Actinomicetos mineralizadores de fosfato involucrados en la interacción radical de Glomus sp.-trébol blanco
Ruth Milena Gómez-Vargas2*, Diana Carolina Bello-Bello2, Luis Daniel Prada-Salcedo2, María Ximena Rodríguez-Bocanegra2, Luis David Gómez-Méndez2, Marcela Franco-Correa2
Actinomicetos mineralizadores de fosfato involucrados en la interacción radical de Glomus sp. - trébol blanco. El objetivo de este trabajo fue determinar la capacidad de los actinomicetos para mineralizar fósforo orgánico y su interacción rizosférica con micorrizas en Trifolium repens L. (trébol blanco). En enero de 2009, en el laboratorio de la Unidad de Investigaciones Agropecuarias (UNIDIA) de la Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Colombia, se cuantificó la actividad fosfatasa de Streptomyces sp. (cepa MCR9), Streptomyces sp. (cepa MCR26) y Thermobifida sp. (cepa MCR24) con la técnica del p-nitrofenil fosfato. Thermobifida sp. (cepa MCR24) presentó la menor actividad. La inoculación de solo actinomicetos presentó valores mayores de fósforo inorgánico en suelo, mientras que la concentración de fósforo a nivel foliar fue mayor cuando había co-inoculación actinomiceto-Glomus sp., a excepción de la cepa Thermobifida sp. (cepa MCR24). La co-inoculación con los actinomicetos y Glomus sp. estimuló la producción de biomasa y el porcentaje de colonización. Se determinó la capacidad para mineralizar fósforo orgánico por los actinomicetos al asociarse con Glomus sp. de forma sinérgica y benéfica tanto para la planta como para la micorriza. Se realizó el análisis de la varianza y prueba de “t” ALS (P<0,05) para comparar los promedios entre los tratamientos. Se determinó el grado de relación entre el porcentaje de micorrización y el peso seco de las plantas mediante “r” Coeficiente de Correlación, donde las plantas con los microorganismos presentaron una micorrización mayor del 70%.
Phosphate-mineralizing Actinomycetes involved in root interaction of Glomus sp.- white clover. The objective of this work was to determine the capacity of actinomicetes for organic phosphorus mineralization and their rhyzospere interaction with mycorrhiza of Trifolium repens L. (white clover). In January 2009, at the laboratory of the Unidad de Investigaciones Agropecuarias (UNIDIA) of the Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Colombia, the phosphatase activity of Streptomyces sp. (strain MCR9), Streptomyces sp. (strain MCR26) and Thermobifida sp. (strain MCR24) were determined using the p-nitrofenil phosphate technique. Thermobifida sp. (strain MCR24) showed the lowest activity. Inoculation of actinomycetes alone resulted in higher values of inorganic soil P, while leaf P content was higher when co-inoculation of actinomycete-Glomus sp. occurred, with the exception of the strain Thermobifida sp. (strain MCR24). Co- inoculation with actynomicetes and Glomus sp. stimulated biomass production and colonization percent. Actynomicetes are sinergistic with Glomus sp., resulting in benefits for the plant and the mycorrhiza. Analysis of variance and “t” tests ALS (P<0,05) were conducted to compare the treatments. The relation between the degree of mycorrhization plant dry weight was determined by the “r” correlation coefficient, and plants associated with microorganisms was higher than 70%.
El fósforo (P) constituye cerca del 0,2% del peso seco de las plantas (Huss-Danell 1997). Las formas inorgánicas son complejos minerales insolubles, por la reacción del fósforo con iones calcio, hierro y aluminio. La materia orgánica también es una reserva de fósforo inmovilizado que constituye entre 20-80% del fósforo del suelo (Whitelaw 2000, Gyaneshwar et al. 2002). En el suelo el 80% se encuentra inmovilizado y no disponible debido a la adsorción, precipitación o conversión a la forma orgánica (Holford 1997). Es por esto que se considera al fósforo como el segundo nutriente limitante en los cultivos vegetales después del nitrógeno (Arcand y Schneider 2006). Uno de los mecanismos utilizados por los microorganismos para solubilizar el fósforo inorgánico, es la disminución del pH del medio que los rodea por secreción de ácidos orgánicos (Chen et al. 2006) y la exudación de sustancias quelantes (como sideróforos) (Welch et al. 2002).
