Dagoberto Durán-Hernández², Germán Fernando Gutiérrez-Hernández², José Luis Arellano-Vázquez³, Elpidio García-Ramírez⁴, Juan Virgen-Vargas³

1 Parte de la Tesis de Doctorado en Ciencias del primer autor.
2 Sección de Estudios de Posgrado e Investigación (SEPI) y Departamento de Bioprocesos, Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología (UPIBI), Instituto Politécnico Nacional (IPN). Av. Acueducto s/n. C. P. 07340, La Laguna Ticoman. México, D. F. Tel. (01-55) 5729-6000, ext. 56395. duranhd78@yahoo.com.mx; enredipn@yahoo.com.mx (autor para correspondencia).
3 Programa de Maíz, Campo Experimental Valle de México (CEVAMEX), Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP). Apartado Postal 10. 56230, Chapingo, México. arevajolu@yahoo.com.mx
4 Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Av. Universidad y Copilco, Ciudad Universitaria. C. P. 04510, México, D. F. elpidio@servidor.unam.mx

Dirección para correspondencia

Caracterización molecular y germinación de semillas de maíces criollos azules con envejecimiento acelerado. El objetivo del presente estudio fue determinar el efecto del envejecimiento acelerado en semillas de variedades criollas de maíz azul. En los laboratorios de la Universidad Nacional Autónoma de México y del Instituto Politécnico Nacional, semillas de cuatro variedades criollas de maíz azul (Cuijingo, Cocotitlán, Puebla y Oaxaca), se sometieron a dos tipos de envejecimie nto acelerado: calor húmedo (41°C, 72 horas y 100% h. r.) y calor seco (60°C, 48 horas). Se evaluaron: protrusión radicular de 0 a 72 horas de imbibición y, a los siete días de incubación a 25°C, plántulas normales, anormales y semillas muertas. Se obtuvo la caracterización molecular de los tratamientos mediante la RAPD y se construyeron los dendogramas respectivos. En plántulas normales provenientes de semillas sin envejecimiento acelerado, las variedades Oaxaca y Puebla fueron significativamente superiores. El peso seco en las plántulas disminuyó con el deterioro, siendo exigua con calor seco. La presencia de plántulas anormales se incrementó con ambos tipos de deterioro en el orden: Oaxaca, Puebla, Cocotitlán y Cuijingo. La diferenciación de los perfiles de bandeo entre semillas testigo y deterioradas ocurrió con la secuencia: Oaxaca (31,6%), Cocotitlán (25,8%), Puebla (19,6%) y Cuijingo (18,6%). Estos valores de similitud, a los cuales se ramificaron los perfiles genómicos, se asociaron de manera inversa con el nivel de vigor de las semillas, y directamente con la presencia de anormalidades en las plántulas obtenidas.

Palabras clave: Zea mays, viabilidad seminal, huella genómica, RAPDs.

Abstract

Molecular characterization and seed germination of blue corn landraces with accelerated aging. The objective of this work was to determine the effect of accelerated aging on seeds of blue corn landraces. The study was conducted in the laboratorie s of National Polytechnic Institute and National University of México. See ds of four blue corn landraces (Cuijingo, Cocotitlán, Puebla and Oaxaca), were subjected to accelerated aging treatments: humid heat (HH, 41°C, 72 h, and 100% r. h.), and dry heat (DH, 60°C, 48 h. The parameters measured were: radicle protrusion (RP) in at 0 to 72 h of imbibition, and after seven days of incubation at 25°C, normal seedlings (NS), abnormal seedlings (AS), and dead seeds (DS) were counted. The molecular characterization by RAPD was also performed and the respective dendrograms were constructed. In normal seedlings obtained from seeds without accelerated ageing, the varieties Oaxaca and Puebla were significantly superior. Seedling dry weight diminished with deterioration, being minimum under dry heat. The number of abnormal seedlings increased under both deterioration treatments, in the order Oaxaca, Puebla, Cocotitlán and Cuijingo. Differentiation of the band profiles among control and deteriorated seeds occurred in the sequence: Oaxaca (31,6%), Cocotitlán (25,8%), Puebla (19,6%) and Cuijingo (18,6%). These similarity values were inversely related to seed vigour, and irectly related to the presence of abnormalities in seedlings.

Key words: Zea mays, seed viability, genomic finger printing, RAPDs.

