83% de sus ARN 2 y 3. Los análisis filogenéticos basados en CP indicaron la presencia de dos clados. El primero contiene cepas de referencia mundial de PMTV en conjunto con 19 de las cepas de este estudio; mientras que el segundo clado sólo agrupó cepas de Colombia, las que compartieron menos de 76% de identidad con el primer grupo. Esto posiblemente indica la ocurrencia de una nueva especie de pomovirus, aunque se requiere secuenciación de todo el genoma para confirmar dicha hipótesis taxonómica. El análisis del TGB2 generó un solo clado, agrupando indistintamente las cepas colombianas de PMTV con las de otros países. El análisis de los segmentos 2 y 3 del genoma viral, indicó que los dos aislamientos colombianos secuenciados compartían >94% de identidad con las secuencias de cepas de República Checa y Suecia. Estos resultados pueden ser utilizados para el diseño de herramientas de diagnóstico del PMTV en los Andes, que apoyen los programas de certificación de tubérculo-semilla y mejoramiento genético de papa.]]>
83%). Phylogenetic analysis based on the CP sequence revealed the presences of two clades. The first clade included PMTV reference strains from all over the world and 19 Colombian isolates used in this study. The second class grouped only Colombian isolates and shared less than 76% identity with clade 1, suggesting a new pomovirus species. Complete genome sequencing is required to confirm this hypothesis. Phylogenetic analysis using the TGB2 gene grouped all sequences in a single clade. Sequence analysis of segments 2 and 3 of the viral genomes revealed >94% sequence identity with PMTV isolates from Czech Republic and Sweden. These findings will be helpful in the development of diagnostic tools for PMTV in the Andes in order to support tuber-seed certification and genetic improvement programs.]]>
Variabilidad genética de aislamientos colombianos del potato mop-top virus (PMTV) Genetic variability of colombian isolates of Potato mop-top virus (PMTV)
Inés Osorio-Giraldo2*, Pablo Gutiérrez-Sánchez2, Mauricio Marín-Montoya2
El objetivo de este trabajo fue evaluar los niveles de variación de aislamientos de PMTV en cultivos de papa de Colombia durante los años 2010 y 2011. Se obtuvieron secuencias de los genes de la cápside viral (CP, ARN 2) y del Triple Bloque de Genes (TGB2, ARN 3) de cepas de PMTV de los departamentos de Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y Nariño. Adicionalmente, dos de los aislamientos fueron secuenciados en >83% de sus ARN 2 y 3. Los análisis filogenéticos basados en CP indicaron la presencia de dos clados. El primero contiene cepas de referencia mundial de PMTV en conjunto con 19 de las cepas de este estudio; mientras que el segundo clado sólo agrupó cepas de Colombia, las que compartieron menos de 76% de identidad con el primer grupo. Esto posiblemente indica la ocurrencia de una nueva especie de pomovirus, aunque se requiere secuenciación de todo el genoma para confirmar dicha hipótesis taxonómica. El análisis del TGB2 generó un solo clado, agrupando indistintamente las cepas colombianas de PMTV con las de otros países. El análisis de los segmentos 2 y 3 del genoma viral, indicó que los dos aislamientos colombianos secuenciados compartían >94% de identidad con las secuencias de cepas de República Checa y Suecia. Estos resultados pueden ser utilizados para el diseño de herramientas de diagnóstico del PMTV en los Andes, que apoyen los programas de certificación de tubérculo-semilla y mejoramiento genético de papa.
The objective of this work was to study the level of variation of PMTV isolates from Colombian potato crops through 2010 and 2011. Genes encoding for the viral coat protein (CP, ARN 2) and the Triple Gene Block (TGB2, ARN 3) were sequenced from PMTV isolates obtained in the provinces of Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y Nariño. Additionally, RNA 2 and RNA 3 from two isolates were almost sequenced to completion (>83%). Phylogenetic analysis based on the CP sequence revealed the presences of two clades. The first clade included PMTV reference strains from all over the world and 19 Colombian isolates used in this study. The second class grouped only Colombian isolates and shared less than 76% identity with clade 1, suggesting a new pomovirus species. Complete genome sequencing is required to confirm this hypothesis. Phylogenetic analysis using the TGB2 gene grouped all sequences in a single clade. Sequence analysis of segments 2 and 3 of the viral genomes revealed >94% sequence identity with PMTV isolates from Czech Republic and Sweden. These findings will be helpful in the development of diagnostic tools for PMTV in the Andes in order to support tuber-seed certification and genetic improvement programs.