La liberación de fósforo a partir de la materia orgánica por medio de las fosfatasas puede llegar a ser una importante fuente de fósforo disponible. La mineralización de este se realiza por medio de fosfatasas, bien sea ácidas o alcalinas (Turner y Haygarth 2005, El-Tarabily et al. 2008). Muchos microorganismos dejan disponible el fósforo mediante mineralización y/o solubilización. Hay diversas bacterias, como los actinomicetos, y géneros fúngicos (Rudresh et al. 2005, Oliveira et al. 2008) como las micorrizas arbusculares que incrementan la captación de fósforo por parte de la planta (Ouahmane et al. 2007).
Este interés de utilizar tanto micorrizas como rizobacterias para incrementar la cantidad de fósforo disponible para las plantas (Ayyadurai et al. 2006, Son et al. 2006), asociado a los estudios de Franco-Correa et al. (2010), que demostraron la interacción benéfica entre actinomicetos y micorrizas; así como los pocos estudios sobre los mecanismos involucrados en la mineralización del fósforo por los actinomicetos (El- Tarabily et al. 2008).
La presente investigación tuvo como objetivo determinar la capacidad de los actinomicetos para mineralizar fósforo orgánico y su interacción rizosférica con micorrizas en Trifolium repens L. (trébol blanco). Materiales y métodos
El trabajo experimental se ]]>
Cepas microbianas utilizadas
Las tres cepas de ]]>
Cuantificación de la mineralización de fosfatos
Se utilizó la técnica de p-nitrofenil fosfato en cultivos ]]>
Se detuvo ]]>
Bioensayos
Elaboración del semillero y diseño experimental. Las semillas de trébol carretón blanco gigante - Agropaz (T. repens L.) fueron desinfectadas en hipoclorito de sodio (0,5%), durante quince minutos, a 50 rpm. Se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril, y se hidrataron en agua destilada estéril ]]>
Preparación de inóculos e inoculación de plántulas con cepas de actinomicetos y Glomus sp. Las cepas MCR9 sp, MCR24 sp. y MCR26 sp., fueron cultivadas en erlenmeyer con 120 ml de caldo ISP2 (Hamdali et al. 2008a). Evaluaciones previas, determinaron que los tratamientos con actinomiceto únicamente, fueron inoculados con 2 ml del cultivo en caldo ISP2, mientras que los tratamientos con actinomiceto + Glomus sp., fueron inoculados con 1 ml del cultivo en caldo ISP2; en ambos casos se adicionó una ]]>
Evaluación de la colonización de las cepas de actinomicetos. Aleatoriamente, se tomaron muestras de rizosfera de las plántulas de los materos de un tratamiento específico, obteniendo una submuestra. Se pesó 1 g y se realizaron diluciones seriadas en base 10 hasta 10-4, en solución salina (0,1%). De las diluciones 10-2, 10-3 y 10-4 se tomó 0,1 ml y se sembró (por triplicado) en superficie, en agar avena con nistatina al 0,1%. Se incubó a 25ºC durante ocho ]]>
Evaluación de la colonización con Glomus sp. Se realizó el aislamiento de esporas de Glomus sp. por tamizado y decantación según Genderman y Nicolson (1963) modificada por Sieverding (1991), donde se pesaron 25 g de sustrato, los cuales fueron mezclados vigorosamente con el agua y centrifugados a 2500 rpm durante 2 min. El sobrenadante conteniendo restos orgánicos fue descartado y a continuación se adicionó una solución de sacarosa al 50% (p/v), centrifugándolo a 2500 rpm durante 2 min. A continuación el sobrenadante fue vertido ]]>
Evaluaciones adicionales. Finalizados seis meses del bioensayo, se recolectó un total de doce plantas por tratamiento. El análisis parcial de elementos disponibles en suelo y el análisis del contenido de elementos a nivel foliar, se llevaron ]]>
Análisis estadístico
Se utilizó el programa estadístico SAS (2009) y la verificación de resultados en SPSS-v.15.0. Se realizó una prueba de ANOVA y rango múltiple de Duncan para analizar los resultados de mineralización de fósforo, peso seco, longitud de raíz micorrizada y muestreos. Se realizó un ]]>
Resultados y discusión
Mineralización de fosfatos mediante la detección de fosfomonoesterasas
Mediante la prueba de ANOVA empleada para analizar la actividad ]]>
Figura 1), se observó una solubilización inferior, con diferencias estadísticamente significativas (p<0,05). Este es un resultado esperado porque las cepas no pertenecen al mismo grupo bacteriano, es así que se ]]>
Adicionalmente, no observaron diferencias significativas entre las actividades de las cepas Streptomyces sp. MCR9 y MCR26 según Duncan, lo cual demuestra que tienen una actividad mineralizadora de fosfato similar, mientras que la cepa Thermobifida sp. (cepa MCR24) presenta una actividad significativamente inferior a la de éstas (Figura 1b). Se observaron diferencias significativas en la actividad fósforo, siendo un aporte significativo de este trabajo. Según Barreto et al. (2008) los actinomicetos son un grupo de procariotes conocidos por intervenir en el ciclaje de nutrientes del suelo, de ahí que presenten la actividad de solubilización del fósforo inorgánico.