Introducción

En México se preserva actualmente el cultivo de maíces criollos porque satisfacen necesidades específicas de la población por su adaptación, sabor o color. Además, constituyen la base para la actividad agrícola tradicional y son una fuente de variabilidad para el fitomejoramiento de este primordial cultivo, de modo que es prioritario su conocimiento (Hernández y Esquivel 2004).

En los Valles Altos Centrales de México (Puebla, Tlaxcala, México e Hidalgo) se cultivan alrededor de 1,5 millones de hectáreas de maíz, de las cuales el 85% es de temporal y el 35% de los productores siembra maíz criollo pigmentado (azul principalmente), del que se estima una cosecha anual de 300 mil toneladas (Antonio et al. 2004). Los distintos colores del maíz pigmentado (negro, morado, azul o rojo) se atribuyen a la presencia de antocianinas en la capa de aleurona y/o en el pericarpio de la semilla (Salinas et al. 1999). En particular, la antocianina azul se encuentra en la capa de aleurona (Beltrán et al. 2001). Las antocianinas se derivan de la cianidina y la pelargonidina, los cuales son compuestos fenólicos del grupo de los flavonoides (Harborne y Gavazzi 1969). Son cromóforos solubles en agua y están relacionados con la reducción de colesterol y triglicéridos en el torrente sanguíneo humano, por lo que se recomienda su ingesta para prevenir o tratar afecciones cardiacas.

De las antocianinas del maíz se obtienen colorantes de vinos, mermeladas y jugos de fruta (Maltros et al. 1999). Los flavonoides también presentes en el maíz azul son antioxidantes (Dickerson 1990). Además, el maíz azul con endospermo harinoso contiene mayor contenido de proteínas, minerales y aminoácidos esenciales que el blanco o amarillo (Dickerson 1990). El maíz azul posee un exótico y atractivo color, lo cual se suma a su mejor sabor (Antonio et al. 2004), y por estos atributos sensoriales se ha elevado su demanda en el mercado y alcanza mejores precios que el maíz amarillo o incluso blanco (Durán 2008).

Por lo anterior, en el presente estudio se analizó la existencia de variación genética para longevidad de semilla en maíces criollos azules, se utilizó el sistema de envejecimiento artificial o acelerado (Fragoso et al. 2006), en el cual se emplean calor y/o humedad para inducir daños similares a los ocurridos en las semillas durante su almacenamiento.

Son diversas las alteraciones causadas por el envejecimiento, considerándose entre las principales a las ocurridas en la estructura y funcionalidad del AND (McDonald 1999), las cuales eventualmente pueden ser reparadas durante la imbibición seminal (Elder y Osborne 1993) con una eficiencia dependiente del genotipo y de la intensidad de los daños (Gutiérrez et al. 1993). Fisiológicamente estas anomalías se expresan en germinación lenta, plántulas malformadas, escasez de biomasa y pérdida de vigor.

Por otra parte, la identificación de las variedades de cultivo tradicionalmente se ha basado en aspectos morfológicos (Zhang et al. 1996), los cuales en su mayoría son caracteres continuos, lo cual significa que están presentes en todas las variedades sólo que fluctúa su nivel de expresión, mismo que es afectado por el ambiente (Cooke 1999). Estudios señalan las limitaciones intrínsecas de las metodologías convencionales de caracterización varietal (Gutiérrez et al. 2009). También se ha señalado que las técnicas moleculares de identificación genotípica no interaccionan con el ambiente, reconocen directamente las diferencias genéticas entre individuos a nivel del ADN y se obtiene un perfil genómico específico para cada variedad (Morell et al. 1995, Zhang et al. 1996, Marcos-Filho y McDonald 1998).

En este trabajo también se abordó la caracterización molecular de los maíces azules y se empleó la amplificación aleatoria del ADN polimórfico (RAPD, en inglés), la cual ha sido documentada como un procedimiento confiable para la determinación de la identidad genética de las especies de cultivo (McDonald et al. 1994), y en particular para maíz (Zúñiga 2007, Durán 2008, Gutiérrez et al. 2009).

La metodología de la RAPD fue propuesta por Williams et al. (1990), quienes sugieren utilizar iniciadores de diez nucleótidos de longitud y con una composición de guanina y citosina mayor del 50%, los cuales se alinean con el ADN genómico y se aparean las bases complementarias; mediante variaciones cíclicas de temperatura, se sintetizan bandas o amplicones de 200 a 2000 pb por la acción de una enzima ADN polimerasa termoestable (Williams et al. 1990, Klein- Lankhorst et al. 1991, McDonald et al. 1994).

