La Enfermedad de Chagas es una entidad clínica, descrita desde 1907 y causada por T. cruzi, un protozoario hemoflagelado, transmitido por insectos hematófagos de la familia Reduviidae. La infección es considerada una zoonosis, puesto que se presenta en humanos y en un gran múmero de mamíferos. En América Latina es autóctona y se estima que existen de 18 a 24 millones de personas infectadas quienes viven en regiones rurales o suburbanas de Latinoamérica (17).

Los mecanismos de transmisión son: 1-El ingreso del parásito por el sitio de la picada y las excoriaciones de la piel hechas por el huésped o debidas al prurito producido por las heces que dejó el reduvidio al alimentarse (14). 2-Transfusión sanguínea (1,2). 3-Vía oral por contaminación de alimentos con heces del reduvidio. 4-Infección intrauterina (10). Al mejorarse el control del vector, disminuyen los casos de la Enfermedad de Chagas por este mecanismo, pero, consecuentemente, los casos debido a aceptación de donadores en fase latente o crónica de la enfermedad, toman un mayor realce. Para el área centroamericana, en el año 1994, se reportó una seroprevalencia en donadores de sangre que oscila entre 0,05% y 2,5% (12). ]]> El virus linfotrópico T humano tipo 1 (HTLV-1), se localiza geográficamente en Japón, África tropical, el Caribe, América Central y Sur América. En los años 80 se demostró la asociación causal de este retrovirus con la leucemia/linfoma de células T del adulto; además existe evidencia de que sea causa de la enfermedad neurológica crónica degenerativa: paraparesis espástica tropical, que es una encefalomielopatía caracterizada por hiperespasticidad y ataxia (7). Además se asocia al HTVL-1 como el causante de poliomiositis, mielopatías y artropatías. También existen evidencias que lo relacionan a otras entidades de naturaleza inflamatoria (15). La infección es crónica y la transmisión se da verticalmente por leche materna y horizontalmente, por el contacto sexual, la transfusión sanguínea y el uso de drogas intravenosas (8, 11, 13, 16). En Costa Rica, la presencia de este virus detectado por estudios preliminares de seroprevalencia de Acs es de un 0,7% en una muestra de donadores y receptores de sangre realizados en el ICMRT (6); en diferentes comunidades indígenas y mestizas (Amerindios) se reportó una seroprevalencia del 1,2% (5).

El presente estudio tiene como objetivo contribuir a establecer cuál es la seroprevalencia, en donantes de sangre, de Acs contra T. cruzi y HTLV-1 y llamar la atención sobre las posibilidades de contaminación de los receptores de transfusiones sanguíneas con estos patógenos.
 
 
Materiales y Métodos

Se buscaron Acs IgG para T. cruzi en 1.000 sueros, conservados a -70ºC en la seroteca del ICMRT, a donadores de sangre del Hospital Nacional de Niños, del año 1994, que corresponden al 20% del total de donantes recibidos en este centro hospitalario en ese mismo año. El método utilizado fue un RIA que desarrolló el ICMRT y se basa en la detección de Acs específicos, a través de un antígeno unido a fase sólida. Las copas de poliestireno se recubrieron con antígeno purificado de T. cruzi, procesado por el Dr. Carlos Ponce del Ministerio de Salud, Honduras, en una concentración de 0,3 ug de antígeno por copa. También se agregó a cada pozo, 100 ul del diluente de muestra (PBS 0,5% tween 20 y crema en polvo de fécula de maíz al 10%), adicionando 2,5 ul de muestra o patrón (2 positivos, 2 negativos, 2 positivos débiles). Se incubó a 40ºC durante 20 min. y luego se lavaron los pocillos 3 veces con PBS 0,5% tween 20 y una vez con sólo PBS. El proceso de revelado se realizó agregando 100 ul de un anticuerpo anti Ig G humano de origen caprino (affinity isolated antigens specific, SIGMA, St. Louis, USA) el cual se marcó con I¹²⁵ diluido en PBS 0,5% tween 20, según las especificaciones para cada lote ; se incubó a 40ºC durante 20 min. y después se lavaron los pocillos -3 veces- con PBS 0,5% tween 20 y una vez con sólo PBS; se colocó cada copa en su respectivo tubo de conteo y se leyó la radioactividad en un contador gamma (ANSR, ABBOTT LABORATORIES, CHICAGO, USA).

El criterio de corte para el positivo y negativo es: el promedio del control negativo x 3,0=A; Valores ³ A=Positivo, Valores < A=Negativo con un 10%de zon gris, región donde por azar, la lectura de la muestra da +/- 10% con respecto al corte; las muestras que dieron esta zona, se controlaban para establecerlas como verdaderas negativas o positivas; si se conservaban en la zona se corroboraban nuevamente, y si se mantenían, pasaban como positivas a prueba confirmatoria.

