Introducción
Los recientes avances científicos en terapia génica y las perspectivas de su futuro, dadas las enormes expectativas puestas en este procedimiento, unidos a nuevos métodos de diagnóstico, al avance impresionante de la biotecnología, la informática y las comunicaciones nos conducen a una de las áreas de la medicina molecular que constituyen un foco de atención privilegiada. En el transcurso del nuevo milenio la opinión de numerosos investigadores que vienen desarrollando el campo de la terapia génica, revelan una trascendental importancia, plenamente justificada si se considera que, probablemente en un futuro cercano, la terapia génica posibilitará la cura total de las inmunodeficiencias primarias.
Terapia Génica
La terapia génica se usa para el tratamiento de una determinada enfermedad, ya sea adquirida o hereditaria, utilizando la introducción de nuevo material genético en determinadas células del paciente. De esta forma se les proporciona a las células enfermas instrucciones en forma de secuencias de ADN, con el propósito de que produzcan proteínas de carácter terapéutico. La terapia génica se aplicará más fácilmente sobre enfermedades que afectan a un solo gen y no él múltiples genes. Además se debe tener conocimiento de cuál es el gen defectuoso y qué efectos produce, también se debe de contar con los genes curativos sintetizados y listos. De esta forma en la transferencia genética, el gen normal (ADNc) es donado en un vector de expresión o sea un agente que transporta el ADNc al tejido diana donde, bajo la regulación de un promotor que es una parte de la secuencia de ADN, el gen se hace activo (23 ,12 ). Esta terapia se puede aplicar en dos grandes grupos celulares; las células somáticas y las células germinales. La terapia génica basada en las células germinales no ofrece un buen futuro previsible, ya que los genes se trasmitirán de generación en generación, y esto conlleva problemas de naturaleza ética. La terapia génica basada en las células somáticas es menos problemática puesto que solo afecta al propio paciente y el tratamiento, por tanto se realizará exclusivamente al tipo celular dañado (1 ,6 ).
Básicamente, existen tres tipos de terapia génica; la terapia llamada antisentido: que pretende bloquear la expresión del gen responsable de la enfermedad. La terapia llamada de adición: se centra en la introducción de un gen terapéutico a modo de medicamento, para suplir la deficiencia del mismo gen que está afectado en esa patología y la terapia llamada de corrección: estrategia que aspira a corregir directamente el gen mutado ( 9 , 11 ,14 ).
]]> El éxito de la terapia génica reside en el método de transferencia génica que se utiliza, ya que dependiendo de las características de las células, del tejido o del órgano, se opta por una manipulación "in vitro" u otra "in vivo". Actualmente se cuenta con vectores retrovirales (virus modificados no patógenos) que son los vehículos de transferencia génica, que inoculan el gen en el enfermo. Son muy diversos y están construidos normalmente en virus defectuosos capaces de reproducirse con ayuda de una línea celular. Se ha demostrado que el uso de virus modificados es altamente efectivo en la distribución del gen hasta el lugar elegido, pero no puede replicarse. Es por esta razón que los retrovirus son el vector preferido, aunque últimamente se han comenzado a utilizar adenovirus y virus herpes como agentes diseminadores eficaces ( 4 , 22 ). Se dispone también de métodos sintéticos que utilizan policationes (10 ), moléculas orgánicas que, por su carga positiva, se unen al ADN, cargado negativamente, y así entran en la célula. Por otra parte, existen métodos físicos y químicos como los conjugados moleculares que son complejos de ADN y proteína capaces de interactuar con receptores celulares para adentrarse en la célula: el microbombardeo (16 ) que se basa en la aceleración a gran velocidad de partículas como el oro, que incluyen al ADN, impactándose contra las células para favorecer su penetración y los liposomas que son vesículas de lípidos que incorporan en su interior el ADN y vehiculizan su entrada en la célula (22 ).En los ensayos de transferencia genética, el gen normal (ADNc) es donado en un vector de expresión y hay un agente que transporta el ADNc al tejido diana donde, bajo la regulación de un promotor, (parte de la secuencia de ADN que activa el gen) se hace activo. Estos elementos de expresión como ya se comentó son construidos normalmente en virus defectuosos capaces de reproducirse con ayuda de una línea celular. Como conclusión, el empleo de virus modificados parece altamente efectivo en la distribución del gen hasta el lugar elegido, con la ventaja de que no puede replicarse, por eso los retrovirus son el vector preferido (5 ,13 ,20 ).
La elección de una manipulación "in vivo" o "in vitro" condiciona el sistema de transferencia del gen:
1. Un tipo de terapia génica se basa en modificar genéticamente "in vitro" un conjunto de células que forman un organoide, especie de microfábrica que, una vez implantado en el organismo, produce la proteína necesaria, la cual llega hasta el organismo donde se necesita. por medio del torrente sanguíneo.