Los fragmentos amplificados se despliegan según su peso molecular durante la electroforesis en agarosa o poliacrilamida, algunos de ellos pueden ser genotípicoespecíficos y por tanto útiles para determinar la identidad varietal (Zhang et al. 1996), así como para el fitomejoramiento asistido por marcadores moleculares.

Los polimorfismos entre genotipos se manifiestan por la presencia o ausencia de una o más bandas por lo que se consideran dominantes (Williams et al. 1990, Penner 1996), de manera que no es posible distinguir si se trata de un locus heterocigótico u homocigótico (Valadez y Kahl 1999).

Las bandas diferenciales entre genotipos se originan por el cambio de un par de bases, por rupturas y fragmentaciones estructurales, por deleciones que modifican o eliminan el sitio de inserción del iniciador, o por translocaciones que separan los sitios de acoplamiento del iniciador a una distancia mayor a 2500 nucleótidos, a la cual ya no hay amplificación (Xena 2000).

Las señaladas variaciones estructurales en el ADN ocurren durante la evolución de la especie o son causadas por el envejecimiento de las semillas, inclusive se ha reportado la existencia de segmentos del ADN con mayor susceptibilidad a la degradación (Marcos-Filho y McDonald 1998).

Materiales y métodos

El estudio aquí descrito se efectuó durante el 2008 en el Laboratorio de Biotecnología Molecular de la Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología (UPIBI) del Instituto Politécnico Nacional (IPN) y en la Facultad de Química de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM).

Se utilizaron semillas de cuatro variedades criollas de maíz con aleurona azul (Cuijingo, Cocotitlán, Puebla y Oaxaca), proporcionadas por el Programa de Maíz del Campo Experimental Valle de México perteneciente al Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, localizado en Chapingo, México.

Las semillas se sometieron a dos modalidades de envejecimiento artificial: calor húmedo (CH, 41°C y 100% h. r., 72 h) y calor seco (CS, 60°C, 48 h), para cada variedad se incluyó su correspondiente testigo (semillas recién cosechadas sin envejecimiento artificial), de modo que se generaron doce tratamientos.

Para determinar la protrusión radicular (PR), se colocaron las semillas con el embrión hacia abajo en cajas Petri con papel filtro y 10 ml de agua bidestilada, se incubaron a 25°C y cada 24 horas se hizo el conteo hasta que ya no ocurrie ron brotaciones (72 horas). El criterio para considerar que la radícula había protruido fue que tuviera una longitud mínima de 3 mm (Fragoso et al. 2006).

Se realizó la prueba de germinación normal o estándar (ISTA 1995). Las semillas se colocaron sobre toallas de papel húmedo las cuales se enrollaron y se colocaron verticalmente dentro de bolsas de plástico a 25 ± 4°C. A los siete días se evaluó el número de plántulas normales (PN), y anormales (PA) y la presencia de semillas muertas (SM). Además, se cuantificó el peso seco acumulado en la plúmula (PSP), la radícula (PSR) y el total (PST).

Se aisló el ADN de cada tratamiento (Dellaporta et al. 1983) a partir de 0,1 g de embriones de las semillas, los cuales previamente se lavaron dos veces con agua bidestilada y se secaron superficialmente con papel absorbente. Después se cuantificó el AND y se le determinó la calidad mediante electroforesis en agarosa (0,7% p/v) (CIMYT 2006).

Se emplearon diez iniciadores (Cuadro 1), la selección se hizo con base en las características de las bandas amplificadas, tales como nitidez y consistencia (Valadez y Kahl 1999).

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La amplificación (Cuadro 2) se llevó a cabo en un volumen final de 25 μl y los fragmentos producidos se separaron mediante electroforesis horizontal en gel de agarosa (1,2% p/v) y se tiñeron con bromuro de etidio (CIMYT 2006).

Se codificaron los fragmentos amplificados para cada iniciador, empleando el número uno para indicar la presencia de la banda y el cero para denotar su ausencia. Con su codificación se construyó la matriz base de datos, misma que constó de 63 filas y trece columnas, en correspondencia con las bandas obtenidas y los genotipos estudiados, esto es, los doce tratamientos bajo estudio más el ADN de levadura (Saccharomyces cerevisiae), utilizado como control negativo.

