Resumen
Los huesos antiguos son una buena fuente de ADN, útil en muchos casos para el análisis forense, especialmente cuando el tejido blando está severamente descompuesto o dañado. Existen diferentes métodos para la extracción de ADN a partir de restos óseos, con diferentes eficacias, y que plantean varios problemas técnicos. Se presenta una revisión bibliográfica sobre este tema y se incluyen algunas recomendaciones prácticas.
Palabras clave
Tipeo de ADN, extracción de ADN, huesos humanos, Ciencias Forenses
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Ancient bones are a good source of DNA, useful on many forensic cases, specially when the soft tissues are putrefied to a high extent. There is many different methods to extract DNA from bones with various degrees of efficiency on the DNA amount obtained. We present a bibliographic review and some practical considerations.
Keywords
DNA typing, DNA extraction, human bone DNA, Forensic Sciences.
Introducción
Convencionalmente la identificación positiva de restos humanos se había venido realizando mediante el análisis y comparación de huellas dactilares, radiografías esqueléticas o dentales, y en ciertas ocasiones por la presencia de marcas únicas, tales como tatuajes o cicatrices. Sin embargo, en los últimos años la tecnología del ácido desoxirribonucleico (ADN) ha surgido como una poderosa herramienta para la identificación individual especialmente en casos donde el tejido blando está severamente descompuesto o dañado, o no se pueden hacer comparaciones odontológicas o antropológicas. Así, muchos restos humanos que consistían solamente en huesos, han sido identificados exitosamente por diferentes metodologías de ADN (1).
La demostración de que algunas secuencias específicas del ADN pueden ser recuperadas de huesos (2, 3) indica que existen vastas fuentes de material genéticopreservado en huesos antiguos que pueden estar disponibles para su estudio. [Por hueso antiguo se debe entender cualquier hueso que haya estado expuesto a degradación ambiental por un apreciable periodo de tiempo (4)]. Este hecho tiene profundas implicaciones para la genética de poblaciones y para las investigaciones evolutivas y forenses.
Así por ejemplo, se ha recuperado ADN antiguo de las fuentes más espectaculares, como son: de insectos atrapados en ámbar de hace unos 120 millones de años (5), de plantas fósiles de 17 millones de años (6); así también de fuentes más recientes, como momias egipcias de hace 2400 años (7), huesos de soldados de la guerra civil de Estados Unidos de 1862 (8) y de restos de los soldados de la guerra de Vietnam de 1980 (1).
La presente revisión analiza las metodologías para la extracción de ADN a partir de huesos para su utilización en estudios forenses y antropológicos. Tiene el propósito de hacer disponible este tipo de información a científicos, abogados y jueces interesados en el tema. ]]>
Consideraciones generales
Después de la muerte, las moléculas biológicas empiezan a ser degradadas por las enzimas endógenas, y por organismos exógenos, además del daño provocado por las condiciones ambientales a las que el organismo haya estado expuesto (9). No obstante, aunque las biomoléculas se alteren en forma, sus componentes pueden persistir por largos períodos de tiempo.
Existen condiciones ambientales que favorecen la preservación del ADN. Una rápida deshidratación disminuiría el daño hidrolítico (10,11,12). Las condiciones anaeróbicas, la presencia de taninos o ácidos húmicos del suelo (12,13), las fuerzas iónicas altas, la asociación con proteínas cromosómicas u otras moléculas biológicas pueden favorecer la preservación del ADN (14), y pueden retardar la actividad degradativa por parte de los microorganismos. Todo esto, sugiere que condiciones ambientales específicas juegan un papel importante en la preservación del ADN más que la edad del mismo.
Sin embargo, la forma de preservación más importante del ADN es en los dientes y en los huesos, donde la molécula queda comprimida entre los cristales de hidroxiapatita (fosfato de calcio) los cuales tienen una alta afinidad por el ADN y lo estabilizan (15,16,17). Además, la cantidad de agua y de enzimas degradantes que contiene el hueso es relativamente poca, y también el hueso actúa como una barrera física a factores externos tales como la luz ultravioleta y los microorganismos (16).
