En los últimos años, hemos observado un aumento significativo en el aislamiento de Candida albicans y otras especies de este género, especialmente en pacientes inmunosupresos (8).
Este aumento puede ser atribuido al avance en la sobrevida de los recién nacidos de muy bajo peso; al logrado en el campo de los transplante, ya sean de órganos sólidos o de médula ósea, y al aumento indudable en la sobrevida de pacientes con cáncer. Otro importante factor, es el aumento indiscriminado en el uso de antibióticos antibacterianos de amplio espectro. Además, no podemos dejar de lado el aumento continuo de personas con sida (4).
La mejoría de los protocolos para el manejo del sida, cáncer y transplantes de órganos, ha aumentado la supervivencia de estas personas, pero las ha hecho más susceptibles al ataque de organismos oportunistas como la Candida albicans (4).
El desarrollo de las drogas antimicóticas ha sido lento y son relativamente pocas las alternativas con las que se cuenta para el tratamiento de infecciones micóticas invasivas. ]]>
Prácticamente son seis los agentes antifúngicos: los Polienos como Anfotericina B, los Imidazoles como Miconazole y Ketoconazole, los Triazoles como Fluconazole e Itraconazole y los inhibidores de la síntesis de pirimidinas como la Flucitocina (5-FC) (4).De todos estos antimicóticos, Anfotericina B, es el de mayor uso y actúa inhibiendo el ergosterol de la membrana celular del hongo, causando lisis de sus células. Es necesario recordar, que el hongo como eucariota que es, presenta una membrana celular idéntica a las de las células humanas, razón por la cual esta dorga es un antimicótico de alta toxicidad.
Dentro de sus efectos colaterales, podemos observar la fiebre, náuseas, vómitos, anorexia, escalofríos, trombocitopenia, anemina, tromboflevitis y el más serio: la nefropatía (2).
A pesar de este hecho, Anfotericina B sigue siendo el tratamiento de elección para la Candida albicans y otros agentes micóticos especialmente los organismos dimórficos (7).
Los azoles como Miconazole, Ketoconazole, Itraconazole y el Fluconazole son alternativas viables, pero su actividad no ha logrado sustituir claramente a la Anfotericina B (10).
Esto hace necesario realizar la determinación "in vitro" de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI), de la Anfotericina B contra la Candida albicans y de esta forma tratar de disminuir al máximo los efectos adversos de esta droga; además ya hay reportes de cepas de Candida albicans resistentes a la Anfotericina B (1).
El campo micológico de la sensibilidad "in vitro", ha sido un punto de mucha complejidad, con una serie enorme de problemas a resolver.
Para realizar estas pruebas de sensibilidad, se han utilizado tres métodos diferentes, macro y micro dilución en agar y tiras de E test (4).
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En este estudio, se utilizaron 100 cepas de Candida albicans, aisladas en 1994 en el Laboratorio Clínico del Hospital de Niños e identificadas con el Sistema API 20C (Biomerieux) o utilizando tarjetas Yeast para el Sistema Automatizado Vitek (Biomerieux).
De estas 100 cepas, 20 fueron aisladas a partir de adultos, todos ellos empleados del Hospital de Niños y se distribuyeron de la siguiente manera: 5 de lesiones en piel (manos), 5 de infecciones ungueales y 10 de secreción vaginal.
Las 80 cepas restantes, fueron aisladas de niños internados en los diferentes servicios del Hospital Nacional de Niños y se distribuyeron de la siguiente manera: fungemia 14 cepas, secreción bronquial 11, mucosa oral 10, secreción vaginal 10, orina 10, secreción traqueal 9, abscesos peritoneales 8, otitis media crónica 5, ungueales 2 y una cepa de líquido pleural. En todos éstos, se documentó la significancia clínica del agente aislado, en base a criterios clínicos como la fiebre y de laboratorio como fue la alteración del hemograma.
La CMI, fue definida como la mínima concentración de Anfotericina B que inhibe el crecimiento visible de un inóculo estandarizado de Candida albicans.
El medio de cultivo usado fue RMPI 1640 más alfa glutamina y un tampón de fosfatos (Sigma Chemical Co. r6405). Se prepararon alícuotas con 10,4 g de medio disolviéndolo en un litro de agua bidestilada y amortiguado con N-2 hidroxithylpiperazine N-2 ethanesulfonic acid, (HEPES, Sigma Chemical Co.) a pH 7,0 (9).
Este medio de cultivo se esterilizó por filtración y se almacenó a -70ºC en botellas de color ámbar, previa inoculación de una alícuota de 0,1 ml de tioglicolato, el cual se incubó por 7 días para asegurar esterilidad.
