Resumen
Introducción: El estudio se orientó a buscar trombofílias en pacientes jóvenes con infarto del miocardio tanto genéticas, como las de las proteínas anticoagulantes.
Material y Métodos: Las pruebas de laboratorio que se usaron para la medición del fibrinógeno fue el método de Clauss, para la proteína C y Antitrombina III (ATIII) se utilizó un método cromogénico, para la S un método coagulométrico y las pruebas genéticas por Reacción de Cadena Polimerasa (PCR). Se seleccionaron 51 pacientes jóvenes menores de 45 años con infarto agudo del miocardio y 43 pacientes sanos de grupo control de las mismas edades.
]]> Resultados: Se encontró un 85% de pacientes masculinos y 15% femeninos. Las variables que fueron factores de riesgo estadísticamente significativas fueron el sexo P = 0.0023 demostrando que por cada 4.19 hombres que sufren infarto existe una mujer.El índice de masa corporal fue significativamente mayor en los pacientes infartados con un valor de P = 0.002733 y existió asociación estadísticamente significativa con obstrucciones coronarias. La hipertensión también fue estadísticamente significativa valor de P = 0.00167. Para el nivel de colesterol total la media en los pacientes sanos fue de 166mg/dl contra 213mg/dl en los pacientes con infarto con un valor de P =0.000527mg/dl. Para el HDL colesterol el 78% de los pacientes infartados tenían niveles iguales o menores de 35mg/dl y existió asociación estadísticamente significativa con la presencia de obstrucciones coronarias. El nivel de triglicéridos mostró una asociación estadísticamente significativa con un valor de P = 0.000161 mg/dl. El 58 % de los pacientes infartados tenían un nivel elevado de LDL colesterol.
En el análisis de las proteínas anticoagulantes la población enferma tuvo niveles significativamente menores que el grupo control tanto para la proteína S y la C.
En el análisis de los cruces hay una asociación estadísticamente significativa entre la frecuencia alélica de la mutación de la enzima metiltetrahidrofolato reductasa y tener niveles menores de las proteínas C y S tanto en los pacientes enfermos como en los sanos que son homocigotas a la mutación. No hubo asociación estadísticamente significativa para el factor V Leyden y la variable 20210 de Protrombina.
Conclusión: En los pacientes menores de 45 años con Infarto del Miocardio existen claros marcadores de riesgo para enfermedad coronaria al compararlos con sujetos sanos de una edad similar.
Palabras claves
Trombosis, infarto, proteínas anticoagulantes y factores genéticos.
Summary
lntroduction: The study was orientated towards finding thrombophylia in young patients with genetic myocardium infarct as with anticoagulant proteins.
]]> Material and Methods: The lab Test used for the fibrinogen was the Clauss Method, for the C protein and ATIII a chromogenic method was used, for the S protein a coagulometrical method and for the genetic testing, PCR.Fifty one young patients were chosen (under 45 years of age) with acute myocardium infarct and 43 healthy patients in the control group in the same age range.
Results: An 85% of the patients were male and 15% female. The variable that was a statistically significant risk factor was the gender (P= 0.0023) showing that for every 4.19 men that suffer an infarct there is one woman.
The body mass index was substantially higher with infarcted patients (P=0.002733) which had a statistical significant association with coronary obstructions. Hypertension was also statistically significant (P = 0.00167). Mean value for total cholesterol was 166mg/dl in healthy patients versus 213mg/dl with infarcted patients (P = 0.000527mg/dl). A 78% of patients with infarct had HDL cholesterol levels of 35mg/dl or lower and showed a statistically significant association with coronary obstructions. Triglycerides levels also showed a statistically significant association (P= 0.0001 61 mg/dl). A 58% of patients with infarct showed high levels of LDL cholesterol. The analysis of anticoagulant proteins in the sick group resulted in lower levels of S and C versus the control group.
Analyzing the crosses, there is a statistically significant association between the allelic frequencies in the mutation of the MTHFR enzyme and having normal levels of C and S protein in the healthy as well as in the control group. There was no statistical significant association in the for the Leyden V factor and the 20210 prothrombin factor variable.
