Diversidad genética de maracuyá en Guatemala revelada por marcadores AFLP. Los objetivos de este estudio fueron caracterizar con AFLP nueve genotipos colectados en Guatemala y determinar la diversidad genética existente. En el Instituto de Ciencia y Tecnología Agrícolas (ICTA), en el período julio 2010/mayo 2011, se realizó este análisis preliminar amplificando diez combinaciones selectivas con las que se detectaron 106 polimorfismos. Las combinaciones selectivas E+ACG/M+CAG, E+ACA/M+CTA, E+ACT/M+CTG y E+AAC/M+CTT dieron el mayor grado de información. En promedio se visualizaron diez loci por amplificación selectiva. El análisis de similaridad reveló que los genotipos no están duplicados. Los análisis de correspondencia y conglomerados identificaron dos grupos bien definidos. El primero incluyó a los materiales de P. edulis f. edulis Sims y el segundo a los materiales de P. edulis f. flavicarpa Degener. La diversidad genética de Nei para la colección fue 0,3160. La diferenciación genética (Gst) fue 0,2542. El 25,42% de la diversidad se expresó entre grupos mientras que el 74,58% dentro de estos. Los resultados dan evidencia de la cercanía evolutiva de los tipos amarilla y morada de P. edulis Sims. El flujo genético fue alto (Nm=1,4670) como se esperaba en una especie alógama en la que se favorece el intercambio inter e intraespecífico.
Genetic diversity of passion fruits in Guatemala revealed by AFLP markers. The objectives of this study were to characterize with AFLP nine genotypes of passion fruit collected in Guatemala, to identify clusters and to evaluate the existing genetic diversity. The study was conducted at Instituto de Ciencia y Tecnología Agrícolas (ICTA), during July 2010/May 2011. A preliminary analysis was conducted in which ten selective primer pairs were amplified and 106 polymorphisms were detected. The selective primer pair E+ACG/M+CAG, E+ACA/M+CTA, E+ACT/M+CTG and E+AAC/M+CTT, gave the most information. An average of ten loci per selective amplification was detected. Similarity analysis revealed no duplicated genotypes. Correspondence and clustering analysis identified two groups. The first one included all accession of P. edulis f. edulis Sims and the second one all accessions of P. edulis f. flavicarpa Degener. The genetic diversity based on Nei´s index for the collection was 0,3160. Genetic differentiation (Gst) was 0,2542 for the entire collection; 25.42% of the genetic diversity is expressed between groups while the 74,58% is expressed within groups. Those results give evidence of the evolutionary proximity of the purple and yellow types of P. edulis Sims. The genetic flow was high (Nm=1,4670) as expected in an allogamous species in which genetic exchange is facilitated.
El maracuyá (Passiflora edulis Sims) es una especie neotropical ]]>
et al. 2009). También, se ha reportado que los residuos del fruto de maracuyá tienen alta capacidad ]]>
et al. 2009).
P. edulis es una especie predominantemente alógama que presenta un sistema genético de autoincompatibilidad que favorece la polinización cruzada inter e intra-específica ]]>
et al. 2003). Se conocen dos formas de P. edulis que se diferencian principalmente en el color del fruto, el aroma y el sabor. P. edulis f. edulis Sims es conocida como maracuyá morado (Crochemore et al. 2003), ]]>
et al. 1997). Por otro lado, P. edulis f. flavicarpa Degener se conoce como maracuyá amarillo (Crochemore et al. 2003), simplemente maracuyá, yellow passion fruit (Ortiz 2010) o maracujá-amarelo (Sousa et al. 1997). El maracuyá amarillo es la forma más conocida en el comercio agrícola ]]>
A parte del color del fruto, el sabor y la resistencia a enfermedades, P. edulis f. edulis y P. edulis f. flavicarpa no ]]>
et al. 2003). Sin embargo, la caracterización molecular puede diferenciar entre individuos de P. edulis sin dependencia del ambiente (Fonseca et al. 2009).
La mayoría de los estudios moleculares han reportado el uso ]]>
et al. 2002, Crochemore et al. 2003, Fonseca et al. 2009, Oliveira et al. 2005, Ortiz 2010, Pérez et al. 2009). La mayoría de las investigaciones se ha hecho con RAPD, ]]>
et al. 2003, Ganga et al. 2004.).
Andrade et al. (2002) establecieron que P. edulis f. edulis Sims ]]>
P. edulis f. flavicarpa Degener tienen una similaridad del 34.35% por lo que son altamente variables cuando son analizados con RAPDs. Más interesantes aún fueron los resultados reportados por Crochemore et al. (2003) pues revelaron evidencia de que P. edulis f. edulis es ascendente genético de P. edulis f. flavicarpa y que ]]>
P. edulis f. edulis y no de un cruce interespecífico con una especie diferente.
Tanto Oliveira et al. (2005) como Fonseca et al. (2009) ]]>
Las técnicas AFLP y SSR fueron utilizadas (Ortiz 2010) para estudiar la diversidad genética inter-específica en materiales de maracuyá amarillo colectados en Colombia, ]]>
et al. (2005) no fueron informativos.