Como prueba confirmatoria se utilizó Western Blot (W.B). En la parte electroforética se escogió gel de poliacrilamida al 11%, en un sistema discontinuo en SDS PAGE, descrito por Laemmli (9), el cual usa 0,8 mg del antígeno de los doctores Ponce por gel de 7 cm x 9 cm. La electrotransferencia a papel de nitrocelulosa se realizó según la descripción de Bunette (3). De cada muestra positiva, se colocaron 50 ul de suero con la tira de papel de nitrocelulosa, dejándose en contacto por una hora en amortiguador de PBS 10% con albúmina y caseína al 1%. Se lavó 3 veces. Se reveló por medio de una anti IgG humana conjugada con biotina (BIOTECH/DUPONT, MARYLAND, USA), de origen caprino. Luego se incubó por 1 hora y se lavó 3 veces. Después se agregó avidina conjugada con fosfatasa alcalina (BIOTECH/DUPONT, MARYLAND, USA), se incubó por 1 hora y se lavó 3 veces. El sustrato dimetilformamida se dejó en contacto por 20 minutos. Se lavó 2 veces y se dejó secar, luego se leyeron los resultados.

Paralelamente se corrieron tres W.B. dos a 0,16 mg y uno a 0,8 mg de antígeno nacional, purificado a partir de epimastigotos triosinisados, por gel, con el fin de demostrar si habían diferencias antigénicas significativas entre la cepa Costa Rica (Facultad de Microbiología, UCR) y la cepa de Honduras. Para considerar positiva una muestra debía presentar dos o más bandas con peso igual o inferior a 95 kd.

Se detectaron Acs contra HTLV-1 en sueros congelados de 662 donadores de sangre del Hospital Nacional de Niños, correspondientes al año 1994, que se conservaban a 70ºC en la seroteca del ICMRT, por medio de una técnica de aglutinación pasiva en partículas de gel, SERODIA (Fujirebio). La formación de una malla de partículas de gelatinas se tomó como positivo; formación de un botón compacto, negativo; y aquellas que estuvieran en un punto intermedio, como dudosas. Los sueros positivos y dudosos fueron confirmados por W.B. de Diagnostic Biotechnology, basado en el principio de detección de Acs contra proteínas del virus, o recombinantes; para ser positivas debía presentar 2 ó más bandas típicas para este agente (criterio de kit). ]]>  

En la determinación de Acs anti T. cruzi, se obtuvo en el RIA (prueba de tamizaje) una positividad de 14 donadores en 1.000 muestras (1,4%). El W.B. con antígeno de Honduras confirmó 4 como positivos, por la presencia de Acs reaccionantes con 3 o más bandas proteicas del T. cruzi de los siguientes pesos (20,22,24,28,35,40,95). Se encontraron 5 indeterminados: 1 con sólo 2 bandas de reconocimiento inferior a 95 (95 y 40), 1 con sólo una banda inferior a 95 (95), y 3 con bandas de peso superior a los 95; y 5 negativas, produciendo una seroprevalencia de 0,4% de positivos y un 0,5 indeterminados. El resultado W.B. con la cepa de Honduras se muestra en el Cuadro 1.

Con la cepa costarricense se efectuaron 3 W.B., 2 corridas electroforéticas con la cepa en la concentración original, 2 mg/ml. Para el 3º se dializó hasta concentrar el antígeno a 10 mg/dl. En ninguno de ellos se logró obtener ninguna banda de reconocimiento antígeno-anticuerpo, no hay resultados legibles.
 
 

Ninguna de las reacciones de aglutinación, para detección de Acs anti HTLV-1 obtenidos por los reactivos de SERODIA, fueron francamente positivas, mostrándose 9 de las 662 muestras como dudosas (seroprevalencia de un 1,4%). Los resultados de W.B. dieron 2 sueros como indeterminados que solamente mostraban reacción con la banda P21, específica de reconocimiento antígeno-anticuerpo; 7 fueron negativos.

Los resultados obtenidos muestran una seroprevalencia de 0,4-0,9% (positivos y positivos más indeterminados) de Acs anti T. cruzi, la cual al compararse con otros agentes tamizados, como VIH que en 1994 presentaba una seroprevalencia de 0,1%; VHC 0,5% o el HBsAg 0,4%, que se realizan de rutina en los bancos de sangre (12); nótese la relevancia del valor obtenido como juicio para considerar la probabilidad de contaminación de receptores de transfusión sanguínea por enfermedad de Chagas. ]]> Una seroprevalencia de 0,4% es baja con respecto a la realidad nacional, ya que las personas contaminadas, con alguna sintomatología, son rechazadas como donantes por medio de la entrevista y el examen previo a la donación. Además, cabe la posibilidad de que la prevalencia varíe en distintas regiones del país, debido a características propias del vector; se ha establecido valores de 2,0 en otro estudio (2).

En un reporte de la Cruz Roja Centroamericana, para Chagas la seroprevalencia en los donadores de sangre, correspondiente al año 1994, fue la siguiente: El Salvador (2,5%), Honduras (0,63%), Nicaragua (0,21%), Guatemala (0,05%). Se resalta que el valor obtenido con esta muestra, colocaría a Costa Rica en un segundo lugar entre los países centroamericanos. Es importante destacar que en estos países se realiza la detección de Acs anti T. cruzi por medio de reactivos preparados en el ICMRT; alcanzando valores muestras/corte, para positivos, de 4 a 8. Esta diferencia podría deberse a las características propias del agente en nuestro medio, como sería una menor circulación del mismo, distinguiéndose del que circula por otras zonas del área centroamericana.

