de los frascos de cultivo como una biopelícula arenosa; sin embargo, dado el tiempo de generación tan largo, los cultivos de este agente deben incubarse entre uno a tres meses para poder detectar la bacteria (8-11)
La inclusión de estas bacterias en la matriz de hidroxiapatita le confiere resistencia al calor y luz ultravioleta, aunque son sensibles a tetraciclinas, nitrofurantoina, trimetoprin, trimetoprin-sulfametoxazole y ampicilina (12) Además, son inactivadas por radiaciones gama (13) Los estudios basados en un fragmento de 1406 bases del ARNr 16S de Nanobacteria (depositado en el banco de genes como EMBL X98418 y X98419) ha permitido clasificarle en el subgrupo alfa-2 de las proteobacterias, siendo diferente Thiobacillus el miembro más cercanos del grupo, que también incluye agentes intracelulares como Brucella y Bartonella con las cuales al parecer comparte algunos antígenos y propiedades citotóxicas; por ejemplo, hay reacción cruzada entre los anticuerpos contra las nanobacterias, Bartonella henselae y B. quintana (10-11) La nueva bacteria se ha clasificado como Nanobacterium sanguineum; sin embargo, este género aún no ha sido aceptado plenamente por la comunidad científica y es objeto de gran controversia. También, se ha identificado la endotoxina de este agente (14, 15)
Controversias respecto a la existencia de Nanobacterias:
]]> Entre las controversias más fuertes en relación con la existencia de las nanobacterias está el hecho de que la mayoría de los trabajos publicados provienen exclusivamente de un grupo de investigadores finlandeses, las pruebas de ELISA con anticuerpos monoclonales comercializados por el mismo grupo han dado resultados negativos y no se ha tenido éxito en la amplificación del ARN 16S con las secuencias publicadas (16); además, no hay cepas disponibles de referencia (17). Kajander y colaboradores (9) han respondido que las fallas en los estudios de PCR se deben al empleo de secuencias universales para Bacteria y que no debe verse a las nanobacterias como bacterias comunes solo que más pequeñas; además, es posible que muchos de los resultados considerados como negativos, tanto de cultivos o pruebas de ELISA a partir de sueros o cálculos renales, podrían ser realmente negativos.Por otra parte, algunos científicos argumentan que el fenómeno de biomineralización puede ocurrir por una reacción química, no relacionada con un agente infeccioso independientemente de las nanobacterias y estimulado por la luz (18); además, estos autores encontraron que la secuencia de ARN 16S atribuida a Nanobacterium sanguineum tiene una homología del 99% con Phyllobacterium myrsinacearum, una bacteria frecuentemente encontrada como una de las fuentes de contaminación de ADN en las pruebas de PCR (18)
A favor de la existencia de nanobacterias sus defensores han argumentado, cada uno de los puntos cuestionados. Por ejemplo, sobre la biomineralización de los cálculos renales como una característica de la reputada bacteria y los argumentos de que podría deberse a un proceso catalizado por la luz; los defensores de las nanobacterias han esgrimido el hallazgo de que esta bacteria, tal como ocurre con otros agentes biológicos, es fotoestimulada, lo cual explica la activación de la biomineralización con la luz (19). Además, al parecer, la formación de hidroxiapatita por Nanobacterium sanguineum es la única descrita capaz de ocurrir en soluciones de calcio y fosfato no saturadas (20) Otro argumento a favor de las nanobacterias es que su acción biomineralizante es inhibida in vitro por antibióticos no secuestradores de calcio como aminoglucósidos (12) y por las radiaciones gama (20) También, se ha descrito la producción de endotoxina por las nanobacterias que se asemejan a la endotoxina de Chlamydia (14, 15) Finalmente, el argumento más fuerte proviene de los pocos estudios in vivo realizados, según los cuales se ha constatado un marcado nefrotropismo de las nanobacterias al ser inyectadas en conejos y ratas; junto con las pruebas de citotoxicidad en líneas celulares de fibroblastos (9)
Importancia biomédica de Nanobacterias
El hecho de que las nanobacterias se encontraran como contaminantes en más del 80% de los lotes de sueros bovinos comerciales, motivó su búsqueda en sueros de humanos, lo que permitió su identificación en un 4% de los estudiantes de medicina de la Universidad de Kuopio, Finlandia, e incluso una persona de ese laboratorio donde se realizó la investigación se encontró colonizada por este agente al menos durante un periodo de cinco años y concomitantemente mostró una reacción serológica positiva hacia este agente (21)