Key words
Thrombosis, infarct, anticoagulant proteins and genetic factors.
Introducción
Nuestro estudio comprende el análisis de las proteínas anticoagulantes, el fibrinógeno y factores genéticos como el factor V Leyden, la variante 20210 de Protrombina y la 677t metil-tetrahidrofolatoreductasa y los factores de riesgo clásicos en pacientes jóvenes con infarto del miocardio.
La regulación de la hemostasis y la trombosis es influenciada por diferentes factores, algunos ambientales o metabólicos y la respuesta del endotelio vascular es mediada por los genes, estos modulan la respuesta del endotelio a expresar una superficie trombofílica o trombogénica.
A la proteína C anticoagulante se le ha atribuido poderes antiinflamatorios y a la vez se ha descubierto una relación como cofactor el HDL colesterol el cual se une al complejo que forman la proteína S y la proteína C inactivando el factor V III y el V (2).
Existen diferentes grados de deficiencia de las proteínas anticoagulantes. Su forma de herencia es autosómica dominante, para los individuos heterocigotas existe una disminución en los niveles que oscila entre el 30 a 60 % menos de lo normal. La proteína C se origina en el cromosoma 2, la proteína S en el cromosoma 3 y son factores K dependientes (3).
Las deficiencias se manifiestan por la presencia de trombosis principalmente venosas (60%), pero se pueden dar fenómenos arteriales (4). La otra proteína anticoagulante es la Antitrombina IlI, actúa sobre la trombina, además inhibe las serinas porteasas de los factores IXa, Xa, Xla (5).
Es importante recordar que la función anticoagulante de la heparina se debe a su acción sobre la antitrombina III (6).
La importancia del mal funcionamiento de estas proteínas anticoagulantes estriba en que ponen al paciente en un estado trombofílico.
Se pueden tener también deficiencias en la función y cantidad de las proteínas anticoagulantes debido a elevación de la homocisteína en la sangre, las cuales mejoran al dar suplementos vitamínicos a base de ácido fálico, Piridoxina y vitamina B12 que son cofactores en el metabolismo de esta sustancia.
El fibrinógeno es un nuevo factor de riesgo coronario según la conclusión de los últimos estudios de seguimiento de pacientes sanos (22,23,24).
]]> Recientes avances en genética molecular por medio de la transcripción reversa de la reacción de cadena de polimerasa (PCR), están permitiendo la ampliación o fotocopia del DNA. Con está técnica se está tratando de desarrollar marcadores genéticos de enfermedades comunes e investigar sus complejas interacciones con los factores ambientales. Este entendimiento va a permitir desarrollar armas terapéuticas más específicas contra diferentes enfermedades, entre ellas el infarto del miocardio.El factor V Leyden es una mutación genética relacionada con la resistencia a la proteína C activada y tiene una incidencia global de 4 o 5 %, pero la incidencia es variable dependiendo del origen genético de la población, por ejemplo es importante para poblaciones europeas, pero es quizá menos importante para los americanos. Esta mutación se ha asociado a un incremento en el riesgo de trombosis venosa y de fenómenos trombóticos (7). El fenómeno conocido como resistencia a la proteína C activada fue descrito por Dahibacke 1993 (8). Luego un grupo de investigadores demostró que esta resistencia no era más que una mutación del factor V que provocaba un defecto de su función anticoagulante (9).
La otra mutación estudiada es la variante 20210, que es una mutación recientemente descubierta localizada en la región 3', no traslapada del gen de la protrombina. Se ha relacionado al un incremento en el riesgo de sufrir infarto del miocardio en aquellos pacientes que la tienen. Esta mutación provoca que los pacientes tengan niveles más elevados de protrombina. (Factor II de la coagulación). En dos estudios previos se demostró que la aparición de la mutación en mujeres jóvenes incrementaba el riesgo de infarto cuatro veces más que aquellas que no la tenían (10, 11).