En términos generales, se ha establecido que el índice de diversidad genética de P. edulis Sims es alto y debe estar dado ]]>
et al. 2009) en cruces naturales y artificiales entre individuos adaptados a diferentes regiones agro-climáticas (Crochemore et al. 2003).
En Guatemala, el cultivo de maracuyá es una introducción reciente que ya muestra diversidad agromorfológica y potencial ]]>
P. edulis que agrupa a nueve genotipos (Lacán e Illescas 2010).
El estudio de diversidad genética de dicha colección ]]>
P. edulis f. edulis y P. edulis f. flavicarpa, detectar duplicados y establecer a mediano plazo programas de mejoramiento genético, agroindustria, conservación, diversificación de cultivos y alimentos para consumo nacional y exportación.
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El objetivo de este trabajo fue caracterizar, con marcadores moleculares AFLPs, nueve materiales de maracuyá cultivados en Guatemala para determinar la diversidad genética existente.
Materiales y Métodos
Material ]]>
En el período julio 2010/mayo 2011, se analizaron nueve accesiones de maracuyá colectadas en un estudio anterior en campos productores de Guatemala (Lacán e Illescas 2010). La caracterización morfológica de dichos materiales no reveló la diversidad genética presente. El avance más significativo fue determinar a qué forma botánica pertenecen las accesiones colectadas, utilizando el color del fruto, el aroma y el sabor como marcadores. De aquí que los nueve materiales colectados se clasificaran en ]]>
P. edulis f. edulis, de fruto morado, y cuatro de P. edulis f. flavicarpa, de fruto amarillo (Cuadro 1) (Lacán e Illescas 2010). Para este estudio molecular se ordenaron según su clasificación varietal y se conservó el número de accesión correspondiente a cada material en la colección (Cuadro 1). ]]>
Extracción, verificación de integridad y cuantificación de ADN. Las primeras hojas, diferentes de las primarias, de tres plantitas de quince días de edad, fueron seleccionadas al azar para hacer una mezcla de material vegetal (aproximadamente 200 mg), la cual fue macerada con pistilos y nitrógeno líquido dentro de tubos de microcentrífuga de 1,5 ul. El polvo obtenido se sometió al protocolo de extracción propuesto como se describe en Ponciano et al. 2009. El precipitado resultante se resuspendió en 150 μl de buffer TE (10mM Tris-HCL, 1mM EDTA, pH 8,00) y se almacenó a 4ºC. La integridad del ADN fue verificada cargando 10 μl en un gel de agarosa al 0,8%. A partir de diluciones 1:200 se cuantificó el ADN en un espectrofotómetro Bio-Rad SmartSpec3000 con un factor de conversión A260 nm 1,0= 50,0 μg/ml. La calidad del ADN se determinó a partir de la razón A260/A280. El ADN se diluyó a 25 ng/μl para las siguientes amplificaciones (Ponciano 2004).
Amplificación y visualización de AFLPs. Para este primer intento de establecer la huella genética de las accesiones de maracuyá, se propuso la técnica AFLP para generar información sobre similitudes y diferencias entre los materiales con base en los alelos presentes para un rango de loci amplificados a lo largo del genoma. Los recursos disponibles limitaron el estudio a la amplificación de diez combinaciones de partidores selectivos (Cuadro 2). Estas fueron escogidas con base en información reportada previamente en amplificación de RAPDs, RAM y SSR (Andrade et al. 2002, Crochemore et al. 2003, Fonseca et al. 2009, Oliveira et al. 2005) sobre secuencias de nucleótidos más frecuentes en maracuyá.
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Para todas las muestras se amplificaron marcadores AFLP utilizando el sistema AFLP® Analysis System I (Invitrogen™ Life Technologies, California, USA) (Invitrogen Corporation 2003) siguiendo los protocolos establecidos por el proveedor. Se utilizó una alícuota de 10 μl de ADN genómico total diluido en la reacción de digestión con las enzimas de restricción EcoR I y Mse ]]>
EcoR I y Mse I para generar el ADN molde el cual fue utilizado en las amplificaciones siguientes. La preamplificación consistió en amplificar el ADN molde con partidores complementarios a los adaptadores y al sitio de restricción M
se I más un nucleótido adenina (Partidor Mse I +A) y al sitio de restricción EcoR I más un nucleótido citosina (Partidor EcoR I +C). El programa de preamplificación consistió en 20 ciclos de desnaturalización a 94°C por 30 segundos, seguido de hibridización a 56°C por 60 segundos y una elongación a 72°C por 60 segundos. La preamplificación de las muestras fue verificada cargando 10 μl de producto de PCR en un gel de agarosa 1,2%. Las muestras se mezclaron ]]>
EcoR I y Mse I más tres nucleótidos selectivos adicionales cada uno (Cuadro 2).