2. Cuando el objetivo son células o tejidos que pueden renovarse a partir de células precursoras como las del tejido hematopoyético (la médula ósea), la piel (queratinocitosis y fibroblastos), los endotelios (recubren la cara interna de los vasos sanguíneos y linfáticos ), el hígado y los músculos (mioblastos), se extraen y cultivan las células y son expuestas a la acción de un retrovirus que les transfiere el gen. Al dividirse, transmiten el transgén a las células hijas. Sólo se reinyectan al paciente aquellas células en las que el transgén se ha integrado y funciona correctamente. Esta estrategia "ex vivo", empleando vectores construidos a partir de retrovirus es la más utilizada recientemente contra ciertos tipos de cáncer.
3. Para las células quiescentes (completamente diferenciadas y que se dividen poco o nada) y las asociadas a funciones mecánicas o estructurales (músculo estriado, músculo cardíaco o pulmones) se sigue la estrategia" in vivo", aplicada con cierto éxito a una enfermedad pulmonar - la mucoviscídosis - y en principio adecuada para enfermedades neuromusculares o neurodegenerativas. Los vectores adenovíricos y otros sintéticos como los lisosomas son los más adecuados en estos casos (7 ,8 ).
La inmunodeficiencia combinada severa o (SCIDS) es un grupo de enfermedades de inmunodeficiencias primaria caracterizada por un deterioro profundo de la respuesta humoral y la mediada por células. Los niños afectados típicamente se enferman de infecciones recurrentes causadas por bacterias, virus, y patógenos oportunistas. El defecto molecular ha sido identificado para la mayoría de los fenotipos de SCID (Cuadro 1 ) (2 ,5 ,6 ,10 ).
La identificación, cIonación, y expresión de los genes causantes de las diferentes formas de SCID son la herramienta potencial de curación con terapia génica en las células somáticas.
]]> El método ideal de terapia génica requiere una transferencia eficiente del gen en las células afectadas del sistema hematopoyético, de tal manera que permite una apropiada expresión del gen normal en las células afectas (de la hematopoyesis o línea linfoide). Sin embargo, dificultades iniciales en obtener una transducción eficiente de las células stem han dirigido a los investigadores a buscar una trasferencia del gen directamente en linfocitos diferenciados. La transferencia del gen en las células linfohematopoyéticas para SCID es actualmente basada en el uso de retrovirus como vectores. ADA- Deficiencia SCID
La ADA- deficiencia fue el primer desorden que se trató con la transferencia de gen usando retrovirus y hasta la fecha, solo así es tratada la SCID. El defecto afecta el receptor de linfocito T, moléculas de transducción de señal, factores de transcripción, y enzimas del metabolismo de las purinas tales como adenosin-desaminasa (ADA).
La ADA- deficiencia es un trastorno autosómico recesivo y representa el 25% de la causa SCID y sin tratamiento, es fatal. El defecto molecular es en la mayoría de los casos una mutación en par de base simple que genera la sustitución de un aminoácido. aunque también se han reportado mutaciones "splicing" y selecciones.
ADA es una enzima intracelular que cataliza la conversión de adenosina a inosina en el ciclo de las purinas. En ADA-SCID, los metabolitos de las purinas tales como deoxiadenosina, adenosina, o DATP se acumula en los tejidos. Esta acumulación de metabolitos de purinas es la causa de la inhibición de la proliferación, diferenciación y maduración de las células inmunocompetentes. Una forma de la enzima ADA es localizada también en la superficie celular del linfocito T y está asociada con la molécula de activación del mismo dipeptidil peptidasa IV (DPPIV o CD26), y con el receptor de adenosina. La enzima ADA extracelular, complejo para CD26, parece estar involucrada en la activación del linfocito T y es capaz de reducir la concentración externa local de adenosina, de manera que le confiere más resistencia a las células T de los efectos inhibidores de la adenosina.
El transplante alogénico de médula ósea es el tratamiento de elección para esta inmunodeficiencia y sólo es posible si se tiene un donador HLA idéntico, El 90-100% de los niños que se transplantan tienen una reconstitución inmunológica completa y se libera de la enfermedad (7 ,8 ). Otra alternativa es el transplante medular depletada de células T de un donador de haplotipo no compatibles de un donador familiar, tiene una tasa de curación del 40-70%, dependiendo del estado de la enfermedad y el momento del transplante de médula ósea. Otras fuentes de células stem empleadas en el transplante de pacientes con SCID incluyen tejido fetal y placenta/sangre del cordón umbilical. La sangre de cordón umbilical parece ser prometedora por su baja incidencia de la enfermedad injerto vs huésped, incluso en situaciones HLA no compatibles, debido a la inmadurez funcional de los linfocitos T. La trasplantación de células progenitoras en útero es otra opción terapéutica experimental que podría superar muchos de los riesgos asociados al transplante de médula ósea.