Muchos estudios han mostrado que los huesos pueden soportar condiciones ambientales extremas y luego permitir que su ADN sea correctamente caracterizado mediante técnicas que hacen uso de la reacción en cadena de la polimerasa o PCR (18-20).
Mientras el análisis del ADN antiguo es posible gracias a la gran sensibilidad de la PCR, esta misma sensibilidad es también la causa de grandes problemas técnicos, como por ejemplo, la amplificación de trazas de ADN moderno introducido como contaminante y su amplificación inadvertida en vez del ADN antiguo, por lo que se requieren rigurosas prácticas de laboratorio, personal calificado, experimentos control y pruebas de verificación en todos los pasos (16,21).
En los primeros reportes de análisis de ADN de huesos antiguos se trabajó con el ADN mitocondrial (ADNmit), amplificando fragmentos de tamaño mayor a 233 pares de bases (pb) en huesos de 6.000 años de antigüedad (3) y mayor a 600 pb en huesos de 750 años (22). el ADNmit amplificado a partir de restos esqueléticos, es de especial valor para propósitos de identificación en el campo forense, ya que: a) contiene dos segmentos hipervariables que han sido estudiados en detalle (23), b) los eventos mutacionales ocurren de 5 a 10 veces más rápido que en el genoma nuclear (24), c) el ADNmit es heredado a través de línea materna, por lo que cada individuo tiene solamente un tipo de ADNmit (25), d) las células tienen solamente dos copias del genoma nuclear, pero cientos de miles de copias del genoma mitocondrial (26).
Caracterización del ADN de huesos ]]>
La mayoría de los métodos de extracción de ADN de huesos implican la pulverización del hueso, su descalcificación con EDTA y la subsecuente utilización de algún método estándar de extracción de ADN.
Para la descalcificación hay diferentes métodos reportados en la literatura (17, 22, 27-30). este paso puede ser un proceso largo, e implica incubación del polvo de hueso con muchos cambios de buffer que contienen EDTA 0.5 M, que es un potente secuestrador de calcio.
Hay tres razones básicas para usar la descalcificación como parte del método de extracción: a) el polvo de hueso es muy grande en escala celular para que haya eficiente extracción del ADN. b) la doble hebra de ADN tiene fuerte afinidad por la hidroxiapatita que debe ser removida para recuperar el ADN inmerso en ella. c) colorantes contaminantes que tienden a precipitar con el ADN y a causar inhibición de la PCR son eliminados con la descalcificación.
Sin embargo, se debe considerar que también existen desventajas en efectuar el proceso de descalcificación como son el mucho tiempo que consume, lo laborioso que resulta y que el EDTA empleado debe ser removido totalmente de la extracción para prevenir la inhibición de la PCR. Por lo que, hay varias publicaciones que reportan que la descalcificación no es necesaria para una extracción exitosa del ADN de huesos (8, 31-34). Fisher et al (8) compararon los métodos con descalcificación y sin descalcificación y encontraron que con la extracción directa de ADN del polvo de hueso, se obtuvo más del doble de ADN, que en el método estándar con descalcificación.
Un aspecto que no está completamente aclarado en la comparación de estos métodos es que el ADN obtenido puede diferir cualitativamente. Es posible que, bajo un procedimiento no descalcificante el ADN recuperado de huesos expuestos al medio ambiente venga asociado al de microorganismos, a la vez que se falle en extraer el ADN embebido en la matriz de hidroxiapatita o en osteocitos no expuestos (17).