Estos marcadores fueron ]]>
Después de la amplificación, se agregó un volumen igual de solución de formamida al 95% formamida, 3% agua, 2% EDTA0.5M, 0,01% azul de bromofenol y 0,01% xilen cianol) y la ]]>
et al. (2009). El gel se secó por ]]>
et al. 2009).
Análisis de datos. A partir de los patrones de bandas visualizadas en los geles, se codificó la información alélica en una matriz de ausencia y presencia, la cual fue utilizada para análisis de similaridad y de correspondencia en ]]>
et al. 2009). La diversidad genética entre los grupos identificados en el dendrograma basada ]]>
et al. 1997). La matriz utilizada para este programa se construyó representando cada banda o alelo amplificado como un genotipo diferente dada la dominancia de los AFLPs (Wagara et al. 2004). El análisis estadístico se realizó en los módulos DOMINANT DATA ANALYSISDIPLOID DATA-SINGLE POPULATIONS AND MULTIPLE POPULATIONS. Los parámetros de ]]>
ST), y flujo genético (Nm). La diferenciación genética fue calculada con la formula de Nei (1978) GST=DST/ HT, donde HT= HS+DST y DST= HT-HS, donde HT es la diversidad total para la poblaciones y DST es la diversidad genética entre poblaciones (Blair
et al. 2007). El flujo genético es igual al número de migrantes entre poblaciones por generación calculada en base a la fórmula Nm=0,5(1-GST)/GST (Blair et al. 2007).
Resultados y Discusión ]]>
Análisis de AFLPs en la colección de maracuyá
Se recopiló la información de un total de 106 bandas polimórficas, que fueron tratadas como loci individuales ]]>
Cuadro 2). Todas las bandas monomórficas fueron eliminadas del análisis. El promedio fue de diez AFLPs por combinación selectiva. Comparado con el promedio de veintiocho bandas polimórficas por combinación, reportado previamente (Ortiz 2010), es un valor bajo. La diferencia puede estar dada porque no se incluyeron genotipos nativos o de otras especies cercanas dentro de los genotipos comerciales de Guatemala evaluados en este estudio. Lamentablemente, los resultados del estudio de Ortiz ]]>
El rango de bandas polimórficas amplificadas fue de 0 a 28. La combinación E+ACG/M+CAG fue la más informativa con veintiocho loci polimórficos y la menos informativa fue E+AGG/M+CTC con cero loci amplificados. Esta ]]>
et al. (2004) y Ortiz (2010). Aunque es ]]>
La accesión 5(10) no amplificó AFLPs en las combinaciones nueve y diez.
Análisis de similaridad genética y agrupamientos
Para establecer la diversidad genética a partir de los datos generados en la visualización de fragmentos polimórficos se construyó una matriz de similaridad con el coeficiente de ]]>
Figura 1) y se evidenció que todos los materiales son genéticamente diferentes. Así se descartó la sospecha de genotipos duplicados (Crochemore et al. 2003). El análisis de agrupamientos del dendrograma identificó dos grupos con un 44% de similitud. La accesión C2(2) se separa del resto con un 40% de similaridad. ]]>
La primera población incluye a los materiales pertenecientes a la especie P. edulis f. edulis Sims. Si se cambia la posición espacial de la accesión C2(2) hacia arriba en el dendrograma, se podría agrupar junto a esta población dando sentido al resultado previo en que fue clasificada morfológicamente como P. edulis forma edulis (Cuadro 1). El análisis de correspondencia (Figura 2) apoya la acción de incluir el genotipo C2 (2) en la agrupación, ya que la representación espacial en dos dimensiones muestra su cercanía al conglomerado de genotipos C1(1), C3(8) y C4(9). El hecho de que se separe puede ser debido a que es una introducción proveniente de Brasil que tiene menos tiempo de establecimiento en Guatemala y por lo mismo tenga un grado mayor de diferenciación respecto al resto de genotipos en la colección (Fonseca et al. 2009). Por otro lado, los genotipos C3(8) y C4(9), que fueron colectados en la misma finca en Sacatepéquez, aunque son diferentes tienen una similitud del 74%. Estos pueden ser producto de la polinización cruzada entre estas accesiones colectadas en ubicaciones tan cercanas.
La segunda población agrupa a todos los genotipos identificados como P. edulis f. flavicarpa. Con estos resultados se corrobora la clasificación inicial de los materiales colectados respecto a su inclusión en una u otra forma de maracuyá principalmente por el color de fruto. Dicha característica es un buen marcador para la clasificación de nuevos genotipos (Sousa y Meletti 1997). Las accesiones C8(6) y C9(7) fueron colectados en el mismo municipio de Huehuetenango pero solo comparten un coeficiente de similaridad de 0,46.