La prueba del RIA utilizada, cumple con las características de alta sensibilidad diagnóstica que se requiere para los tamizajes de donadores de sangre. El número de muestras positivas, por lo tanto, va a ser mayor a la real, cuya causa sería el compartimiento de epitopos antigénicos entre Tripanosoma cruzi y otros protozoarios presentes en nuestro medio, como son: Trypanosoma rangeli y Leishmania sp.; por eso es que en esta prueba se detectó 1,4% de muestras positivas por Acs anti T. cruzi. La prueba confirmatoria W.B. es, en cambio altamente específica, porque muestra el patrón de bandas de reconocimiento antígeno-anticuerpo, así mismo una seroprevalencia del 0,4% con 0,5% de indeterminados.

Las bandas de peso molecular superior a los 95 kd se consideraron aunque se ha descrito que correlacionan con epitopos antigénicos compartidos entre Leishmania sp y T. cruzi (18). Se muestra en el Cuadro 1 que en las 4 muestras positivas hay 2 ó 3 bandas de peso molecular superior a los 95 kd, y que en las 5 muestras indeterminadas todas presentan estas bandas de pesos altos; como en Costa Rica la circulación de Leishmania es relativamente frecuente se consideró tomar estas bandas como dudosas, no como criterio de positividad.

El hecho de que no se obtuvieron resultados comparables, en los W.B. con la cepa costarricense, puede deberse que el antígeno procedía de cultivos diferentes. Téngase en cuenta que en ambos casos fue procesado de manera diferente en cada país, lo cual hace factible que sean distintos. Además alguno de los métodos de procesamiento puede favorecer la presencia de los epitopos más inmunogénicos. Por otra parte, puede ser que muchos de los antígenos que dan reacción en el huésped, no estén presentes debido a que es la forma amastigoto la que se encuentra en la fase parasitaria de mayor permanencia, y por tanto de contacto para la respuesta inmune. También es cierto que, debido al tratamiento dado al antígeno para correrlo en el gel, sólo se obtendrían los epitopos estructurales y no los conformacionales.

En el caso de HTLV-1, los resultados obtenidos discrepan en gran medida de los que se esperaban porque una seroprevalencia de 0,5% dudosa, y ningún francamente positivo contrasta con los datos obtenidos por García et al. (6). Esto puede deberse simplemente al azar, al uso de una técnica menos sensible (aglutinación pasiva contra ELISA), o ambas razones. En los últimos años se han comunicado problemas en diferentes juegos de reactivos para la detección de HTLV 1. Entonces es factible que se estuviera frente a uno de estos casos (4). Así el criterio que prevalece es el de seguir realizando estudios sobre la presencia de HTLV-1 en donadores, involucrando sitios de procedencia y utilizando otras alternativas de detección.

Se concluye que una seroprevalencia en donadores de sangre de 0,4% de Acs anti T. cruzi, no es despreciable e indica un riesgo potencial de infección para el receptor del producto. Por tanto, recomendamos se considere la posibilidad de que toda donación sea tamizada por este agente.
 
 
Resumen ]]> Se realizó el presente estudio para establecer la seroprevalencia de anticuerpos, en donantes de sangre contra los patógenos Trypanosoma cruzi y el virus linfotrópico T humano 1, que no se tamizan de forma rutinaria en los bancos de sangre de Costa Rica. Se buscaron anticuerpos IgG contra Trypanosoma cruzi por un método de RIA, desarrollado en el ICMRT, y basado en el principio de la detección de anticuerpos específicos, obteniéndose 14 positivos en 1.000 muestras de suero. Como prueba confirmatoria se realizó un Western Blot, usando un T. cruzi procesado en Honduras y otro de Costa Rica, mostrando un 0,4% de positividad y un 0,5% de indeterminados. Se muestra patrón de bandas obtenido para las muestras positivas. Se tamizaron 662 sueros de donadores en busca de anticuerpos contra HTLV-1 por medio de un método de aglutinación pasiva de partículas de gel sensibilizadas, obteniéndose 9 aglutinaciones dudosas, que se verficaron por Western Blot y que dieron 0,3% indeterminado por presencia de la banda P21. Se discute la importancia de realizar estas determinaciones de rutina en los bancos de sangre nacionales.

 
Referencias
 
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* Laboratorio Clínico, Hospital Nacional de Niños, San José, Costa Rica.
 
** Centro Internacional de Investigación y Adiestramiento Médico de la Universidad del Estado de Louisiana, sede Tres Ríos, Cartago, Costa Rica (ICMRT). ]]> 1 1993 33 61 2 1993 3 1991 112 195 4 1994 32 2046 5 1995 San José 6 1995 San José 7 1992 66 2456 8 1993 31 14 9 1970 227 680 10 1992 166 1464 11 1992 166 100 12 13 1994 170 206 14 1991 31 547 15 1991 151 2043 16 1995 171 1022 17 1993 64 1 18 1995 35 186