Key words: RT-PCR, sequencing, Solanum tuberosum.
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Introducción
El Potato mop-top virus (PmTV), es la especie tipo del género Pomovirus y recientemente se ha clasificado en la nueva familia
Virgaviridae (adams et al. 2009). Su ámbito de hospedantes incluye un número limitado de especies de las familias solanaceae y Chenopodiaceae, siendo la papa (Solanum tuberosum L.) su principal hospedante desde el punto de vista económico (Kirk 2008). PMTV es transmitido por tubérculo semilla infectado y por zoosporas del plasmodiofórido Spongospora subterranea f. sp. subterranea ]]>
(Wallr.) (Lagerh) (Sss), agente causal de la sarna polvosa de la papa (Harrison y Jones 1970). Su presencia se ha registrado principalmente en regiones con climas húmedos y fríos como el Norte de Europa, las islas Británicas, Estados Unidos y Canadá, Japón, las zonas montañosas de Costa Rica y los Andes (Xu et al. 2004, salazar 2006, montero-astúa et al. 2008, Nakayama et al. 2010, santala
et al. 2010). a pesar de que se considera que PMTV es originario de los andes, su ocurrencia en colombia solo fue detectada en el año 2007 (Vélez 2007) y reconfirmada por Gil et al. (2011).
El PMTV puede causar pérdidas de hasta 26% en el rendimiento del cultivo de la papa, lo que sumado al efecto del daño ocasionado por su vector Sss, ]]>
et al. 2004, santala et al. 2010), las variantes del patógeno (Harrison y Jones 1970, nielsen y nicolaisen 2003) y fundamentalmente de las condiciones ambientales prevalentes durante su infección (Davey 2009, Latvala-Kilby et al. 2009). ]]>
El PMTV es un virus tripartita con morfología de varilla rígida de 18-20 nm en diámetro y longitudes de 290-310 nm, 150-160 nm y 65-80 nm. cada partícula contiene una molécula de ARN de cadena sencilla con polaridad positiva (ARNss+). El ARN 1, de 6043 nucleótidos (nt) codifica para una proteína que tiene motivos de metiltransferasa y helicasa (ORF 1) y una proteína generada por supresión del codón ]]>
et al. 1999, 2003). el ARN 2 (3134 nt) contiene un ORF para la proteína de la cápside (CP) de 20 kDa. También codifica para una proteína de 90 kDa generada por lectura continua (readthrough, CP-RT), a través de un codón ámbar en el gen de la CP. Diversos estudios han indicado que esta proteína RT está involucrada en la transmisión por sss del PmTV, siendo demostrada mediante ]]>
et al. 1997).
El ARN 3 (2694 nt) codifica para cuatro polipéptidos de 51, 21, 13 y 8 kDa, respectivamente. Los primeros tres presentan secuencias similares a proteínas del Triple Bloque de Genes (TGB) involucradas en el movimiento de ]]>
pomovirus corresponden a la clase 1 o grupo hordei de estas proteínas, en conjunto con las codificadas por otros géneros de la familia Virgaviridae y del género Hordeivirus. Se cree que TGB2 y TGB3 asisten a TGB1 en su función de trasportar el genoma viral a través de los ]]>
et al. 2009). La cuarta proteína (8 kDa) es rica en cisteína (CRP) y aparentemente está involucrada en el movimiento sistémico del PMTV y en la expresión de síntomas necróticos en hospedantes experimentales (Savenkov et al. 1999, 2003).
Los síntomas que causa PMTV ]]>
mop-top) (Xu et al. 2004). En la región Andina, no es frecuente ]]>
et al. 2006, gil et al. 2011). sin embargo, según Salazar (2006), el PMTV es uno de los virus prevalentes en el cultivo de la papa en los Andes.