Un nuevo análisis de similaridad fue realizado entre las accesiones clasificadas dentro de la especie P. edulis f. edulis para establecer la relación entre la accesión C5(10), que inicialmente fue excluida, y el resto de materiales de fruto morado. Aquí se utilizó la información genotípica generada con las combinaciones selectivas donde el material C5(10) amplificó en la misma proporción que el resto. El dendrograma resultante (Figura 3) es consistente con la agrupación de la colección completa ya que el genotipo 2 queda fuera del conglomerado de los genotipos C1(1), C3(8) y C4(9). Dentro de este conjunto mayor se agrupa el material C5(10) con un coeficiente de similaridad de 0,53. ]]>
Análisis de la diversidad genética
La diversidad genética calculada por el índice de Nei para todos los genotipos de la colección de maracuyá fue 0,3160 (Cuadro 3). Se observó que el grupo de P. edulis f. edulis presentó el mayor valor de diversidad (0,2725).
La diversidad genética entre las dos poblaciones, formadas a partir del análisis de conglomerados, relativa a la diversidad genética total fue 0,2542. Este valor indica que hubo una baja diferenciación entre los grupos analizados, puesto que sólo el 25,42% de la variación genética observada en este estudio fue debida a la diferenciación entre las dos formas de maracuyá, comparada con el 74,58% de variación observada dentro de los grupos. Esto apoya las diferencias genéticas establecidas previamente entre P. edulis f. edulis Sims y P. edulis f. flavicarpa Degener, para separarlas en grupos diferentes. También, el valor de diversidad genética dentro de las poblaciones hace evidente el alto grado de intercambio genético que hay entre los individuos (Ganga et al. 2004, Fonseca et al. 2009).
El flujo genético total fue alto (mayor de 1,0000) (Nm=1,4670) como se esperaba debido a la naturaleza alógama del maracuyá, en la cual se favorecen los cruzamientos entre los individuos del mismo material, entre estos de la misma forma botánica de maracuyá y entre individuos de diferentes especies. Esto coincide con resultados previos (Andrade et al. 2002, Crochemore et al. 2003, Ganga et al. 2004, Fonseca et al. 2009, Oliveira et al. 2005, Ortiz 2010).
La caracterización preliminar con AFLPs reveló alta diversidad natural dentro de la colección de maracuyá cultivado en Guatemala. No se detectaron genotipos duplicados y se observó que los materiales forman conglomerados de acuerdo a su forma botánica. De acuerdo a los valores de los parámetros calculados, la diferenciación genética entre agrupaciones fue alta y cada grupo mostró un amplio índice de diversidad.
Se determinó utilizar siete de las combinaciones AFLP reportadas en este estudio (E+ACA /M+CAA, E+ACG /M+CAG, E+ACA /M+CTA, E+AGC / M+CTA, E+ACT /M+CTG, E+AAC /M+CTT, E+ACA/M+CTT). En el futuro, se debe amplificar otras combinaciones para establecer el grado de información genética que puede proporcionar cada una. Con la utilización de un mayor número de combinaciones selectivas, se pueden obtener resultados más concluyentes en nuevos estudios de diversidad genética tanto de maracuyá como de otros cultivos que empiecen a tener importancia económica en la región hispanoamericana. Literatura Citada
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*Correspondencia a: Karla Melina Ponciano-Samayoa. Laboratorio de Biotecnología y Programa de Promoción y Apoyo Tecnológico. Instituto de Ciencia y Tecnología Agrícolas ICTA. Km. 21.5 Carretera al Pacífico, Bárcenas, Villa Nueva, Guatemala, C.A. kponciano@hotmail.com; lacandeleon@yahoo.com Juan Pedro Lacán de León. Laboratorio de Biotecnología y Programa de Promoción y Apoyo Tecnológico. Instituto de Ciencia y Tecnología Agrícolas ICTA. Km. 21.5 Carretera al Pacífico, Bárcenas, Villa Nueva, Guatemala, C.A. kponciano@hotmail.com; lacandeleon@yahoo.com ]]>
1. Proyecto de investigación del Laboratorio de Biotecnología y el Programa de Promoción y Apoyo Tecnológico. Instituto de Ciencia y Tecnología Agrícolas ICTA. 2. Laboratorio de Biotecnología y Programa de Promoción y Apoyo Tecnológico. Instituto de Ciencia y Tecnología Agrícolas ICTA. Km. 21.5 Carretera al Pacífico, Bárcenas, Villa Nueva, Guatemala, C.A. kponciano@hotmail.com; lacandeleon@yahoo.com
Recibido: 28 de junio, 2011. Aceptado: 12 de marzo, 2012
