Los integrantes del género Bordetella, son cocobacilos Gram negativo de pequeño tamaño. Todos son catalasa positivo, aerobios estrictos y muchas de sus especies son fastidiosas, ya que requieren nicotinamida, cisteína y nitrógeno orgánico (aminoácidos), para su reproducción (10 ).

Este género está compuesto por 4 especies a saber: Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Bordetella bronchiseptica y Bordetella avium; siendo B. pertussis, la especie más fastidiosa de este grupo, la única que no crecería en medios simples y la que se vería afectada en su crecimiento por la presencia de ácidos grasas insaturados, iones metálicos, sulfuro coloidal y peróxidos, por lo que los medios de cultivo para este agente, deben ser enriquecidos con almidón, carbón vegetal, albúmina, sangre o alguna otra sustancia que la proteja ( 10 ).

B. pertussis crece lentamente y son muy susceptibles al frío y a la desecación, por lo que los medios de cultivo deben ser incubados a 37°C, en una atmósfera con alta humedad (cámara húmeda) y por un periodo no menor de 4 días (10 ).

B. pertussis es la causa predominante de la tosferina, un cuadro clínico que se observa principalmente en la edad pediátrica y donde los jóvenes y los adultos, pueden jugar un importante rol en la diseminación del agente ( 1 ). Este cuadro clínico, tiene un periodo de incubación entre los 6 y los 20 días, con un promedio de 7 a 10 días y presenta tres etapas claramente diferenciables: etapa catarral, etapa paroxismal y etapa de convalecencia. La etapa catarral, se inicia como un cuadro gripal, con coriza y una tos moderada, tiene una periodo de duración de una a dos semanas y es el periodo con la mayor tasa de infectividad del agente. La etapa paroxismal dura de 2 a 6 semanas y se caracteriza por accesos de tos (tos quintosa), seguidos por un estridor inspiratorio y la tos, puede desencadenar vómitos. En la etapa de convalecencia, la tos disminuye gradualmente, en severidad y frecuencia (4 ).

En el presente informe, se comenta sobre los pacientes a los cuales se les realizó IFA directa por Bordetella pertussis, desde el primero de enero de 1999 al 30 de setiembre de 2002.

La muestra empleada fue nasofaríngea en todos los casos, para lo cual se emplearon torundas de alginato de calcio con mango flexible. En cada situación, la recolección se realizó al pie de la cama del paciente, con excepción de aquellos casos en los cuales la muestra fue referida al Hospital Nacional de Niños para su estudio. En todo momento, se emplearon portaobjetos nuevos y la muestra se esparció en un diámetro no mayor de 5 cm.

Una vez en el laboratorio, la muestra fue fijada por 5 minutos en metanol y luego se realizó la tinción para inmunofluorescencia, para lo cual, se colocaron 50ul del reactivo (anticuerpos contra B. pertussis marcados con fluoresceína), el cual estuvo en contacto. con la muestra por 30 minutos y en cámara húmeda. Este reactivo fue de la casa Difco y una vez preparado en la forma tal y como lo recomienda la casa comercial, fue guardado a -70°C en viales criogénicos.

]]> El reactivo, después del periodo de incubación fue lavado con buffer a pH 7,0 en cuatro oportunidades consecutivas. La observación se realizó empleando un microscopio de fluorescencia de la marca Olympus modelo BX40, con un bombillo de mercurio.

Para el control de la calidad, se usó una cepa de Bordetella pertussis suministrada por el Laboratorio de Control de Enfermedades Infecciosas (CDC) en Atlanta, Georgia USA.

Resultados

En el periodo de estudio, se realizaron 473 estudios de IFA directa por B. pertussis, de los cuales 50 fueron positivos (10,6 %). De los 473 estudios realizados, 22 provenían de sitios diferentes del H.N.N. con 16 del Hospital Max Peralta de Cartago, 2 del Hospital San Rafael de Alajuela, 2 del Hospital de San Ramón y 2 del Hospital Grecia (Ver Cuadro 1 ).

El estudio de los 50 casos positivos, muestra que en todos los casos, a excepción de una trabajadora del H.N.N., los pacientes eran menores de edad y de éstos, 43 estuvieron internados en el H.N.N. Cinco de estos casos positivos no se estudiaron en el H.N.N., 4 de ellos provenían del Hospital Max Peralta y uno del Hospital Carlos Luis Valverde. Solo se presentó una fatalidad atribuible a la tosferina. ]]> En la revisión de los 43 expedientes clínicos de los niños estudiados en el H.N.N., vemos como la infección fue más frecuente en los varones (58%) que en las mujeres y 16 de ellos estaban vacunados, contra 22 que no y 5 no tenían indicaciones referentes a este punto. De los vacunados, en realidad 11 de ellos, dada su edad, no tenían el esquema de vacunación completo.