Para la preparación del inóculo se usó el método espectrofotométrico (11), para lo cual las cepas de Candida fueron cultivadas sobre agar sangre, hecho a base de eritrocitos humanos al 5% e incubadas a 35 grados centígrados por 24 o 48 horas.
El inóculo se estandarizó entre 1 x 105 y 5 x 105 ufc/ml utilizando un nefelómetro Vitek y se hizo en RPMI; a partir de allí se realizó una dilución de 1:2.000, para un inóculo final de 0,5 x 103 a 2,5 x 103 ufc/ml (3, 4, 6, 11).
Las placas para la microtitulación fueron de 96 pozos con fondo en U (Dynatech Laboratories Inc. Alexandria VA) y en todos los pozos se colocaron 50 ul de medios de cultivo (RPMI). ]]>
La solución madre de Anfotericina B (Squibb and Sons, Princeton, N.J.) se preparó a 2.560 ug/ml.Ya en la placa, en el pozo 1 se colocaron 50 ul de la solución madre diluída de 1:10 y de allí en adelante se realizaron diluciones dobles, pasando 50 ul de un pozo a otro, hasta el pozo 10 dejando el 11 y 12 como control positivo y negativo respectivamente.
Una vez realizadas las diluciones, y respetando el control negativo, se colocaron 50 ul de inóculo de la levadura.
De esta manera, el pozo 1 tenía una concentración de 128 ug/ml y el pozo 10 de 0,25 ug/ml.
La placa se selló y se incubó a 35 grados centígrados por 48 a 72 horas sin agitación, siendo el control positivo el que nos dio el tiempo de lectura.
Pasado este lapso, la placa se leyó por turbiedad, siempre referido a los controles, tanto positivo como negativo, utilizando un espejo lector (Lector Cooke Engineering Co., Alexandria VA).
Una CMI para Anfotericina B, se considera sensible si es menor de 2 ug/ml; intermedia, si se encuentra entre 2 y 4 ug/ml; y resistente si la CMI es mayor de 4 ug/ml (4).
Como control positivo de crecimiento y reproducibilidad, se utilizó la cepa control de la Candida albicans ATCC 90028, que representa una sensibilidad a la Anfotericina B entre 0,25 y 1,0 ug/ml (2).
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En este estudio, tanto las cepas aisladas de adultos como las aisladas de niños, mostraron resultados muy semejantes, por lo que no haremos referencia de su diferenciación.
De las 100 cepas estudiadas, un 74,8% mostraron sensibilidad a la Anfotericina B, con un CMI menor o igual a 1 ug/ml.
El 25,5% mostraron una sensibilidad intermedia con una CMI entre 2 y 4 ug/ml.
No se encontraron cepas en niveles de resistencia (CMI>4,0 ug/ml).
En todas las oportunidades en las que se montó la prueba, la cepa de Candida albicans, ATCC 90028, mostró los niveles esperados y la mayor parte de las veces la CMI fue de 0,5 ug/ml.
Conclusiones
La Candida albicans constituye un problema importante de salud a nivel mundial (4). Son cada vez más frecuentes sus aislamientos y su capacidad invasiva es ampliamente reconocida (4,12). ]]>
No cabe duda, de que los pacientes inmunosupresos son las principales víctimas de este agente, el cual es un claro ejemplo de un organismo oportunista (12).Para la mayoría de los organismos micóticos, Anfotericina B, es el antimicótico de elección, a pesar de la gran cantidad de efectos colaterales de esta droga. Nuevas alternativas como los azoles y especialmente Fluconazole, no han demostrado una mejor actividad antimicótica que Anfotericina B. Sin embargo, contra las levaduras, la actividad del Fluconazole es bastante buena, sin lograr desplazar a la Anfotericina B.
El riesgo de tratamientos con Anfotericina B es alto; sin embargo, su utilidad es evidente.
Estas son las razones principales para medir la actividad "in vitro" de esta droga y establecer cuál es la mínima concentración a nivel de tisular, necesaria para inhibir el crecimiento del agente etiológico.
Las pruebas de sensibilidad para antimicóticos, presentan problemas como son el tamaño del inóculo, la preparación de éste, la formulaciópn del medio de cultivo empleado y su pH, la duración y la temperatura de incubacióny los criterios para la determinación de los puntos finales de la CMI (3,4,6,11). A esto hay que agregar el hecho de que los organismos micóticos tienen una morfología o forma de desarrollo muy diferente al resto de los microorganismos (4). Tampoco podemos dejar de lado las propiedades del antimicótico como son la solubilidad, estabilidad química y mecanismos de acción (4).