Por último la determinación de la mutación de la enzima 677t metiltetrahidrofolato reductasa, la cual es responsable del aumento de la homocisteína en sangre en los pacientes homocigotos y en los heterocigotos que tienen deficiencia de los dos cofactores vitamínicos: B 12 y ácido fólico.
La moderada hiperhomocisteinemia es considerada como un factor de riesgo independiente para enfermedad coronaria sobre todo en edades tempranas (12). La homocisteína es un aminoácido sulfurado, producto intermedio del metabolismo de la metionina, aminoácido esencial de la dieta, el cual se encuentra en altas concentraciones en los cereales y algunas frutas. Frosst et. al. En 1.995 identificaron la sustitución de CaT en el nucleátido 677 convirtiendo una alanina a una valina residual. Se encontró que esta variante incrementaba el riesgo de enfermedad coronaria temprana, y existía un incremento en el riesgo de preeclamsia en las pacientes que lo portaban (13,14).
En Estados Unidos se había encontrado está variante desde 1.991 por Kangs et. Al., quienes concluyeron que esta mutación incrementaba el riesgo de enfermedad cardiovascular. Se ha encontrado la mutación en el 70 % de la población con enfermedad coronaria, contra un 5 % de la población control. Esta mutación es extremadamente común en la población de Norteamérica donde la frecuencia es del 35%, la incidencia en Venezuela es de un 11.3%, en Argentina tiene una incidencia del 12.6% y en Costa Rica en la población general es del 23 %, pero en el grupo indígena es de un 44.7 % y en el grupo de raza negra del 12.5 % (15).
En la variante 677t metiltetrahidrofolato reductasa está comprobado que la disminución de los niveles de ácido fálico y B 12 determinan la elevación de la homocisteína en la sangre y esto predispone a la aparición de diferentes eventos trombóticos (5,16).
Los mecanismos por los cuales la hiperhomocisteinemia produce enfermedad coronaria son los siguientes:
1- Inhibición de la polimerasa de la elastina y desintegración de la elástica interna.
2- Hiperplasia de las células musculares lisas y aumento del tejido conectivo extracélular.
]]> 3- Degradación del glicocálix vascular y de la membrana basal debido a una acumulación de los protein-glicosaminoglicanos.4- Activación de factores de coagulación.
5- Estimulación en la producción de tromboxanos B2 por las plaquetas.
6- Disminución en la producción de óxido nítrico y antiagregantes del endotelio.
7- Denudación de la capa endotelial.
8- Disminución de la funcionalidad de las proteínas C y S. (25)
Las proteínas anticoagulantes son 4, la proteína C, la S la antitrombina III y el sulfato de Heparán.
Objetivos Primarios:
]]> 1- Determinar diferentes factores de riesgo trombótico de origen genético en pacientes y controles menores de 45 años.2- Determinar los niveles de las proteínas anticoagulantes en pacientes y controles menores de 45 años.
3- Investigar los hallazgos más frecuentes de arteriografía coronarias en pacientes infartados menores de 45 años.
4- Determinar los factores de riesgo clásico como hipertensión, diabetes mellitus, niveles de colesterol, HDL- colesterol, LDL, triglicéridos e índice de masa corporal.
Materiales y Métodos
Se realizó un estudio prospectivo de pacientes que ingresaron con el diagnóstico de infarto del miocardio menores de 45 años desde enero de 1997 hasta octubre de 1999, admitidos en la Unidad Coronaria del Hospital San Juan de Dios, San José, Costa Rica.
Las pruebas de laboratorio se realizaron en el Centro de Investigación de Hemoglobinas Anormales y trastornos afines de la Universidad de Costa Rica, Facultad de Microbiología.
Las pruebas genéticas se realizaron en el ERNST-MORITZARNDT-UNIVERSITÄT GREIFSWALD, Medizinische Fakultät Institut für Humangenetik, Alemania.
En nuestro estudio escogimos una población de pacientes jóvenes menores de 45 años que sufrieron infarto y un grupo control de similar edad y analizamos los factores de riesgo clásico y los factores genéticos relacionados con trombosis.