A nivel mundial, se ha reportado la presencia de bajos niveles de variación entre genotipos de PMTV (mayo et al. 1996, santala et al. 2010). Latvala-Kilby et al. (2009), comparando secuencias de cP de 23 aislamientos de Finlandia y Letonia con respecto a secuencias disponibles en GenBank para cepas de Escocia, ]]>
et al. (1996) al comparar las secuencias de cP de tres aislamientos de Escocia y ocho de Perú; mientras que Xu et al. (2004), ]]>
En Colombia, ]]>
et al. (2011), quienes encontraron que las variantes de PMTV tan solo presentaban un 76% y 86% de identidad para cP y TgB2 y con respecto a los aislamientos mundialmente reportados de PMTV. Sin embargo dichos análisis ]]>
El objetivo de este trabajo fue evaluar los niveles de variación de aislamientos de PMTV en ]]>
et al. (2011). Adicionalmente, se realizó la secuenciación de gran parte de los ARN 2 y ]]>
Materiales y Métodos
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Colección y preparación de muestras
Se obtuvieron muestras de raíces y tubérculos de papa con síntomas de sarna polvosa, así como de suelos de lotes con reportes de la presencia de sss, en las zonas colombianas ]]>
Figura 1). Para la separación de los quistosoros del suelo, se siguió la metodología de Jaramillo y Botero (2007), en la cual las muestras de suelo (500g) son pasadas por un juego de tamices de 100 y 25 µm. Aproximadamente, 1 g de los quistosoros obtenidos fueron inoculados en Nicotiana ]]>
y Solanum phureja, utilizadas como plantas señuelo para incrementar el inóculo de PMTV a partir de la infección de su vector Sss (Gil et al. 2011). El material vegetal fue mantenido en macetas con 250 g de turba como sustrato, bajo condiciones de casa de malla en el Centro Experimental Paysandú, de la Universidad Nacional de Colombia (sede Medellín) ubicada en el corregimiento de Santa Elena, municipio de Medellín. La zona de vida es bhMB (Holdridge 1987), con una ]]>
Secuenciación de CP y TGB2
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Se obtuvo el ARN total de plantas de N. benthamiana y S. phureja mediante el RNeasy plant mini kit, a partir de 100 mg de tejido, utilizando 450 μl de buffer RLT para tejido foliar o RLC para raíces y 4,5 μl de β-mercaptoetanol, siguiendo las instrucciones del fabricante. Al finalizar el procedimiento, el ARN obtenido se eluyó en 40 μl de agua destilada estéril tratada con DEPC.
Las reacciones de RT-PCR se realizaron en dos pasos. Para la retrotranscripción (RT) se utilizó un volumen final de 20 µl, incluyendo 0,5 µl de agua destilada estéril, 1,5 µl de PBST (0,5%), 4 µl de buffer RT (5X), 4 µl de MgCl2 (25 mM), 2 µl de dNTPs (10 mM), 2 µl del cebador reverso específico 123_end (10 µM) (Savenkov
et al. 1999), 0,5 µl de inhibidor de ARNasas (40U/µl), 0,5 µl de retrotranscriptasa del virus de la leucemia murina (M-MuLV) (20 U/µl) y 5 µl de ARN o alternativamente una dilución 1:5. El programa de RT fue de 37°C por 60 min, seguido de 70°C por 10 min, para inactivar la enzima. Las muestras del ADN copia (ADNc) se almacenaron a 4°C hasta su uso posterior. Como control positivo de amplificación de PMTV, se utilizó la muestra proveída para este fin por el Kit de ELISA de Bioreba, realizándose la extracción de RNA en la misma forma que ]]>
Para las reacciones de PCR se emplearon los cebadores específicos H360 y C819 (MacKenzie 1996) para amplificar una región de 459 pb del gen CP entre las posiciones 385 y 844 del genoma viral; así como los cebadores PMTVF4 y PMTVR4 para obtener amplicones de 415 pb del TgB2, entre las posiciones 1726 y 2141 del ARN 2 (Xu et ]]>
2004). Para algunos aislamientos en los que se dificultaba la amplificación del TGB2, se utilizaron los cebadores PMTV5 y PMTV7 (Lambert et al. 2003) que amplifican un fragmento de 646 pb y se extienden entre las posiciones del genoma 1417 a 2063. Las PCR se realizaron en 25 µl incluyendo 15,8 µl de agua destilada estéril, 2,5 µl del amortiguador para la enzima (10X), 1,8 µl de MgCl2 (25 mM), 0,5 µl de dNTPs (10 mM), 0,5 µl de cada cebador (10 µM), 0,2 µl de albúmina de suero ]]>
Generuler 100 pb.
Los amplicones del tamaño esperado correspondientes al menos a cuatro aislamientos representativos de cada uno de los cuatro departamentos bajo estudio, fueron purificados del gel mediante el kit QIAquick Gel Extraction, para realizar su secuenciación directa en ambos sentidos utilizando los mismos cebadores empleados en la Pcr y el
Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit. Su corrido y separación se realizó en un secuenciador ABI Prism 3730xl.