Los experimentos fisiológicos se manejaron con un diseño de bloques al azar con cuatro repeticiones de veinticinco semillas cada una. Se calcularon los errores estándar (n = 4) de protusión radicular, plántulas normales y anormales, semillas muertas y peso seco, y se muestran como barras en las figuras correspondientes (Reyes 1980).

Para construir los dendogramas se utilizó el programa NTSYSpc (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System, ver. 2.1) (Rohlf 2000), con los parámetros: distancia de Seuil = 0, confiabilidad del 95%, el estimador de distancias de Nei y Li, el método de agrupamiento del promedio y el coeficiente de similitud de Jaccard (Dubreuil et al. 2003).

Resultados y discusión

Análisis fisiológico

En las semillas sometidas a envejecimiento o deterioro artificial se advirtió una sensible reducción de la PR en relación a los controles respectivos, es decir, a semillas del mismo genotipo pero recién cosechadas, esta disminución fue mayor en el caso de CH (Figura 1). En PR, las variedades se desempeñaron de modo similar dentro de cada modalidad de deterioro (CH o CS); no obstante, en las evaluaciones hechas a tiempos más avanzados de germinación y que corresponden a la formación de plántulas (siete días de incubación), se expresaron ya diferencias genotípicas significativas entre ellas (Figuras 2, 3 y 4).

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Esto indicaría que aunque la brotación radicular es un suceso físico promovido por la rehidratación de los tejidos seminales (Bewley y Black 1994), se deriva de procesos previos como refuncionalización de membranas, síntesis de macromoléculas, división celular, etc. (Cruz et al. 1995), los cuales se dañaron a consecuencia del envejecimiento, y la expresión fisiológica de tales daños se manifestó hasta la formación de plántulas y con un evidente efecto genotípico.

Es interesante advertir que los daños infligidos por cada tipo de envejecimiento fueron distintos en el proceso fisiológico que afectaron, en el tiempo en que se expresaron y en la posibilidad de subsanarlos, ya que la mayor disminución de la PR con respecto a los testigos y la mayor proporción de PA, se produjeron en las semillas sometidas a CH, mientras que con CS, las variables de PN, PST y SM presentaron los efectos más adversos, y estas últimas son componentes fundamentales de la germinación por tratarse de las plantas potencialmente productivas, de la capacidad para crecer, desarrollarse y de la muerte celular, respectivamente.

A consecuencia de los tratamientos de envejecimiento, ocurrió una sensible reducción en la cantidad de las PN generadas en los tratamientos de deterioro con respecto a los controles (Figura 2), particularmente con calor seco en el cual sobresale Cocotitlán por mostrar significativamente la mayor tolerancia. Por otra parte, se incrementó la formación de PA (Figura 3) en todas la variedades, a excepción de Cocotitlán genotipo que denotó la mayor tolerancia al calor húmedo en esta medición.

Para ambos tipos de envejecimiento, las PA aumentaron en el orden: Oaxaca, Puebla, Cocotitlán y Cuijingo, mismo que correspondería a su aptitud genotípica decreciente para amortiguar los daños genómicos causados por el envejecimiento, de donde se deriva la longevidad seminal.

De igual modo, la acumulación de peso seco en las plántulas se redujo con el deterioro, siendo casi nula en calor seco (Figura 5). Destacó Oaxaca porque alcanzó el valor más alto entre las semillas control y no perdió esta cualidad con el deterioro (calor húmedo o calor seco), además mostró la mayor cantidad de biomasa tanto en vástago como en radícula; Cuijingo se desempeñó de manera semejante a Oaxaca en CH sólo que con valores inferiores, mientras que Cocotitlán y Puebla presentaron las menores cantidades. Pese a la escasa materia seca formada en calor seco, sobresalen Oaxaca y Cocotitlán por sus valores superiores, así como Cuijingo que soportó medianamente el CH pero no el calor seco.

Se detectaron un total de 63 bandas con longitudes de 370 a 2923 pb, de las cuales sólo dos fueron monomórficas. Los iniciadores E09, E14 y G15 fueron profusamente polimórficos, puesto que en conjunto mostraron el 51% de la variación total.