]]> Se estudiaron 51 pacientes que sufrieron infarto del miocardio, que fueron referidos al Hospital San Juan de Dios durante 3 años, y se analizó una población de 43 personas sanas de la misma edad que se tomó como grupo control. Todos los pacientes estudiados firmaron una hoja de consentimiento donde accedían a participar en el estudio. A este grupo de pacientes se les analizaron los factores de riesgo clásico y las proteínas anticoagulantes y se estudiaron las mutaciones genéticas.Para los análisis de laboratorio la muestra sanguínea se tomó al ingresar el paciente al hospital y se excluyeron del estudio aquellos individuos que estaban recibiendo algún tipo de anticoagulante oral o que al momento del exámen estuvieran recibiendo heparina. Se excluyó también del estudio a los pacientes que no se les pudo realizar la arteriografía coronaria y a los que presentaban alguna enfermedad concomitante como síndrome nefrótico, portadores de hepatopatías, enfermedades autoinmunes, o procesos infecciosos concomitantes con el infarto.
Se les tomó una muestra de 10 ml de sangre la cual se distribuyó en tres tubos diferentes: uno de los tubos con 3.8% de citrato de sodio (9:1 vol.: vol.) otro con EDTA-K3 y uno sin anticoagulante a partir del cual se obtuvo suero.
Pruebas Hematológicas básicas
Se analizó el estado hematológico por medio de un hemograma completo en equipo automatizado Couter. Las prueba de coagulación básicas como son: el tiempo de protrombina (Neoplastine), Tiempo parcial de tromboplastina (CK Prest) y el fibrinógeno, método de Clauss (Fibriprest), se realizaron por los métodos convencionales, con las técnicas coagulométricas de la casa Stago.
Pruebas Especiales de Hemostasia
Determinación de los inhibidores naturales de la coagulación:
]]> a. Antitrombina III, se utilizó el método cromogénico, donde se evalúa la capacidad antitrombínica del plasma en presencia de un exceso de heparina. El plasma de estudio es diluido en tampón y se incuba la mezcla a 37°C, durante cierto tiempo.Luego de neutralizar la heparina, su cantidad remanente es catalizada por la liberación de p-nitroanilina del sustrato cromogénico, midiéndose fotométricamente a 405 nm, luego de detener la reacción por acidificación. Se utilizo la metodología propuesta por el reactivo, Stachrom ATIII, Stago y los valores de referencia son 80-120 % de actividad.
b. Proteína C, también se determinó su funcionalídad por el método cromogénico, (Stachrom Prot C, Stago). La proteína C es activada específicamente con un derivado del veneno del Agkistrodom c. Contortrix. La cantidad de enzima formada es medida por la actividad amidasica con el sustrato cromogénico CBS 42.46, la paranitroanilina liberada es leída a 405 nm, luego de la acidificación para detener la reacción. La intensidad del color es proporcional al nivel de proteína C presente en el plasma analizado. Los valores de referencia utilizados son de 70 a 130%.
c. La proteína S, se evaluó por el método coagulométrico, basado en la habilidad de la proteína S de actuar como cofactor de la proteína C activada.
La prolongación del tiempo de coagulación del factor Xa, en una etapa por la Proteína C, dependerá del contenido de este inhibidor en la muestra. Se utilizó la Proteína S, Staclot, Stago y los valores de referencia utilizados son de 70 - 140%.
Análisís genético - molecular
Aislamiento de ADN, se realizó según el método de precipitación con Na Cl descrito por Miller et. al. El cual consiste principalmente en la separación de leucocitos, por centrifugación, a partir de 10 ml de sangre total con EDTA, se resuspende en 5 ml de buffer SE, 250 ul de SDS al 20 %. Se incubaron toda la noche a 37°C. Luego de la proteólisis se le agregó 1.4 ml de NACL 6 M y se centrifugó a 2500g por una hora. Se precipitó el ADN a partir del sobrenadante con etanol absoluto y se resuspendió para su almacenamiento en buffer TE Ph 8.0.
