Métodos: Se analizaron aspirados nasofaríngeos y lavados nasales de niños hospitalizados en el Hospital Nacional de Niños que ingresaron por infección respiratoria aguda utilizando la técnica de inmunofluorescencia. Las muestras positivas por Influenza se inocularon en monocapas celulares de MDCK utilizando tripsina en el medio y los aislamientos fueron identificados por inhibición de la hemaglutinación, y luego fueron enviados al CDC.
Resultados: Los resultados obtenidos demuestran que el virus Influenza puede ser aislado durante todo el año, aunque sus picos se presentan en el segundo y tercer trimestre del año. La cepa A/Sydney/05/97-like H3N2 circuló durante tres años consecutivos, apareciendo la cepa A/Panamá/2007/99-like H3N2 en el año 2001. En el caso de las cepas A/H1N1 se mostró variación año tras año 1999 y en el 2000 la A/Bayern/07/95 en el año 1999 y en el 2000 la A/NewCaledonian/20/99.
Conclusión: El aislamiento e identificación de los virus Influenza es la primera vex que se realiza en un laboratorio en este país, por lo tanto ha generado una importante información para las autoridades de salud y además será muy provechosa para los países centroamericanos.
Palabras claves: Virus de Influenza, Epidemiología, Costa Rica. ]]>
La gripe producida por el virus Influenza es la infección aguda más importante del sistema respiratorio en salud pública en todo el mundo. Este virus tiene la capacidad de variar antigénicamente sus glicoproteínas, burlando así la inmunidad adquirida de los hospederos. Por lo tanto, las infecciones por este virus son muy importantes desde el punto de vista de la morbilidad y la mortalidad. El cuadro clínico es muy variado ya que puede manifestarse desde una infección asintomática hasta una neumonía severa que en un gran porcentaje de los casos lleva a la hospitalización y a la muerte, sobretodo en edades avanzadas. El cuadro clínico más común presenta además de fiebres altas y los síntomas propios de una infección de las vías respiratorias superiores, postración debido a dolores musculares y de articulaciones, lo que se traduce en varios días de ausentismo laboral (1,2).Los picos epidémicos de las infecciones respiratorias en Costa Rica se presentan durante el segundo semestre del año, coincidiendo con la época lluviosa (3,4).
Los virus Influenza A tienen una gran capacidad de variación antigénica en sus glicoproteínas, hemaglutinina (H) y neuraminidasa (N). Existen dos clases de variaciones, mayores y menores (5). La variación menor ocurre por mutaciones puntuales en los ácidos nucleicos que codifican para estas proteínas y se cree que es debido a la presión inmunológica. Estas mutaciones se traducen en cambios antigénicos importantes desde el punto de vista inmunológico cada 6 a 12 meses, haciendo que los anticuerpos producidos contra la cepa original ya no tengan no la afinidad ni la especificidad para las cepas que circulan posteriormente (5,6). Los cambios mayores ocurren por un arreglo de los segmentos de ácido nucleico del virus, en caso de infecciones mixtas con virus provenientes de diferentes especies animales o entre subtipos de una misma especie. Como resultado puede aparecer nuevos subtipos del virus, los cuales no serocruzan con los originales y por lo tanto son totalmente nuevos para el sistema inmunológico de los humanos. Debido a los cambios mayores existen tres subtipos del virus Influenza A según sus glicoproteínas: el H1N1, H2N2 y H3N2 (7,8). En el año 2001, se aislan en arias partes del mundo un nuevo seroptipo, el H1N2, el cual es producto del intercambio de segmentos de ARN de los tipos que han co-circulado durante más de 20 años, el H1N1 y el H3N2, por lo tanto, si serocruzan con los anteriores y las vacunas actuales, protegen contra esta nueva variedad (9).
Con el fin de asegurar una adecuada protección, las vacunas contra Influenza deben producirse todos los años, ya que se deben incluir las cepas circulantes del momento para que realmente se genere una inmunidad protectora a quienes la reciben (10,11). Existen laboratorios de referencia alrededor del mundo que se dedican al aislamiento y caracterización de los virus aislados donde son analizados molecularmente y dos veces al año se escogen cuales serán las cepas que serán incluidas en las vacunas. El momento del año en que se aplica la vacuna varía en los dos hemisferios así como las cepas que se incluyen en las vacunas. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo es identificar las cepas de virus de Influenza que circulan en Costa Rica y en que meses se presentan los picos epidémicos para poder definir cual es el momento adecuado en que se debe vacunar a la población y con cual vacuna.