Bioensayos
Evaluación de la colonización de las cepas de actinomicetos. Se encontró que las tres cepas de actinomicetos, en cada uno de los dos muestreos analizados, lograron colonizar el suelo no estéril, sin presentar diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos (p>0,05). Sin embargo, se observó un incremento con diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) en el Log UFC/ml, a medida que transcurría el tiempo del ensayo, ya que los valores de las medias en el primer muestreo (cuatro meses) fueron menores que los obtenidos en el segundo muestreo (seis meses) (Cuadro 1). Los resultados de este último, permitieron evidenciar que en el caso de Thermobifida sp. (cepa MCR24) se obtuvo un leve incremento en el valor de la media de Log UFC/ml cuando fue inoculada con Glomus sp, en comparación con solo la cepa de actinomiceto, mientras que en el caso de las cepas de Streptomyces sp. no se observó este efecto, demostrando que el nivel de colonización en MCR26 y MCR9 no se vio influido al estar o no en compañía del inóculo micorrícico (Cuadro 1).
Se encontró que las cepas MCR9, MCR24 y MCR26 fueron capaces de colonizar el suelo rizosférico de las plántulas de trébol blanco. Esta colonización rizosférica se ve influenciada por el efecto rizosférico que la planta le brinda al ambiente donde se están desarrollando, permitiendo que crezcan y se desarrollen (Harvey et al. 2002).
Evaluación de la colonización con Glomus sp. A los seis meses del ensayo se observaron las raíces con zonas de colonización micorrícica, logrando demostrar que Glomus sp. se establece en el suelo y lleva a cabo su asociación con las raíces de trébol. Lo anterior indica que la germinación de las esporas y el crecimiento de las micorrizas arbusculares no se afecta por la presencia de los actinomicetos. Estos datos confirman lo publicado por Franco-Correa et al. (2010), quien determinaron que algunas cepas de actinomicetos pueden retrazar la germinación de la espora del hongo micorríco, pero que no afectan el proceso de colonización ni la fisiología de la planta.
Evaluaciones adicionales. pH. Se observó que el suelo inoculado con la cepa MCR24 presentó el valor de pH más ácido, seguido por los otros tratamientos inoculados que presentaron valores similares a excepción de la cepa MCR9 (Cuadro 2). Los cambios en el pH son producto de la actividad microbiana en el suelo, pues el valor del testigo no presentó disminución. Se observó que el pH del suelo con los tratamientos fue óptimo para el desarrollo de los actinomicetos al permitir su establecimiento, debido a que crecen en un rango de pH entre 5-9 (Shrivastava et al. 2008).