]]>
La determinación de F.V Leyden, la mutación C677t de la MTHFR y el polimorfismo G202210 de la variante de la protrombina es determinada por PCR y seguido por las apropiadas enzimas de restricción como es descrito en la literatura. La ampliación de los fragmentos de ADN es realizada con una mezcla que contiene 200 ng de ADN, 50 pm de ADN, 50 pmol de cada primer específico, 1.5 dmmol/L de MgCI2, 0,8 mmol/L dNTPs y 1.5 u Taq polimeraza (Gibco BRL). Todas las reacciones de PCR son corridas en un sistema 2400 y 96000 de la casa Pekin Elmer, bajo condiciones de PCR descritas en la literatura.
Los productos de PCR se digieren con Mnl 1 para determinar el factor V Leyden, Hinfl para la determinación de la MTHFR y Hind III para determinar la variante de protrombina. Los patrones de genotipos son fotografiados después de la separación con agarosa al 3 % y teñidos con bromuro de Etidio. Al grupo de pacientes que sufrieron infarto del miocardio se les realizó arteriografía coronaria bajo técnica de Seidinger.
Para el análisis estadístico de la población se usaron las siguientes fórmulas estadísticas: odds ratio, Cornfield 95% confidence limits for OR, Chi Squares, Valor de la P, Correlación de Yates.
Resultados
Características de la población estudiada:
Se reclutaron 51 pacientes con infarto del miocardio, menores de 45 años y 43 controles sanos, de características similares, para un total de 94 pacientes de los cuales 27 eran femeninos y 67 masculinos. Se encontró en la variable del sexo una asociación de Odds ratio de 4.26
Con límites de confianza de 1.46 < OR <1 2.69.
Chi squares 9.26, con un valor de P=0.0023 demostrando que por cada 4.19 hombres que sufren infarto existe una mujer. La edad media en la que sufrieron infarto fue de 38 años con una edad mínima de los pacientes fue de 20 años y máxima de 45 años.
]]> Se encontró en el análisis del índice una masa corporal que el 40 % tenía un IMC normal con una media de 22 para la población sana y de 25 para los infartados, encontrándose por Anova un valor estadísticamente significativo de la P =0.002733.Con relación al antecedente de hipertensión arterial en que el Odds ratio fué de 14.37 con un límite de confianza de 1.78< OR <313.27, con una Chi Squares 9.88 con valor de la P= 0.00167412 siendo estadísticamente significativa la asociación con hipertensión arteria¡, dándonos una relación de que por cada paciente infartado que no es hipertenso hay 14 que si lo son.
No hubo asociación estadísticamente significativa para diabetes Mellitus debido a que en el estudio se incluyeron pocos pacientes con Diabetes Mellitus.
Para el análisis del perfil lipídico se encontró, a nivel del colesterol total, una media para los pacientes sanos de 166 mg/dl y para los infartados de 213 mg/dl con un valor de P= 0.000527, siendo estadísticamente significativo. El 58 % de los pacientes tenían niveles de colesterol elevados mayores al 200 mg/dl.
El 78.7 % de los pacientes tenía niveles iguales o menores al 35 mg/dl de HDL colesterol.
Los triglicéridos mostraron los siguientes hallazgos una media de 100 para la población sana y para los enfermos de 181 con un valor estadísticamente significativo de P de 0.000161. Los niveles de LDL para los pacientes infartados tenían una media de 145 mg/dl, con una moda de 156 mg/dl. El valor mínimo de LDL fue de 81 mg/dl y el máximo de 265 mg/dl. La t student es = 25.709 valor de p=0.0000001.
Para el HDL colesterol la frecuencia media fue de 33mg/dl en el grupo con infarto con una moda de 30mg/dl.
Para la mutación de la enzima 677 T metiltetrahidrofolato reductasa (ver tabla N°1).
El número de pacientes con la mutación y el número de pacientes enfermos no mostró diferencias estadísticamente significativas.