En aquellos pacientes ADA- SCID que no son candidatos para citoablación porque tienen algún daño en los pulmones o en el hígado por previas infecciones que presentan un fenotipo leve que no justifica el riesgo asociado con la trasplantación, se usa una terapia alternativa que consiste en la inyección ADA bovina conjugada con polietileno glicol (PEG-ADA) y que da como resultado la corrección de las anormalidades metabólicas, un grado variable de recuperación de las funciones inmunes, y el descenso en la incidencia de infecciones severas. Desde 1990, la opción terapéutica para ADA- deficiencia es la terapia génica en células somáticas y fue, la primera persona tratada con esta herramienta, una niña de dos años de edad afectada por esta enfermedad (2 ).
Los experimentos indican que el tratamiento génico de algunas células extraídas a los enfermos y su posterior reinserción está siendo eficaz al menos en esta enfermedad, y que, tras dos o más años de tratamiento se ha conseguido la relativa normalización del sistema inmune y la restauración de la inmunidad celular y en parte a las ventajas de crecimiento que las células tratadas genéticamente parecen tener sobre las anómalas.
Tras numerosos estudios en organismos modelo, se iniciaron ensayos clínicos de transferencia génica de ADA hacia células T periféricas, previamente tratadas "in vitro". Aunque algunos pacientes experimentan una notable mejoría clínica e inmunitaria, los resultados difieren considerablemente de unos a otros y no llegan a normalizarse todos los índices de la función inmunitaria. En opinión de algunos, ni en este ensayo pionero ni en otros, existen evidencias inequívocas de que el tratamiento genético ha producido beneficios terapéuticos. Los riesgos de posible mutagénesis insertiva de genes relacionados con el cáncer, después de repetidas transferencia retrovirales, no han sido confirmados hasta el momento. Pero los modestos resultados han estimulado otras propuestas de ensayos clínicos en Italia y Los Países Bajos. Según sus autores, en uno de estos últimos ensayos la transferencia génica había funcionado y se había conseguido la reconstitución inmunitaria. En todo caso, es preciso tener en cuenta que los pacientes estuvieron recibiendo también inyecciones rutinarias de ADA sintética, y estos tratamientos convencionales podrían ser responsables en parte de su buena salud.
PNP- Deficiencia SCID
Es una rara forma de SCID que afecta las células T predominantemente, como el ADA, PNP es una enzima del metabolismo de las purinas que actúa en ambos ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos. En ausencia de PNP, se acumula deoxiguanosina dentro de la célula y es fosforilada a deoxi-GTP, causando la inhibición de la proliferación de las células. Las células B son menos sensibles que las células T a la acumulación de ésta, probablemente por eso ellos usan una vía metabólica diferente. La transferencia del gen PNP de ratones a linfocitos humanos de pacientes PNP deficientes mediado por retrovirus. corrige el defecto metabólico y parcialmente restaura las funciones inmunes de ellos (3 , 5 ).
X-SCID
Se caracteriza por un defecto en la diferenciación de células T y NK. Aquí las células B maduran y se preservan pero funcionan anormalmente. El defecto molecular responsable de esta enfermedad es una mutación en la cadena gama del receptor de la IL-2, IL-7. IL-9, Y IL- 15 (receptor común de citokinas). La cadena gama interactúa corriente abajo con miembros de la familia de Janus Kinasa, en particular Jak 3, para la transducción de una señal extra celular permitiendo eventualmente la activación del gen. El tratamiento a escoger es el transplante de médula ósea en el caso de que se encuentra un donador HLA-compatible. En otros casos con transplantes HLA-no compatibles la sobrevida es de un 50-60%, por la inmunodeficiencia residual debido al comportamiento de las células B. Por esta razón los investigadores sugieren la transferencia del gen de cadena gama con el propósito de ofrecer una alternativa terapéutica para X-SCID, La cadena gama ha sido exitosamente introducida en líneas de células B transformadas; por EBV de pacientes X-SCID restaurándose superficialmente la expresión de la cadena gama y la función del receptor de IL-1 e IL-4 que muestran una reconstitución de la señal de transducción y proliferación de la repuesta celular. Además la transferencia in vitro del gen de la cadena gama en células progenitoras de la hematopoyesis, en presencia de SCF, IL-2, e IL 7 fue posible restaurar la diferenciación de células N K en pacientes con X-SCID ( 3 ,11 ,18 ).