Otro prometedor método de extracción de ADN de huesos está basado en el lavado del ADN en columnas de hidroxiapatita por incubación en altas concentraciones de fosfato de sodio (34,35). Nielsen et al (34) compararon este método contra los métodos estándar de descalcificación y no descalcificación y recuperaron mucho menos ADN que con los otros métodos. Sin embargo, el ADN recuperado de esta forma permitió la amplificación de un ADNmit de 900 pb de longitud, mientras con los otros métodos las amplificaciones no fueron mayores de 150 pb. ]]>
Varios otros métodos para la extracción de ADN de huesos sin descalcificar han sido propuestos, incluyendo un procedimiento que implica calentar el polvo de hueso por 2 horas a 95 ° c (19) y el método de Chelex, donde la muestra se hierve en presencia de una matriz quelante (36). Estas extracciones con Chelex no son estables por largos períodos de tiempo, se obtiene sólo ADN de hebra simple y expone el ADN antiguo a potenciales daños por altas temperaturas.Hoss y Pääbo (37) reportaron la aplicación exitosa de un prometedor método de extracción para ADN antiguo usando sílica, el cual hace uso de la fuerte afinidad del ADN a la sílica e incluye la presencia del desnaturalizante isotiocianato de guanidina, que ayuda en la desasociación de las macromoléculas. Esta técnica tiene dos ventajas, primero se elimina rápida y efectivamente los inhibidores de la PCR que fueran aislados simultáneamente con el ADN antiguo y que son el mayor factor limitante en la amplificación del mismo. Segundo, se emplean pocos pasos y reactivos, minimizando así la exposición a contaminación con ADN moderno.
Inhibidores de la PCR
Como se ha mencionado, uno de los aspectos que más confunden y preocupan en la investigación del ADN de huesos son los inhibidores de la PCR que frecuentemente se copurifican con el ADN. Aunque estos inhibidores no han sido específicamente identificados, se les asocia con compuestos químicos de la reducción de azúcares (38), y con ácidos húmicos del suelo (17), extraídos a partir de huesos grisáceos porosos y frágiles. Han sido empleadas muchas técnicas para luchar contra estos inhibidores con apenas un éxito parcial, siendo el método de sílica el más prometedor. Varios autores, Pääbo (38), Hoss et al (39), Akane et al (40) y Bruce et al (41) han utilizado las siguientes estrategias para minimizar la inhibición: a) dilución del ADN previo a la amplificación, b) aumentar la cantidad de la Taq polimerasa, c) adición de albúmina de suero bovino a la PCR, d) filtración del ADN extraído en tubos centricón 30 ó 100, e) precipitación con bromuro de etidio y acetato de amotino, f) separación por centrifugación en gradiente de equilibrio de cloruro de cesio.
Recomendaciones para el trabajo con ADN de huesos
Algunas recomendaciones para la extracción de ADN a partir de huesos humanos tanto para la investigación científico evolutiva como forense son:
b) Durante toda la manipulación de los especímenes, se deben utilizar guantes plásticos, bozal, utensilios quirúrgicos estériles para tomar las muestras, las cuales deben ser puestas en tubos plásticos estériles que pueden ser usados para la subsecuente extracción de ADN. ]]>
c) Debe existir una separación física de los laboratorios en un área para extracción de ADN y otra área donde se manipulará sólamente ADN amplificado por PCR.d) Se debe tener un juego de gabachas y equipo de laboratorio (pipeteadores, mesas, etc) dedicado exclusivamente para el manejo de ADN sin amplificar y otro para el material amplificado.
e) Es necesaria la inclusión de controles negativos en todas las fases. Los cuales deben ser hechos en la misma área, con los mismos reactivos y al mismo tiempo en que se efectúan los diferentes pasos de extracción y amplificación del ADN.
f) Por lo menos dos muestras deben ser tomadas a partir del mismo espécimen, y deben ser extraídas así como amplificadas en ocasiones diferentes para demostrar la reproducibilidad de los resultados.
g) Los resultados deben ser interpretados con base en el análisis de filogénias o de estudios de genética de poblaciones.
Agradecimientos
Agradecemos a A. I. Morales, del laboratorio de ADN del Poder Judicial por la lectura crítica del manuscrito.
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*Centro Investigaciones en Hemoglobinas Anormales y Trastornos Afines (CIHATA)
e-mail: gjimenez@cariari.ucr.ac.cr
**Centro Biología, Universidad de Barcelona, España
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