Materiales y métodos
Se analizaron muestras de niños hospitalizados en el Hospital Nacional de Niños hospitalizados en el Hospital Nacional de Niños (HNN) que ingresaron por infección respiratoria aguda. Las muestras analizadas fueron aspirados nasofaríngeos y lavados nasales, enviadas al Laboratorio de Inmunología del Hospital, dichas muestras se transplantaron en hielo, para así asegurar la viabilidad de los virus. Las muestras fueron manipuladas asépticamente con el fin de evitar contaminación bacteriana adicional, se homogenizaron por agitación y fueron analizadas por inmunofluorescencia directa para Virus Respiratorio Sincicial (VRS), Adenovirus, Influenza A y B y Parainfluenza 1, 2 y 3, utilizando reactivos marca Light Diagnostics de la casa Chemicon International Inc. Los datos suministrados en este trabajo del año 1997 hasta julio del 1998 se basan solo en resultados provenientes de inmunofluorescencia. En agosto de 1998 se inicia el aislamiento y la tipificación de las muestras positivas por esa técnica.
Aislamiento y tipificación el Virus
Las muestras que se determinaron como positivas por Influenza A o B se congelaron a –70°C para ser enviadas al Laboratorio de Virología en la Facultad de Micobiología de la Universidad de Costa Rica. Se utilizaron para el aislamiento viral, botellas de 25cm2 con monocapas de células MDCK (riñon de perro Madin-Dardy, ATCC CCL 34). Una vez inoculadas con la muestra clínica, se absorbieron a 37°C durante una hora y luego se agregó el medio e cultivo D-MEM sin suero fetal bovino y con 2 ug/ml de tripsina, TPCK, se incubaron a 37°C durante una semana, tiempo después del cual, los cultivos se congelaron y descogelaron tres veces, se centrigaron y se hizo un segundo pasaje en las mismas condiciones (12). Al final del segundo pasaje, se hizo una hemaglutinación con eritrocitos humanos tipo O al 0.75% para determinar la presencia del virus. Las muestras positivas, se titularon y fueron tipificadas usando el juego de reactivos de la Organización Mundial de la Salud, el cual fue amablemente enviado por el Dr. Alexander Klimov del Center of Disease Control (CDC), en Atlanta, USA. El tipeo de los virus se llevó a cabo por medio de la técnica de la inhibición de la hemaglutinación utilizando eritrocitos humanos tipo O al 0.75% (13). Los virus aislados fueron analizados molecularmente en el Laboratorio de Vigilancia de Cepas del Center of Disease Control (CDC)n por la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa-Restricción-Polimorfismo de fragmentos (14).
Resultados
Los picos epidémicos por virus respiratorios en Costa Rica ocurren durante el segundo semestre del año como se muestra en la Figura 1 que incluye la tendencia de los últimos cinco años. Los picos epidémicos en los niños hospitalizados se deben fundamentalmente al virus Respiratorio Sincicial que no necesariamente coinciden con los picos donde se demuestra la actividad del virus Influenza, la cual varía año con año (Figura 2). Como se puede observar en la Figura 3, en los años 1997, 1998, 1999 y 2001 se presentaron casos durante todo el año, pero al actividad más importante por el virus Influenza se demostró durante el último cuatrimestre, con variaciones de año a año. En el 2.000, el virus más frecuentemente detectado durante el primer semestre fue el virus Influenza, en cambio, en el 2002, no se diagnosticaron casos de Influenza durante el primer semestre, sini hasta finales de junio que se detectó el primer casos en un paciente del Hospital de Niños (los datos no aparecen en la figura). ]]>
En setiembre y octubre co-circulan un tipo A y un tipo B, los cuales fueron identificados por inmunofluorescencia pero no pudieron ser aislados y por lo tanto no se pudo realizar la identificación molecular. En el año 2000 (Tabla 1), el virus Influenza que se detectó fue el mismo que en los dos años anteriores, el tipo A/H3N2, cepa A/Sydney/05/97. Un semana después del aislamiento de una muestra del Hospital de Niños, ocurrió un brote en Golfito, comunidad que se encuentra al sur del país, a 330 Km de San José, y el virus identificado fue A/H1N1, cepa A/NewCaledonia/20/99, el cual se aisla de una muestra de un niño del Hospital de Niños dos meses después. En el año 2001, se identificó el virus B/Sichian/379/99 y un mes después este virus cocircula con el A/Panamá/2007/99-similar a H3N2.