Jak3- Deficiencia SCID
]]>Es una enfermedad caracterizada por un fenotipo virtualmente idéntico a X-SCID, El defecto molecular se encuentra en el gen que codifica para Jak3, una kinasa intracelular unida a la cadena gama común linfocito. Este hallazgo es. crucial para entender el papel de la interacción de la cadena gama/Jack 3 en el desarrollo y proliferación del linfocito. Un vector que codifica un ADNc de Jack3, es usado para transducir en células B de pacientes con deficiencia Jack3 SCID. La transferencia del gen mediado por retrovirus ha hecho posible restaurar la expresión y función de Jack3, permitiendo normalizar el crecimiento de líneas de células B. Para estudiar la transferencia del gen mediado por retrovirus se ha usado un ratón con deficiencia Jack3 SCID con células stem hematopoyéticas. Esta transferencia del gen en células stem hematopoyéticas de ratón mediadas por retrovirus resulta en un aumento en el número de linfocitos, revocación de hipogamaglobulinemia, reconstitución de la activación de células T sobreestimulados con mitógenos y en el desarrollo de respuesta inmune antígeno específica después de la inmunización. Esta importante corrección del gen Jack3 en la línea celular linfoide exhibe una significativa ventaja in vivo. que sugiere que este método podría ser efectivo incluso cuando la eficiencia de la transferencia del gen sea relativamente baja ( 3 ,19 ).
CD8-Deficiencia
Es una deficiencia autosómica recesiva caracterizada por la ausencia de linfocitos CDR+ y células CD4+ defectuosas. El defecto molecular se da por una mutación en el gen que codifica para Zap-70, una proteína-tirosina-kinasa que involucra la señal del receptor del linfocito T. Los resultados preliminares obtenidos con terapia génica en células linfohematopoyéticas para esta rara enfermedad son alentadores. Cuando linfocitos T de pacientes Zap-70 deficientes fueron transducidos con un vector-retroviral que codifica para Zap-70 normal, fue posible restaurar la expresión y función de Zap-70, permitiendo una señal normal en el receptor del linfocito T (5 ,17 ).
Conclusiones
En teoría, la terapia génica, puede ser usada en todos los tejidos del organismo, lo que se debe resolver son los problemas de eficacia de la transferencia del gen-medicamento y del control de su expresión.
La realidad actual es que se hace difícil controlar el destino del ADN y, cada vez que se introduce un fragmento en el núcleo en su lugar específico, más de 1.000 se insertan aleatoriamente. Además, el hecho de llevar el fragmento dé ADN hasta el núcleo celular es toda una odisea por el desconocimiento de las características que debe reunir el vector adecuado. Por lo tanto sería ideal que la terapia génica se aplicara mediante un solo' tratamiento y sin efectos secundarios, por enfermedad y paciente y, llevar a cabo la inserción de un gen en el cromosoma de la célula somática deseada. Así se llevaría a cabo en su sitio específico mediante un proceso de recombinación homóloga y el gen sano o terapéutico remplazaría, con precisión, la copia dañada. Con este tipo de inserción se favorece la función correcta del gen y disminuye la probabilidad de que su inserción active un oncogén.
Resumen
]]>En este artículo se revisa la literatura más reciente en terapia génica y principalmente en el tratamiento de las inmunodeficiencias primarias. En los últimos años esta nueva estrategia terapéutica ha sido posible por el conocimiento de las bases genéticas de algunas enfermedades y, pone en el campo de la salud nuevas perspectivas para el tratamiento de muchas patologías. Este procedimiento permite utilizar genes como elementos curativos, variando de manera permanente o transitoria el genoma de un individuo, con tal de sustituir algún gen defectuoso o aportarle a dicho gen la capacidad de fabricar él mismo, alguna sustancia que le fuese vital. Actualmente esta terapia sólo es capaz de luchar contra enfermedades de base Mendeliana simple, pero con el avance de nuevas técnicas se espera que sea capaz de curar o tratar los efectos de enfermedades de base no Mendeliana simple en donde existen más de un gen como factor ( 3 ).
Entre las enfermedades genéticas humanas candidatas a la terapia génica esta la Inmunodeficiencia Combinada Severa; que es un grupo de Enfermedades de Inmunodeficiencias primarias que se caracterizan por un deterioro profundo de la respuesta humoral o la mediada por células. Actualmente hay 2.000 pruebas clínicas activas con más de 2.500 pacientes enterados y más de 20 países involucrados (1 , 21 ).
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* Laboratorio Clínico. Hospital Nacional de Niños "Dr. Carlos Sáenz Herrera". Caja Costarricense de Seguro Social. San José Costa Rica. gdiaz50@racsa.co.cr
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