Fósforo disponible en suelo. Para todos los tratamientos las concentraciones de fósforo fueron bajas (Figura 2). Por otra parte, es evidente que el suelo control tiene un valor muy bajo de anión fosfato, con respecto a los otros tratamientos, incluso cuando se compara con el testigo, donde se encontró un valor más alto en el contenido de fósforo en suelo (Cuadro 3), lo cual puede ser resultado del metabolismo de la microflora nativa de este suelo (Kortemaa et al. 1994). Los otros tratamientos registraron valores con diferencias bajas, sin embargo es importante destacar que tratamientos con actinomicetos solos, permitieron la obtención de un nivel más alto de fósforo en el suelo, pero disminuido con la inoculación en conjunto con la micorriza. Pese a esto, al comparar los tratamientos, el efecto menos marcado se presenta en el caso de la cepa MCR9, donde la disminución de fósforo disponible no es tan excesiva cuando se encuentra acompañada de la micorriza. Es así que los datos de la estadística descriptiva (Figura 2) muestran que el valor más alto corresponde al tratamiento con la cepa MCR9. ]]>
Al correlacionar la actividad enzimática in vitro con los ]]>
La segunda ]]>
La actividad no puede ser atribuida ]]>
De acuerdo a las concentraciones de fósforo foliar y a la evaluación estadística descriptiva (Figura 2), se ]]>
La co-inoculación de las cepas MCR26 y MCR9, con Glomus sp., permitió obtener un incremento en los valores del contenido de ]]>
Figura 2). La co-inoculación de la cepa MCR24 con Glomus sp. mostró disminución en la concentración de fósforo foliar en relación con la obtenida por estos dos microorganismos solos. Datos que concuerdan con los obtenidos en suelo.
Biomasa foliar y radical de las plántulas de trébol. Se observa un aumento en los valores de peso seco con diferencias significativas en los tratamientos con actinomicetos co-inoculados con Glomus sp., dándose un incremento evidente al pasar el tiempo, en la biomasa al sexto mes (Cuadro 3). Este aumento se puede explicar por interacciones sinérgicas que estos microorganismos pueden realizar. En el caso de los actinomicetos se ha encontrado que el peso seco de los guisantes es más alto en los tratamientos en los cuales se inocula Streptomyces lydicus (Tokala et al. 2002). Hamby y ]]>
]]>
Longitud de la raíz micorrizada. Se encontraron diferencias significativas (Cuadro 3) entre los tratamientos con Glomus sp. y los que no lo tenían, pues los primeros presentan un porcentaje mayor de colonización que aquellos que no la contienen. Análogamente, en la asociación entre actinomiceto y micorriza, se observa un beneficio en el crecimiento en la raíz micorrizada. A los seis meses, el efecto más evidente se da con ]]>
Con relación a la capacidad que tienen los actinomicetos y Glomus sp. para promover el crecimiento vegetal, al ser inoculados de forma individual, es importante señalar que no se encontraron estudios en los cuales se analizara la co-inoculación de estos ]]>
En relación ]]>
]]>
Literatura citada
Arcand, MM; Schneider, KD. 2006. Plant and microbial- based mechanisms to improve the agronomic effectiveness of phosphate rock: a review. Ann. Acad. Bras. Scienc. 78:791-807. [ Links ]
Ayyadurai, N; Ravindra, NP; Sreehari, RM; Sunish, KR; Samrat, SK; Manohar, M; Sakthivel, N. 2006. Isolation and characterization of a novel banana rhizosphere bacterium as fungal antagonist and microbial adjuvant in micropropagation of banana. J. Appl. Microbiol. 100:926-937. [ Links ]
Barreto, T; Da-Silva, AC; Soares, AC; De Souza, JT. 2008. Population densities and genetic diversity of actinomycetes associated to the rizosphere of Theobroma cacao. Brazilian J. Microbiol. 39:464-470. [ Links ]