Este estudio se realizó con muestras obtenida de niños hospitalizados, por lo tanto, era de esperar que la incidencia del virus Respiratorio Sincicial fuera mayor que la incidencia de los virus Influenza. Los datos obtenidos en este trabajo demuestran que la actividad del virus de la gripe ocurre durante todo el año, presentándose los brotes epidémicos en los diferentes meses, según el año. En la mayoría de los períodos estudiados, los brotes ocurrieron en el último cuatrimestre, pero existen grandes variaciones, ya que en el 2000 el pico epidémico se presentó en el primer semestre y en el año 2002 no se diagnosticaron casos en el Laboratorio de Inmunología del Hospital de Niños durante ese período.
Las cepas que han circulado en Costa Rica durante los años de estudio se muestran en la Figura 4. La cepa A/Sydney/05/97-like H3N2 circuló durante tres años consecutivos, apareciendo la cepa A/Panamá/2007/99-like H3N2 en el año 2001. En el caso de las cepas A/H1N1 se mostró variación año tras año, lo cual se muestra en la misma figura. También se logró demostrar que hay co-circulación de los tipos A y B, así como de os subtipos H1N1 y H3N2 y que pueden circular cepas diferentes en diferentes lugares geográficos del país. Este hecho reafirma la importancia de ampliar los sitios centinelas a diferentes zonas y determinar si se cumple algún patrón de diseminación del virus.
Con el objetivo de determinar la epidemiología de los virus respiratorios en al comunidad, se llevó a cabo un estudio preliminar(15) en pacientes de la consulta de los EBAIS de Tirrases en el cantón de Curridabat durante mayo del 2001 a abril del 2002. Se tomaron muestras de frotis faríngeo y nasal a todo pacientes de cualquier edad que presentara síntomas de infección respiratoria. El 48% de los pacientes muestreados que acudieron al centro de atención fueron niños menores de 5 años y un porcentaje muy bajo fueron adultos mayores. Se evidenció que todos los virus respiratorios se detectan durante el año, lo que demuestra su constante circulación en la comunidad (18) y un 23% de los pacientes presentaron infecciones mixtas. La presencia del virus Influenza fue reportada en los pacientes de los EBAIS durante todo el año, lo cual no corresponde a lo reportado en el Hospital Nacional de Niños. Esto demuestra la importancia de realizar estudios similares en pacientes de la consulta externa de las Clínicas de la Caja del Seguro Social o los EBAIS en diferentes zonas del país para lograr evaluar el impacto de estas infecciones en las comunidades y tratar de definir algún patrón que permita prevenir la hospitalización. Por otro lado, el estudio preliminar mencionado (15) demuestra la importancia de incluir en proyectos futuros, un lugar centinela que incluya los adultos mayores de 65 años.
Los datos presentados en este estudio permiten determinar la actividad del virus en los diferentes meses durante 5 años, con lo cual se puede emitir un criterio inicial para definir el momento del año en que se debe aplicar la vacuna en Costa Rica. Además, conociendo las cepas que circulan se podrá evaluar cual vacuna se debe aplicar, si la del hemisferio su r o norte. Las variaciones en los patrones epidemiológicos de este virus en Costa Rica en los diferentes años de estudio y la posibilidad que aparezcan cepas nuevas debidas a la variación antigénica, confirman la necesidad de mantener la vigilancia epidemiológica y decidir anualmente por la vacuna más adecuada para Costa Rica.
Cabe destacar que es la primera vez que se realiza el aislamiento e identificación de virus Influenza en Costa Rica, por lo que genera una importante información para las autoridades de salud del país y además será también muy provechosa para los países centroamericanos.
Agradecimiento
Al Dr. Alexander Klimov, Jefe de la Sección de Vigilancia de Cepas y la Dra. Nancy J. Cox, Directora del Centro Colaborador de la OMS para Referencia e Investigación de Influencia del centro de Control de Enfermedades y Prevención en Atlanta, U.S.A. por llevar a cabo la tipificación molecular de las cepas de virus Influenza aisladas. También queremos agradecer al señor Francisco Vega por su asistencia técnica y la Dra. Laya Hun O. Por la revisión del manuscrito y sus observaciones tan acertadas. Agradecemos a la Vicerrectoría de Investigación de la Universidad de Costa Rica por el financiamiento de este trabajo.