Para la mutación del factor quinto Leyden solamente se encontró un caso y para la variante de protrombina solamente un caso ambos factores genéticos en un paciente con infarto del miocardio.
El porcentaje de pacientes masculinos con infarto fue del 84 % y femeninos de 15%.
Los índices de masa corporal oscilan de 17 el mínimo a 36 el máximo.
El 25% de los pacientes con infarto eran hipertensos y solamente un 3.9% eran diabéticos.
El 41% de los pacientes infartados consumían alcohol y el 45% tenían antecedentes familiares de enfermedad coronaria.
El análisis de las proteínas anticoagulantes se encontró en el grupo enfermo una disminución significativa en los niveles sanguíneos en relación con el grupo control, (ver Tabla N°2). El otro dato relevante del análisis estadístico es que en los cruces de asociación con la frecuencia alélica de la mutación MTFH se evidenció asociación altamente significativa de tener niveles bajos de las Proteínas S y C tanto para los pacientes sanos como los infartados que eran homocigotos a esta mutación.
También hubo relación estadísticamente significativa con índice de masa corporal y la presencia de obstrucciones coronarias P= 0.051.
Con relación a los hallazgos de lesiones coronarias en el 49% de los pacientes se reportó la arteriografía coronaria con normal y en el 51% algún grado de obstrucción coronaria. El otro dato interesante, 6 pacientes tuvieron más de un infarto durante el año de seguimiento.
Con respecto al tabaquismo el 58% de los pacientes fumaba in promedio de 20 cigarrillos por día, el máximo de cigarrillos fumados fue de 60 por día, para un valor de p=0.000001.
La importancia de los factores de riesgo es fundamental en el entendimiento de la enfermedad coronaria. La idea de riesgo o es un concepto nuevo pero sí es nueva la idea de que los actores sirvan de marcadores para saber la probabilidad que tiene un paciente de desarrollar enfermedad coronaria.
Como es sabida por todos la importancia de un factor de riesgo se basa en tres relaciones fundamentales:
1- la coneccíon biológica en medio del factor y el proceso de aterosclerosis.
2- La fuerte asociación estadística con un futuro evento cardiovascular de donde sale el término riesgo relativo.
3- Y la extensión de los cambios que el factor influencia en el futuro curso de la enfermedad. (16)
]]> Hoy en día se sabe que los eventos de trombosis coronaria son los hallazgos más frecuentes en el infarto del miocardio, lo que ha cambiado aquel concepto de que sólo las lesiones con obstrucciones severas del lumen de la arteria eran importantes. Este estudio presenta las relaciones de una mutación genética y las diferentes alteraciones de laboratorio en las proteínas anticoagulantes y como éste grupo de población tiene una condición genética que lo predispone a la aparición de eventos de trombosis arteriales y venosas, los eventos arteriales son mediados básicamente por los niveles elevados de la homocisteína y los eventos de trombosis a nivel venoso son indirectamente provocados por la disminución de algunas de las proteínas que evitan la coagulación.Conclusiones
1- El estudio demostró que los pacientes y el grupo control que fueron Homocigotas a la mutación de homocisteína, tenían niveles bajos de las proteínas C y S, lo cual establece un estado trombofílico.
2- En los pacientes con infarto fue estadísticamente más bajo el nivel de la proteína S (P=0.00007331) Chi -Squares 15.72 y para la proteína C (P=0.00056110). Chi-Squares 11.90, que el tener niveles elevados de fíbrinágeno y un índice de masa corporal mayor de 25 se relacionó con la presencia de lesiones obstructivas coronarias en los pacientes jóvenes.
3- Se comprobó que la presencia de los factores de riesgo como la HTA, DM, tabaquismo, obesidad, sexo masculino, colesterol, LDL- colesterol, triglicéridos elevados y el HDL bajo son factores de riesgo estadísticamente significativos para sufrir infarto del miocardio en la población menor de 45 años.
4- El tabaquismo constituyó un factor de riesgo significativo a (p=0.0155) con una relación estrecha a la presencia de obstrucciones coronarias (p=0.018).
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