A partir de las secuencias obtenidas con cada cebador, se construyeron las secuencias consenso mediante los programas bioinformáticos BioEdit 6.0.6 (Hall 1999) ]]>
et al. 1990) y se obtuvieron secuencias de PMTV del GenBank de otras regiones del mundo, para realizar un análisis filogenético. Para esto, se generó un alineamiento mediante Clustal W (Larkin et al. 2007) del programa Bioedit 6.0.6. Los alineamientos fueron utilizados en una matriz de distancia ]]>
et al. 2007). Para evaluar el soporte estadístico de cada agrupación, se realizó un análisis de Bootstrap con 1000 remuestreos (Felsenstein 1985).
Secuenciación del ARN 2 y ARN 3 de aislamientos colombianos de PMTV
Con el fin de obtener un mayor nivel de información sobre las características de los segmentos ARN 2 y ARN 3 del genoma de aislamientos colombianos de PMTV, se realizó un proceso de secuenciación con minado de cebadores, previamente reportados para la amplificación de ]]>
Cuadro 1) y buscando que generaran traslape de secuencias para la construcción de un contig. Para esto se utilizaron dos cepas de PMTV de Antioquia (23T) y Boyacá (BS4T), seleccionadas gracias a la disponibilidad del material biológico necesario para su evaluación. Con cada cepa se realizaron por lo menos dos amplificaciones con cada cebador, de manera que las secuencias reportadas correspondieran al consenso para cada ]]>
Las secuencias se editaron mediante el programa Chromas Lite, generándose los consensos con ambos cebadores con el programa Bioedit 6.0.6 y se procedió al ensamblaje de los contigs resultantes con el programa CAP3 (Huang y ]]>
et al. 2012) y se realizó su alineamiento con respecto a las secuencias de los dos segmentos genómicos de aislamientos cuyas secuencias completas se encontraban disponibles en genBank (DQ102381, DQ144451, AJ243719, AJ277556) (Sandgren et al. 2001, Cerovska et al. 2007). ]]>
Las secuencias de nucleótidos fueron traducidas y se compararon los porcentajes de identidad y número de posiciones variables a lo largo de las regiones bajo estudio y generándose árboles filogenéticos basados en los contigs obtenidos en la investigación, mediante el programa Mega v. 4.0, bajo los parámetros antes descritos. ]]>
Los números de accesión de las secuencias obtenidas en este trabajo corresponden a las series: JX889608-JX889611 y JX885612-JX885631.
Resultados y Discusión ]]>
Variabilidad genética de PMTV en Colombia
En total se obtuvieron 25 secuencias para la región amplificada de CP y 38 para TGB2. Estas correspondieron a por lo menos cuatro ]]>
Cuadro 2). De esta forma se aumentaron las secuencias parciales de los genes CP y TGB2 de PMTV con respecto al trabajo reciente realizado por gil et al. (2011) en donde solo se obtuvieron cuatro y tres secuencias, para CP y TGB2; lo cual implica que las diferentes modificaciones realizadas a los procedimientos necesarios para el estudio de este virus, desde la ]]>
et al. (2008) en costa rica pero utilizando pruebas de eLisa tanto para la detección de Sss como de PMTV. En este caso se encontró que el virus era más frecuentemente detectado en las regiones con mayores altitudes, donde las condiciones de alta humedad y bajas temperaturas aparentemente favorecen su infección. Sin embargo, es probable que la utilización de ]]>
Estos resultados ]]>
et al. (2011) en referencia a la presencia de una variante viral de PMTV en Colombia, que incluso bajo los parámetros definidos por Adams et al. (2009), para la definición de especies al interior de la familia Virgaviridae (ej. cepas con identidades superiores a 80 y 90% a nivel de secuencias de CP y del genoma completo, respectivamente) podría representar ]]>
Estos resultados difieren con ]]>
et al. 2009). similarmente, Xu et al. (2004) reportaron que aislamientos de PMTV de Estados Unidos y Canadá eran idénticos y que estos a su vez tan solo diferían en máximo 3% de sus secuencias de cP con respecto a cepas de Perú (mayo et al. 1996), Escocia y Escandinavia (Reavy et al. 1997). Los mayores niveles de diversidad encontrados en este trabajo ]]>
Con respecto al análisis filogenético basado en las secuencias de TGB2, se incluyeron 330 posiciones de 49 secuencias, siete de las cuales fueron de aislamientos de referencia de diferentes países y tres de colombia ]]>
et al. 2011). el dendrograma generado presentó un solo clado que incluyó todas las secuencias (Figura 2), las que compartieron niveles de identidad superiores a 98% (Cuadro 4).