Chen, YP; Rekha, PD; Arun, AB; Shen, FT.; Lai, WA; Young, CC. 2006. Phosphate solubilizing bacteria from subtropical soil and their tricalcium phosphate solubilizing abilities. Appl. Soil Ecol. 34:33-41. [ Links ]
El-Tarabily, K; Nassar, A; Sivasithamparam, K. 2008. Promotion of growth of bean (Phaseolus vulgaris L.) in a calcareous soil by a phosphate-solubilizing, rhizosphere-competent isolate of Micromonospora endolithica. Appl. Soil Ecol. 39:161-171. [ Links ]
Franco-Correa, M. 2008. Evaluación de caracteres PGPR en actinomicetos e interacciones de estas rizobacterias con hongos formadores de micorrizas. Tesis Doctoral, Doctorado en Biología Agraria, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada, Granada–España. 260 p. [ Links ]
Franco-Correa, M; Quintana, A; Duque, C; Suarez, C; Rodriguez, MX; Barea, JM. 2010. Evaluation of actinomycete strains for key traits related with plant growth promotion and mycorhiza helping activities. Appl. Soil Ecol., doi:10.1016/j.apsoil.2010.04.007. [ Links ]
Giovannetti, M; Mosse, B. 1980. An evaluation of techniques for measuring vesicular-arbuscular mycorrhizal infection in roots. New Phytologist 84:489-499. [ Links ]
Gyaneshwar, P; Kumar, GN; Parekh, LJ; Poole, PS. 2002. Role of soil microorganisms in improving P nutrition of plants. Plant Soil. 245:83-93. [ Links ]
Hamby, MK; Crawford, DL. 2000. The enhancement of plant growth by selected Streptomyces species. American Society for Microbiology, 100th General Meeting, Los Angeles, CA. Abstracts:567. [ Links ]
Hamdali, H; Bouizgarne, B; Hafidi, M; Lebrihi, A; Virolle, MJ; Ouhdouch, Y. 2008a. Screening for rock phosphate solubilizing Actimomycetes from Moroccan phosphate mines. Appl. Soil Ecol. 38:12-19. [ Links ]
Hamdali, H; Mohamed, H; Joelle, VM; Yedir, O. 2008b. Growth promotion and protection against damping-off of wheat by two rock phosphate solubilizing Actinomicetes in a P-deficient soil under greenhouse conditions. Appl. Ecol. 40:510-517. [ Links ]
Harrison, MJ. 1999. Molecular and cellular aspects of arbuscular mycorrhizal symbiosis. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol Biol. 50:361-89. [ Links ]
Holford, IC. 1997. Soil phosphorus: its measurement, and its uptake by plants. Aust. J. Soil Res. 35:227-239. [ Links ]
Huss-Danell, K. 1997. Actinorhizal symbioses and their N2 fixation. New Phytol. 136:375-405. [ Links ]
Katznelson, H; Peterson, EA; Rouatt, JW. 1962. Phosphate dissolving microorganisms on seed and in the root zone of plants. Can. J. Bot. 40:1181-1186. [ Links ]
Morton, JB; Redecker D. 2001. Two new families of Glomales, Archaeosporaceae and Paraglomaceae, with two new genera Archaeospora and Paraglomus, based on concordant molecular and morphological characters. Mycologia 93:181-195. [ Links ]
Oliveria, CA; Alves, VM; Marriel, IE; Gomes, EA; Scotti, MR; Carneiro, NP; Guimaraes, CT; Schaffert, RE; Sa, NM. 2008. Phosphate solubilizing microorganisms isolated from rhizosphere of maize cultivated in an oxisol of the Brazilian Cerrado Biome. Soil Biol. Biochem. 41:1782–1787. [ Links ]
Ouahmane, L; Thioulouse, J; Hafidi, M; Prin, Y.; Ducousso, M; Galiana, A; Plenchette, C; Kisa, M; Duponnois, R. 2007. Soil functional diversity and P solubilization from rock phosphate after inoculation with native or allochtonous arbuscular mycorrhizal fungi. Forest Ecol. Manag. 241:200-208. [ Links ]
Pikovskaya, RI. 1948. Mobilization of phosphorus in soil connection with the vital activity of some microbial species. Microbiologiya 17:362-370. [ Links ]
Phillips, J; Hayman, D. 1970. Improve procedure of clearing roots and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection. Trans. Brit. Mycol. Soc. 55:159-161. [ Links ]