La matriz básica de datos consistió de 63 filas (total de bandas) y trece columnas (tratamientos y levadura), con base en ella se calcularon los dendogramas para los tratamientos (Figura 7). Cabe hacer notar que el ADN de levadura sólo mostró una similitud con el maíz del 8 al 11%, situación lógica dado que se trata de organismos filogenéticamente lejanos y precisamente por ello se empleó como control negativo para constatar la veracidad de los agrupamientos definidos, los cuales tuvieron coeficientes de correlación cofenética con la matriz básica de datos de 0,88 a 0,98, valores aceptables desde el punto de vista de su reproducibilidad (Gutiérrez et al. 2009).

La formación de conglomerados o grupos de similitud asumió dos niveles jerárquicos, correspondiendo el primero de ellos a la conjunción de los datos genómicos por variedad, y el segundo, a la ponderación intravarietal de las diferencias genómicas causadas por los tratamientos aplicados.

Así, la huella genómica resultó específica para cada variedad independientemente de la condición de las semillas y fue dentro de variedades donde los dendogramas evidenciaron las modificaciones que al nivel del ADN ocurrieron en los embriones durante el envejecimiento artificial. Es decir, los segmentos del ADN testigo, donde por homología de bases se alinearon los iniciadores y hubo amplificación, se alteraron en su estructura molecular a causa del deterioro impuesto (Xena 2000), por lo que fueron diferentes los perfiles genómicos entre uno y otro tipo de semillas (McDonald 1999).

Los perfiles de bandeo de semillas testigo y las sometidas a envejecimiento (calor húmedo y calor seco) fueron semejantes hasta un coeficiente de similitud específico para cada variedad: 31,6% para Oaxaca, 25,8% para Cocotitlán, 19,6% para Puebla y 18,6% para Cuijingo (Figura 7), a partir del cual los dendogramas se ramificaron y diversificaron los señalados perfiles. Lo anterior denota un efecto genotípico relacionado con la capacidad para amortiguar, tolerar o restaurar los daños infligidos por el envejecimiento artificial sobre el ADN, misma que tendría la mayor expresión en Oaxaca y le seguirían Cocotitlán, Puebla y Cuijingo, de acuerdo a sus coeficientes de similitud descendentes (Figura 7), situación que pudiera relacionarse con la existencia de segmentos de ADN con distinto grado de susceptibilidad al deterioro (Marcos-Filho y McDonald 1998).

La secuencia de tolerancia al envejecimiento (Oaxaca>Cocotitlán>Puebla>Cuijingo) detectada a nivel molecular, en varios casos se relacionó con la respuesta fisiológica de las semillas durante su germinación: a) La notoria capacidad de Oaxaca para preservar su ADN pese al envejecimiento, se asoció con un alto desempeño fisiológico, dado que también es la variedad de mayor vigor en semillas testigos y deterioradas (Figuras 2, 3 y 4); b) Cuijingo, genotipo en el cual se mantuvieron agrupadas las semillas testigo con las sometidas a calor húmedo (Figura 7) y cuyas diferencias fisiológicas en las variables plántulas normales, plántulas anormales y MST, aunque significativas estadísticamente, no fueron tan amplias como en las otras variedades (Figuras 2, 3 y 4); y c) La formación de PA (Figura 3) estuvo inversamente vinculada con la resistencia al envejecimiento por calor húmedo y calor seco.

Agradecimientos

Nuestro reconocimiento a las siguientes instituciones: Secretaría de Investigación y Posgrado del IPN, Programa de Estímulos al Desempeño de los Investigadores del IPN, Comisión de Operación y Fomento de Actividades Académicas del IPN, Facultad de Química de la UNAM y al Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias.

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Correspondencia a: Dagoberto Durán-Hernández & Germán Fernando Gutiérrez-Hernández. Sección de Estudios de Posgrado e Investigación (SEPI) y Departamento de Bioprocesos, Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología (UPIBI), Instituto Politécnico Nacional (IPN). Av. Acueducto s/n. C. P. 07340, La Laguna Ticoman. México, D. F. Tel. (01-55) 5729-6000, ext. 56395. duranhd78@yahoo.com.mx; enredipn@yahoo.com.mx (autor para correspondencia)
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Elpidio García-Ramírez. Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Av. Universidad y Copilco, Ciudad Universitaria. C. P. 04510, México, D. F. elpidio@servidor.unam.mx