Estos resultados son un indicativo ]]>
et al. ]]>
Los altos niveles de conservación de este gen entre aislamientos de PMTV, posibilitan que los cebadores utilizados para su amplificación sean una herramienta útil para el diagnóstico de este virus. así por ejemplo, Lambert et al. (2003) diseñaron los ]]>
et al. (2004), utilizaron la región que codifica para TGB2 para el diseño de los cebadores PMTVF4 y PMTVR4 en su estudio de evaluación de distribución de PMTV en EEUU y Canadá.
Secuenciación del ARN 2 y ARN 3 de aislamientos colombianos de PMTV
Para el ARN 2 se obtuvieron contigs de 2577 nt y 2584 para los aislamientos de Antioquia y Boyacá; mientras que para el ARN 3 los contigs tuvieron una extensión de 2617 y 2360 nt, respectivamente. Esto implica que para el ARN 2 se ]]>
et al. 2001).
En términos de aa los contigs del arn2 incluyeron 150 de los aa de cP (posiciones 26 a 176) y ]]>
1 a 146) para el aislamiento de Boyacá y la totalidad de dicha proteína para la cepa de Antioquia. Las demás secuencias obtenidas corresponden a regiones UTR de los extremos 3´ para el ARN 2 y 5´ para el ARN 3.
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Con el fin de realizar un análisis de variación de las secuencias de las dos cepas obtenidas con respecto al genoma de la de PMTV de Suecia – Sw (Savenkov et al. 1999, Sandgren et al. 2001), se incluyeron 1956 nt (651 aa) para CP-RT, 531 nt (176 aa) para CP y 1392 (463 aa) para las tres regiones del TGB. En términos generales se encontraron muy altos niveles de ]]>
Figura 3). Las pocas diferencias a nivel ]]>
Por otra parte, el análisis filogenético realizado con base en 2569 nt para el ARN 2 con secuencias de referencia de los aislamientos Corneta-Nemilkov de República Checa (DQ102381) y Sw (AJ243719) de Suecia (Figura 4), arrojó un dendrograma con dos clados soportados por 100% de bootstrap, separándose los aislamientos de colombia de los de europa; sin embargo, los niveles de identidad entre ambos grupos fueron muy altos (>97,5%). Al calcular los niveles de diversidad (promedio del número de sustituciones de nucleótidos por cada sitio), para sitios sinónimos (dS) y no sinónimos (dNS), se encontró una diversidad muy baja, con tan solo 0,017 (se= 0,003) para dns y 0,009 (SE=0,002) para dS. La relación promedia entre dNS/ dS fue de 1,8, lo cual indica que las cepas de PMTV se encuentran bajo selección positiva para este componente del genoma. Para las cepas colombianas el valor de dNS/dS fue de 3, mientras que para las europeas fue de 1,2. La distancia genética basada en el método de Ki-mura-2 parámetros, para toda la población fue de 0,015.
El análisis filogenético realizado con base en 2008 nt para arn 3, con secuencias de referencia de los aislamientos Korneta-Nemilkov (DQ144451), 54-19 (AY353719) y 54-10 (AY426745) de Dinamarca, Sw (AJ277556) de Suecia y Todd (D30753) de Escocia (Figura 5) generó un dendrograma con dos clados principales de aislamientos europeos, mientras que los colombianos se presentaron en posición intermedia entre estos, en ramas soportadas por 100% de bootstrap. A pesar de dichas agrupaciones, los niveles de identidad entre todos los aislamientos fueron superiores a 96,7%. Al calcular los niveles de diversidad para sitios sinónimos (dS) y no sinónimos (dNS), se encontró una diversidad muy baja para todos los aislamientos, con tan solo 0,011 (se= 0,002) para dns y 0,044 (SE=0,006) para dS. La relación media entre dNS/dS fue de 0,25, lo cual indica que las cepas de PMTV se encuentran bajo selección negativa en dicho segmento de ARN. Para las cepas colombianas el valor de dNS/ dS fue de 0,19, mientras que para los aislamientos europeos fue de 0,39. La distancia genética basada en el método de Kimura -2 parámetros, para toda la población fue de 0,020 (SE 0,002).