El recuento leucocitario así como el porcentaje de linfocitos observados en estos pacientes, muestran lo esperado y lo reportado en la literatura, donde vemos recuentos leucocitarios elevados y con un alto porcentaje de linfocitos. Como se observa en el Cuadro 2 , la mayor parte de los pacientes tenían entre 11.000 y 20.000 leucocitos por mm³ .

y el porcentaje de linfocitos con mayor cantidad de pacientes fue el rango entre 71 y 80% (ver Cuadro 3 ).

]]> La tosferina, ha sido un flagelo de la población infantil mundial, por un largo periodo ( 3 ). Desde los primeros aislamientos en 1906 (2 ) del agente causal de esta enfermedad, es mucho lo que se ha avanzado en el conocimiento de este cuadro clínico (10 ).

Hoy día sabemos, con bastante exactitud, cual es su fisiopatología, cómo podemos prevenirla cuál su forma de control, cuáles sus formas de diseminación, cuáles sus complicaciones y sobre todo, los laboratorios han evolucionado en forma importante en los métodos de detección de Bordetella pertussis (3 ,4 ,7 ,10 ).

Su primera forma de detección, fue el cultivo en el medio ideado por Bordet y Gengou a principios del siglo pasado, el cual utiliza una base de infusión de papa con agar suplementado con glicerina al 4% y sangre de conejo desfibrinada al 50% ( 2 , 10 ). Luego son varios los tipos de medios de cultivo que se han desarroIlado y sigue siendo, esta forma de detección, el estándar dorado para la detección de Bordetella pertussis (10 ).

Una de las primeras modificaciones al Bordet-Gengou, amplió la concentración de glicerol al 10% y redujo la sangre al 20%, todo esto con el afán de mejorar la vida media del medio de cultivo, la cual es muy baja ya que platos con una semana de preparados, muestran tasas de aislamiento menores a los medios recién preparados (10 ).

En 1965, la compañía Oxord sacó al mercado un agar base-carbón activado y suplementado con 10% de sangre de caballo desfibrinada (CHB agar) (10 ). Luego se implementó un medio de cultivo sin sangre, que demostró tener un menor porcentaje de aislamiento que los medios con sangre ( 10 ). Por último, el CHB agar, sufrió una modificación que consiste en la adición de 40 ug/ml de cefalexina, lo cual mejora la detección de B. pertussis y aumenta la vida media del medio de cultivo hasta las 6 semanas (8 ,10 ).

Varios estudios han demostrado la superioridad de los medios suplementados con sangre de caballo sobre la sangre de otras especies (9 ).

Por otra parte, la toma de la muestra es muy importante, siendo la secreción nasofaríngea la forma más adecuada para la recolección de la muestra para cultivo por Bordetella pertussis y utilizando hisopos flexibles de dacrón o de alginato de calcio (6 ). Si se requiere transporte de la muestra antes de ser sembrada, la opción más utilizada es el Amius medium y puede utilizarse el agar Reagan Lowe con un platea posterior en CHB (10 ).

La incubación de los platos para el cultivo de B. pertussis debe hacerse en un incubador sin CO ₂, dentro de una cámara húmeda ya que la humedad es indispensable, a 35°C, por un periodo no menor de 7 días y con platos con una mayor cantidad de medio de cultivo que los agares tradicionales ( 10 ) Las colonias son pequeñas, rugosas, redondeadas, convexas y de consistencia butireasea. Tienen la apariencia de pequeñas gotas de mercurio sobre el medio de cultivo (10 ).

]]> La identificación puede ser efectuada por medio de una tindón de Gram inicial (coco bacilo Gram negativo), con una prueba de oxidasa, la cual es positivo para pertussis y bronchiseptica y negativa para parapertussis y luego se emplea un antisuero monoclonal para la identificación final, ya sea por aglutinación o por inmunofluorescencia (10 ).

Otras formas de detección del agente son serológicas, por Inmunofluorescencia Directa (lFA) y por métodos moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa o PCR (10 ).

En las pruebas serológicas, son muchos los métodos empleados, desde la pruebas de aglutinación y fijación de complemento hasta las pruebas de ELISA. En estos casos, la elevación de anticuerpos IgG e IgA, son los más representativos, con elevaciones de la IgG en más del 80% de los casos y del 60% de ellos para la IgA (10 ).

La inmunofluorescencia directa es un método rápido, donde se emplean anticuerpos monoclonales contra B. pertussis y B. parapertussis, ambos marcados con una molécula fluorescente y que permite una adecuada detección de los anteriores agentes (10 ).