Por otra parte, los cultivos in vitro de nanobacterias se caracterizan por la formación de una biopelícula caracterizada por la precipitación de calcio, que lleva a la formación de conglomerados de hidroxiapatita (9-10) La observación de esos cultivos al microscopio electrónico de transmisión reveló estructuras de aspecto cocobacilar, encerradas en una especie de iglú de hidroxiapatita (22); ese aspecto era similar al observado en los cálculos renales analizados al microscopio electrónico; lógicamente estas observaciones llevaron a la búsqueda de la nueva bacteria en cálculos renales, lo que fue exitoso en más del 90% de los cálculos calcáreos (23). También, las infecciones experimentales en animales de laboratorio (conejos y ratas) corroboraron que las nanobacterias presentan tropismo por el tejido renal y fue posible aislarlas de suero, orina y tejidos renales (24) Esta cadena de hallazgos ha llevado a postular que los cálculos renales calcáreos son una enfermedad producida por nanobacterias. La nueva propuesta es que la formación del cálculo se inicia con el proceso infeccioso y subsecuentemente es propiciado por otros factores endógenos del hospedero, entre los cuales podría estar la dieta. También, es posible que haya cierta tendencia familiar, lo cual podría deberse a factores compartidos dentro del núcleo familiar, como la dieta, o bien, la propia infección con nanobacterias e incluso, alteraciones innatas del epitelio urinario que podrían favorecer la precipitación de iones de calcio (9, 22, 23, 25)
Recientemente, Sommer y Kajander (26) comenzaron a detallar un poco más, cuál sería el mecanismo por el que las nanobacterias originarían la litogénesis. Estos autores han desarrollado un modelo basado en la energía libre necesaria para la precipitación de iones. En este proponen que los cálculos renales podrían formarse por transferencia de material entre nanobacterias y el tejido renal, prediciendo que la transferencia de componentes de calcio y fosfato solvatados de las nanobacterias ocurriría a partir de pequeños conglomerados que se comportarían como núcleos de precipitación (27)
La observación de que las nanobacterias promueven la calcificación in vivo, llevó a varios investigadores a considerar la posibilidad de que estos microorganismos participaran en otras patologías en que mediara un proceso de calcificación. Una de las primeras enfermedades en que se señaló esta posibilidad fue la aterosclerosis. Experimentos con bacterias marcadas radioactivamente mostraron que se acumulaban en la válvula aórtica y la aorta de un conejo al cual se inyectaron (9) La habilidad para actuar como nidos de calcificación a niveles no saturados de calcio y fosfato, la presencia de una endotoxina que estimularía una respuesta inflamatoria local y la posibilidad de causar infecciones crónicas, entre otros factores, otorgan a las nanobacterias un papel potencial en la aterogénesis (14, 28)
Investigaciones más recientes las han asociado a otras patologías con calcificación tales como la neuropatía periférica de pacientes con SIDA y diabéticos, la disminución de la densidad ósea en pacientes HIV positivos y la formación de cuerpos de psamoma en adenocarcinomas serosos papilares del ovario (29, 30) En el caso de la neuropatía periférica se ha propuesto que nanobacterias sanguíneas estresadas secretarían más biopelícula de calcio y fosfato que se depositaría en el perineurio y eventualmente cortaría la transmisión de mensajes; el tratamiento láser de la neuropatía ha mostrado una franca mejoría (29) Finalmente, también se ha asociado a las nanobacterias con los depósitos de hidroxiapatita en adenocarcinomas, conocidos como cuerpos de psamoma, que adicionalemente han sido positivas por antígenos de nanobacterias al teñirlas inmunohistoquímicamente (30)
Conclusión
]]> La existencia de las nanovesículas, nanoestructuras o nanobacterias, ha sido propuesta como una nueva entidad biológica, por los estudiosos de la astrobiología, rama de la ciencia que toma más fuerza cada día ante la posibilidad de hallazgos de vida fuera de la Tierra. También, el hallazgo de estructuras bacterianas minúsculas, calificadas como nanobacterias ha motivado su investigación y suscitado controversias por parte de grupos de investigadores que dudan de su existencia; mientras sus defensores, la mayoría provenientes o relacionados con la Universidad de Kuopio, Finlandia. Sin embargo, recientemente otros grupos de investigadores han corroborado el aislamiento e identificación serológica y molecular de tal agente. El reporte independiente más reciente corresponde a un grupo de investigadores norteamericanos de un hospital de Texas y de la clínica Mayo, quienes investigaron la posible presencia de este agente en pacientes con problemas de aterosclerosis, logrando identificar estructuras similares en placas calcificadas, de las cuales aislaron las nanobacterias e identificaron su ácido nucleico (28)Este tipo de informes corrobora la existencia de tales agentes, cuya existencia y su posible relación con problemas de salud caracterizados por calcificaciones abre nuevas posibilidades para su tratamiento y prevención. Sin embargo, habrá que esperar los resultados de más investigaciones para que la comunidad científica acepte la existencia de Nanobacterium sanguineum.
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