Los bajos niveles de variación encontrados en los análisis de genomas de PMTV (Savenkov et al. 1999, Sandgren et al. 2001, Cerovska et al. 2007) y que nuevamente fueron inferidos en el presente estudio para las cepas del clado que representa PMTV sensu stricto, indican que este virus se encuentra bajo fuertes presiones de selección determinadas presumiblemente por las propias características de su genoma, el estrecho ámbito de hospedantes y su transmisión persistente y específica por parte de su vector Sss (Kirk 2008, Santala et al. 2010). Para el primer caso, la restricción selectiva se manifiesta por los bajos valores de dNS/dS calculados para dicho segmento y ocurre fundamentalmente al presentarse el ARN 2, dicha relación fue >1, lo cual sugiere una selección positiva, al presentarse menos restricciones para la fijación de mutaciones en los genes que codifican para CP y CP-RT. De otra parte, la presencia de un estrecho ámbito de hospedantes para el virus, que se restringe a algunas especies de las familias Solanaceae y Chenopodiaceae (Kirk 2008), sumada a su transmisión por Sss supone fuertes restricciones sobre los cambios en las diferentes proteínas del virus que interactúan con sus hospedantes y vectores, lo cual impide altas tasas de variación, tales como las que presentan otros virus de ARNss(+) como los potyvirus, que en general tienen amplios ámbitos de hospedantes y cuya transmisión por áfidos polífagos es del tipo no persistente (Hu et al. 2011).
De forma interesante, estudios recientes realizados por osorio et al. (2012), han encontrado que en Colombia se presenta un mayor nivel de variación con respecto a otros países, entre las poblaciones de sss, vector de PMTV, al registrarse además de los Tipos mundialmente reportados de este patógeno (I y II), un tercer Tipo (III), que presenta porcentajes de divergencia entre 2% y 5%, con respecto a los anteriores.
El resultado de las inserciones y diferentes sustituciones encontradas en este trabajo en los segmentos de ARN 2 y 3, requiere un tratamiento futuro detallado a partir de análisis de mutantes y de sus consecuencias sobre el ciclo infectivo viral. Igualmente, es imperativo estudiar el efecto de los dos genotipos virales detectados en este estudio sobre la producción y calidad del tubérculo semilla de papa en Colombia, de manera que los organismos de sanidad vegetal estatal, gremios de productores y agroindustrias, puedan valorar la necesidad de incluir la detección del PMTV en los programas de certificación de semilla y de mejoramiento genético de papa.
Agradecimientos
Esta investigación se realizó gracias al apoyo económico y técnico del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural (proyecto 090-2007S4527-87-08), de la Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín, Fedepapa y Fritolay. Se agradece a la Prof. Luz Estela Lagos, de la Universidad de Nariño por su apoyo con la colección de muestras en el Departamento de Nariño. ]]>
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*Correspondencia para: Inés Osorio-Giraldo. Laboratorio de Biología Celular y Molecular y Laboratorio de Microbiología Industrial, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia - Sede Medellín, Colombia. Calle 59A No 63 - 20, Medellín, Colombia. inesosorio@gmail.com. Pablo Gutiérrez-Sánchez. Laboratorio de Biología Celular y Molecular y Laboratorio de Microbiología Industrial, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia - Sede Medellín, Colombia. Calle 59A No 63 - 20, Medellín, Colombia. paguties@unal.edu.co. ]]>
Mauricio Marín-Montoya. Laboratorio de Biología Celular y Molecular y Laboratorio de Microbiología Industrial, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia - Sede Medellín, Colombia. Calle 59A No 63 - 20, Medellín, Colombia. mamarinm@unal.edu.co. 1. Parte de la tesis de maestría de la primera autora, desarrollada en el marco del proyecto 090-2007S4527-87-08, financiado por Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, Colombia.
2. Laboratorio de Biología Celular y Molecular y Laboratorio de Microbiología Industrial, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia - Sede Medellín, Colombia. Calle 59A No 63 - 20, Medellín, Colombia. inesosorio@gmail.com, paguties@unal.edu.co, mamarinm@unal.edu.co (autor para correspondencia).
Recibido: 28 de febrero, 2012. Aceptado: 1 de abril, 2013.