La tosferina es un entidad clínica en donde la cantidad de agentes en las secreciones es determinante en la detección del agente. Al inicio de la enfermedad, se presenta la etapa catarral. Con sintomatología muy inespecífica pero con la mayor presencia de agentes en las secreciones y conforme el paciente pasa a la etapa paroxismal, la cantidad de microorganismos va decreciendo. Por esta razón, la toma de la muestra y sobre todo la toma de la muestra en las etapas más tempranas de la infección son determinantes para una mejor sensibilidad de la IFA (5 ,10 ).

Indudablemente, la IFA presenta una especificidad baja (60%) y una sensibilidad disminuida (90%) con respecto al cultivo y hay estudios científicos que mencionan un problema grave de falsos positivos (88,4%) (10 ).

El estudio de B. pertussis utilizando PCR, presenta un tremendo potencial. Al momento hay 4 diferentes "primers": uno que incluye la región promotora de la toxina pertúsica, otro que proviene del poro de la porina, un tercero que es una secuencia de inserción repetitiva IS480 y un cuarto que corresponde al gen ACT (10 , 11 ).

]]> Al comparar el cultivo con la PCR, se ha encontrado una buena concordancia, sin embargo, hay estudios que mencionan un 26% de casos con PCR negativo y cultivo positivo y lo contrario (PCR positivo y cultivo negativo), es mucho más frecuente, pero está en relación con el momento de la toma de la muestra y con la utilización previa de antibióticos, eventos que pueden negativizar el cultivo ( 10 ).

En cuanto a los datos obtenidos en nuestro Hospital, vemos cómo es más frecuente en varones. con edades menores a un año, en su mayoría no vacunados y que en muchos de ellos. el esquema vacunal no está plenamente cumplido, en especial por su edad. Aproximadamente, el 50% de los niños con IFA positiva para B. pertussis y con edades mayores a los 5 años, no están vacunados. La procedencia de los niños positivos es muy variada y debemos enfatizar que sólo se presentó una fatalidad y que como caso curioso, hubo un caso de una infección en una trabajadora del hospital en contacto estrecho con niños con tosferina, que se resolvió en forma adecuada utilizando eritromicina.

Un examen de laboratorio, que puede ser usado como una guía diagnóstica, es el hemograma, donde se observa un recuento leucocitario elevado con linfocitosis. En nuestra casuística los hemogramas observados, se encuentran dentro de lo esperado, con un mayor número de pacientes con recuentos entre 11.000 y 20.000 leucocitos por mm³ y entre 71 y 80% de linfocitos.

Tanto en Costa Rica, como en otros países del continente americano, se ha observado un rebrote en las infecciones por Bordetella pertussis, por lo que es el momento de revisar el esquema vacunal y decidir si es necesaria la aplicación de una nueva dosis entre los adolescentes. quienes parecen ser el foco de donde provienen las infecciones que afectan en forma importante a los lactantes.

En los últimos años, los casos de tosferina, se han incrementado a nivel mundial y Costa Rica no ha sido una excepción. Desde enero del 1999, se realizó a todo niño con sospecha clínica de tosferina, una IFA Directa, de secreción nasofaríngea por Bordetella pertussis y durante el periodo de estudio, se analizaron 473 casos y 50 de ellos fueron positivo, para un 10.6% de positividad. La infección fue más frecuente en varones que en mujeres y sólo se encontró una fatalidad asociada a la Bordetella pertussis.

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2. Bordet J. & Gengou O.: Le Microbe de la Coque luche Ann. Inst. Pasteur 20: 731. 1906.         [ Links ]

3. Cherry J., Brunell P., Golden G. et al.: Report of the task force on pertussis and pertussis inmunization-1988. Pediatrics 81: 939, 1988.         [ Links ]

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5. Ewanowich c., Chui L., Paranchych M. et al.: Analysis of discrepant direct fluorescentantibody and culture results by using polimerasa chain reaction methodology. J. Clin. Microhiol. 31: 1715, 1993.         [ Links ]

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9. Hoppe J. & Schwaderer J.: Comparison of four charcoal media for the isolation of Bordetella pertussis. Clin. Microbiol. 27: 1097. 1989.         [ Links ]

10. Hoppe J. Bordetella: In: Manual of Clinical Microbiology Editor in chief Patrick Murray. Editors: Ellen Jo Baron et al. 7th eds American Society for Microbiology, Washington D.C.. 1999.         [ Links ]

11. Li Z., Jansen D., Fim T. et al: Identification of Bordetella pertussis by shared- primer PCR.         [ Links ]

 
* División de Microbiología, Laboratorio Clínico Hospital Nacional de Niños "Dr. Carlos Sáenz Herrera" Caja Costarricense de Seguro Social, San José, Costa Rica mherrera@hnn.sa.cr