En este estudio, tratamos de introducir una técnica recientemente desarrollada para estudios micológicos y CMI, pero que está disponible sólo para organismos levaduriformes, ya que aun hay problemas a resolver a la hora de preparar el inóculo en organismos miceliales (4).
La metodología seguida en este estudio es la recomendada a nivel mundial, tanto para el medio de cultivo, como para la preparación del inóculo, el tiempo de incubación y la determinación de los puntos finales para la CMI (3,4,6,11).
Sólo fue necesario hacer un ajuste en el amortiguador usado, ya que el recomendado a nivel mundial (MOPS) (4), no se consigue en nuestro país. Por lo que se cambió este amortiguador por el HEPES, siempre respetando el pH de 7,0.
La técnica de microtitulación para la determinación de la CMI para Anfotericina B contra Candida albicans, es una técnica complicada y que consume mucho tiempo de trabajo, por lo que una nueva técnica desarrollada a base de las tiras de E test, y siempre para organismos levaduriformes pone a nuestra disposición, una forma más sencilla de realizar la CMI; sin embargo, esta tiras son de alto precio (5).
Una de las principales intenciones de este estudio era la de comprobar, si en el Hospital Nacional de Niños, es posible encontrar organismos del género Candida resistente a la Anfotericina B. De las cien cepas, un 25,2% presentaron sensibilidad intermedia, y las 74,8% restante fueron sensibles. ]]>
Este 25% con sensibilidad intermedia es preocupante, ya que nos indica que hay cepas desarrollando resistencia. Este estudio debe servir como una llamada de atención hacia un uso más racional de la Anfotericina B.El incremento en el aislamiento de Candida albicans como oportunista en inmunosupresos, y los efectos secundarios con el uso del antimicótico más efectivo que es la Anfotericina B, nos motivó a estudiar la verdadera sensibilidad de C. albicans a ese medicamento. Se introdujo una técnica recientemente desarrollada para estudios micológicos y concentración mínima inhibitoria, sólo en organismos levaduriformes, ya que subsisten problemas con la preparación de inóculos con micelios.
Se estudiaron 100 cepas de C. albicans y se encontró que no había resistentes a Anfotericina B, pero si un 25,5% con sensibilidad intermedia.
Se llama la atención sobre ese inicio de desarrollo de resistencia y la necesidad de un uso más racional de la Anfotericina B.
Bibliografía ]]>
2. Duarte I.: Microtitulación en las pruebas de sensibilidad para Candida albicans. Trabajo final de graduación para optar por la Licenciatura en Microbiología y Química Clínica, Universidad de Costa Rica, 1992. [ Links ]
3. Espinel A., Kish C., Kerkering T. et al.: Colaborative comparison of broth macrodilution and microdilution antifungal susceptibility test. J. Clin. Microbil. 30:3138, 1992. [ Links ]
4. Espinel A., and Pfaller M.: Antifungal agents and susceptibility testing. Cit. en Murray P., Baron F. & Pfaller M. et al.: Manual of Clinical Microbiology. 6th Ed. American Society of Microbiology. Washington D.C., 1995. [ Links ]
5. E test for antifungal susceptibility testing of yeast. E test news. Vol 10, July, 1994. AB Disk Pyramidvagen, 7-S 17136, Solna, Sweden. [ Links ]
6. Frontling R., Galgiani J., & Pfaller M. et al.: Multicenter evaluation of a broth macrodilution antifungal susceptibility test for yeast. Antib. Agent. Chemother. 37:39,1993. [ Links ]
7. Gallis H., Drew R. & Pickard W.: Amphotericin B: 30 years of clinical experience. Rev. Infect. Dis. 12:308, 1990. [ Links ]
8. Herrera M.: Comunicación personal, 1995.
9. Herrero L. & Hun L.: Manual de Virología Clínica. Facultad de Microbiología. Universidad de Costa Rica, P. 125, 1995. [ Links ]
10. Medoff G., Brajtburg J. & Kobayashi G.: Antifungal agents useful therapy. Rev. Pharm. Toxicol. 23:303, 1983. [ Links ]
11. Pfaller M., Burmainster L. & Bartlett M. et al.: Multicenter evaluation of four methods of yeast inoculum preparation. J. Clin. Microbiol. 26: 1437, 1988. [ Links ]
12. Rippon J.: Tratado de Microbiología Médica. Ed. Interamericana McGraw-Hill 3ª Ed. p 574, 1992.
* División de Microbiología, Laboratorio Clínico, Hospital Nacional de Niños "Dr. Carlos Sáenz Herrera", Caja Costarricense de Seguro Social. San José, Costa Rica. ]]>