Abstract
The objective of this study was to identify the Influenza virus strains circulating in Costa Rica and determine the months of the year where the highest incidence is present to be able to decide when to vaccinate and which vaccine to use. Nasopharyngeal aspirates and nasal washings were analyzed by inmunofluorescence from samples of children admitted to the National Children Hospital with acute respiratory illness. Positive samples for Influenza viruses were inoculated in MDCK cell monolayers using trypsin in the media. Isolates were typed by the hemagglutination inhibition test and sent to CDC for further testing. Influenza virus can be isolated all year around but peaks during the second and third trimester. The strain AlSydney/05/97 circulated during three consecutive years, appearing the strain AlPanama/2007/99-like H3N2 in 2001. A/Bayern/07/95-like H1N1 was detected in 1999 and the A/NewCaledonia/20/99 in the year 2000. This is the first study done in Costa Rica, its results have been very useful to the health officials and it could be very beneficial for the rest of the Central American countries. ]]>
Key words: Influenza Viruses, Epidemiology, Costa Rica.Referencias
1. Murphy BR. & Webster RG. Orthomyxovirus. En: Virology. Fields BN. et al (ed). Lippincott Raven Publishers.1996;1397-1445.
2. Noble GR. Epidemiological and clinical aspects of Influenza. En: Beare AS, ed. Basic and applied Influenza research. Boca Raton FL:CRC Press, 1982;11-50. [ Links ]
3. Herrero L & Vargas G. Epidemiología de las Infecciones Respiratorias en dos grupos de edad de Costa Rica. Rev.Cost.Cienc.Med. 1988;9:3541. [ Links ]
4. Arguedas A & Alfaro W. Infecciones del tracto respiratorio por virus respiratorio sincicial en pacientes pediátricos. Acta Pediátrica Costarricense 1995;4: 1. [ Links ]
5. Raymond FL, Caton AJ, Cox NJ, Kendal AP, Brownlee GG. The antigenicity and evolution of Influenza H1 hemagglutinin from 1950-1957 y 1977-1983. Two pathways from one gene. Virology.1986;148:275-287.
6. Cox NJ, Bai NZ, Kendal AP. Laboratory-based surveillance of influenza A (H1 N1) and A (H3N2) viruses in 1980-81: Antigenic and genomic analysis. Bull WHO. 1983;61:143-152. [ Links ]
7. WHO Memorandum. A revised system of nomenclature for Infuenza viruses. Bull Who 1980;58:585-591. [ Links ]
8. Lamb RA & Krug RM. Orthomyxoviridae: The viruses and their replication. In: Virology. De. .Fields BN et al. Third edition. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996;1353-1395. ]]>
9. http://www.cdc.qov/ncidod/diseases/flu/weekIy.htm . Febrero, 2002.10. Murphy BR. Use of live attenuated cold-adapted influenza A reassortant virus vaccines in infants, children, young adults, and elderly adults. Infect.Dis. Clin.Pract. 1993;2: 174-181. [ Links ]
11. Edwards KM, Dupont WD, Westrich MK, Plummer WD Jr., Palmer PS, Wright PF. A ramdomized controlled trial of cold-adapted and inactivated vaccines for the prevention of influenza A vaccines. J.Infect.Dis. 1994;169:68-76.
12. Tobita K, Sugiura A, Enomoto C, Furuyama M. Plaque assay and isolation of Influenza A virus in a established line of canine kidney cells MDCK in the presence of trypsin. Med.Microbiol. mmunol.1975; 162:9-14.
13. WHO Collaborating Center for Reference & research on Influenza. The 2000-2001 WHO Influenza reagent Kit for identification of Influenza Isolates. Centers for disease Control and Prevention. [ Links ]
14. Klimov A. Strain Surveillance Section. WHO Collaborating Center for Influenza Reference and research. Center of Disease Control. 2000. Comunicación personal. [ Links ]
15. Armijo M, Brenes M, Corrales E & Herrero, L. Infecciones respiratorias en pacientes de la consulta del EBAIS de Tirrases. 2001-2002. En preparación
(1) Laboratorio de Virología Médica, Centro de Investigación en Enfermedades Tropicales. Facultad de Microbiología, Universidad de Costa Rica, San José Costa Rica. Iherrero@cariari.ucr.ac.cr ]]>