Reyes, I; Valery, A; Valduz, Z. 2006. Phosphate-solubilizing microorganisms isolated from rhizospheric and bulk soils of colonizer plants at an abandoned rock phosphate mine. Plant Soil 287:69-75. [ Links ]
Rudresh, DL; Shivaprakash, MK; Prasad, RD. 2005. Tricalcium phosphate solubilizing abilities of Trichoderma sp. in relation of P uptake and growth and yield parameters of chickpea (Cicer arietinum L.). Can. J. Microbiol. 51:217-222. [ Links ]
Sabannavar, SJ; Lakshman, HC. 2009. Effect of rock phosphate solubilization using mycorrhizal fungi and phosphobacteria on two high yielding varieties of Sesamum indicum L. World J. Agric. Sci. 5:470-479. [ Links ]
SAS (Statistical Analysis System)/GIS. 2009. An interactive desktop Geographic Information System for mapping applications. [ Links ]
SAS/GRAPH. 2009. Although base SAS includes primitive graphing capabilities, SAS/GRAPH is needed for charting on graphical media. [ Links ]
Shrivastava, S; D’souza, FD; Desai, PD. 2008. Production of índole-3-acetic acid bye immobilized actinomycete (Kitasatospora sp.) for soil applications. Curr. Sci. 94(12):1595-1604. [ Links ]
Sieverding, E. 1991. Vesicular-Arbuscular mycorrhiza management in tropical agrosystems GTZ. Eschborn. Germany. 371 p. [ Links ]
Son, HJ; Park, GT; Cha, MS; Heo, MS. 2006. Solubilization of insoluble inorganic phosphates by a novel salt-and pH-tolerant Pantoea agglomerans R-42 isolated from soybean rhizosphere. Bioresour. Technol. 97:204-210. [ Links ]
Tabatabai, MA; Bremner, JM. 1969. Use of p-nitrophenyl phosphate for assay of soil phosphatase activity. Soil Biol. Biochem. 1(4):301-307. [ Links ]
Tokala, RK; Strap, JL; Jung, CM; Crawford, DL; Salove, MH; Deobald, LA; Bailey, JF; Morra, MJ. 2002. No- vel Plant-Microbe Rhizosphere Interaction Involving Streptomyces lydicus WYEC108 and the Pea Plant (Pisum sativum). Appli. Environ. Microbiol. 68(5): 2161-2171. [ Links ]
Trouvelot, A; Kough, JL; Gianinazzi-Pearson, V. 1986. Mesure du taux de mycorrhization VA d’un système radiculaire. Recherche de methods d’estimation ayant une signification fonctionelle. In ‘Physiological and genetical aspects of mycorrhizae’. Gianinazzi-Pearson V and Gianinazzi S eds., INRA, Paris. 101-109. [ Links ]
Turner, B; Haygarth, P. 2005. Phosphatase activity in temperate pasture soils: Potential regulation of labile organic phosphorus turnover by phosphodiesterase activity. Sci. Total Environ. 344:27-36. [ Links ]
Vivas, A; Voros, A; Biró, B; Barea, JM; Ruíz-Lozano, JM; Azcón, R. 2003. Benefical effects of indigenous Cd-tolerant and Cd-sensitive Glomus mosseae associated with a Cd-adapted strain of Brevibacillus sp. in improving plant tolerante to Cd contamination. Appl. Soil Ecol. 14:177-186. [ Links ]
Welch, SA; Taunton, AE; Banfield, JF. 2002. Effect of microorganisms and microbial metabolites on apatite dissolution. Geomicrobiol. J. 19:343-367. [ Links ]
Whitelaw, M. 2000. Growth promotion of plants inoculated with phosphate solubilizing fungi. Adv. Agron. 69: 99-144. [ Links ]
*Correspondencia a: Ruth Milena Gómez-Vargas, Diana Carolina Bello-Bello, Luis Daniel Prada-Salcedo, María Ximena Rodríguez-Bocanegra, Luis David Gómez-Méndez & Marcela Franco-Correa: Unidad de Investigaciones Agropecuaria (UNIDIA), Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá, Colombia. Proyecto de Investigación financiado por la Vicerrectoría Académica de la Pontificia Universidad Javeriana. hoja_verde@hotmail.com; carolina.bello_@hotmail.com; luisd09@hotmail.com; mxrodriguez@javeriana.edu.co; luis.gomez@javeriana.edu.co Autor de correspondencia: franco@javeriana.edu.co. Cra. 7 No. 43 – 82. Departamento de Microbiología. Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana.
