Bacillus thuringiensis es una bacteria Gram-positiva formadora de esporas, que produce cristales parasporales de naturaleza proteica, tóxicos contra diferentes órdenes de insectos y biodegradables e inocuos para otras especies. Esta investigación empleó el modelo experimental, que mediante técnicas de observación permitió, la identificación microbiológica y bioquímica de B. thuringiensis a partir de muestras de suelo de los municipios de Cúcuta, El Zulia, Los Patios, San Cayetano y Villa del Rosario, Norte de Santander, Colombia, y su posterior caracterización con los marcadores moleculares Bc-Rep y MB1. Se identificaron microbiológica y bioquímicamente 10 aislados como B. thuringiensis; los resultados del análisis filogenético mostraron diferencias significativas en los agrupamientos obtenidos con los marcadores Bc-Rep y MB1. Con Bc-Rep se registró un índice de similaridad bajo (18%), mientras que con el marcador MB1 se obtuvo un índice mayor de similitud, 58%. En este trabajo se evidenció una gran variabilidad genética entre los aislados, que mostraron a los marcadores Bc-Rep y MB1 como altamente efectivos para diferenciar cepas estrechamente relacionadas, convirtiéndose en una herramienta genética de gran valor para estudios de identificación y diversidad en B. thuringiensis.
Bacillus thuringiensis is a Gram-positive bacteria forming spores, which produces parasporal crystals of a proteic nature, toxic against various orders of insects and biodegradable and harmless to other species. This research use the experimental model, allowing, through observation techniques, microbiological and biochemical identification of B thuringiensis from soil samples from municipalities of Cúcuta, El Zulia, Los Patios, San Cayetano and Villa del Rosario, Norte de Santander, Colombia, and its subsequent characterization with molecular markers Bc-Rep and MB1. Microbiological and biochemical tests identified 10 isolates as B. thuringiensis; the results of phylogenetic analysis showed significant differences in the clusters obtained with Bc-Rep and MB1 markers. With Bc-Rep a low index of similarity (18%) was recorded, while with the marker MB1 a higher similarity index, 58%, was obtained. This work indicated a great genetic variability among isolates, showing that markers Bc-Rep and MB1 are highly effective to differentiate closely related strains, thus becoming a genetic tool of great value for studies of identification and diversity in B. thuringiensis.
El empleo de insecticidas químicos ha permitido disminuir de forma rápida y eficiente los problemas causados por insectos que actúan como vectores de enfermedades o como plagas en cultivos agrícolas. Sin embargo el uso irracional y excesivo de químicos genera problemas como la contaminación del ambiente, la pérdida ]]>
Bacillus thuringiensis es el insecticida más utilizado para el control de insectos, ya que ha representado aproximadamente el 90% del mercado de biopesticidas, el cual asciende a 600 millones de dólares. B. thuringiensis tiene diversas ventajas que se derivan principalmente de su alta especificidad contra los insectos susceptibles, su inocuidad hacia el medio ambiente, la entomofauna benéfica y demás organismos vivos, incluyendo el hombre, además de una incidencia escasa de fenómenos de resistencia (López y Cerón 2010).
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B. thuringiensis es una bacteria Gram-positiva formadora de esporas que produce una proteína cristal insecticida, compuesta por delta-endotoxinas que son tóxicas para un alto número de insectos plaga y son biodegradables e inocuas para otras especies (Ramírez et ál. 2010). La resistencia presentada por los insectos y la poca persistencia de los biopreparados ]]>
Para la producción de biopreparados se recomienda seguir un control de calidad aplicando los parámetros de identidad, concentración y pureza; la ]]>
B. thuringiensis se siguen procedimientos simples como la descripción de su morfología celular, coloración Gram, análisis de su capacidad para crecer en ]]>
Las ]]>
B. thuringiensis (Lupski y Weinstock 1992).
Esta investigación consistió en la caracterización molecular mediante ]]>
Materiales y Métodos
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Aislamiento e identificación. Se tomaron muestras de 200 g de suelo de pastizales y rizosferas de árboles, a una profundidad de 5 a 10 cm, provenientes de los municipios de Cúcuta, El Zulia, Los Patios, San Cayetano y Villa del Rosario, Norte de Santander. De cada muestra se registró in situ, la localización y las características físicas del sitio de muestreo; y ex situ, se determinó el pH y la textura del suelo. Las muestras fueron secadas a temperatura ambiente (24ºC) durante un día. Para ]]>
B. thuringiensis se utilizó el método descrito por Galvis (2013); la determinación macroscópica y microscópica se hizo con la descripción propuesta por Realpe et ál. (2002); y la identificación bioquímica se realizó con el kit BBL CRYS- TAL Gram Positivo/GP (Becton Dickinson) y los ]]>
B. thuringiensis donadas por Corpoica Tibaitata y la Corporación para la Investigaciones Biológicas (CIB): aizawai, darmstadiensis, kenya, tenebrionis, sandiego, israelensis.
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Caracterización molecular mediante rep-PCR. El ADN de los aislados y las cepas control se obtuvo por medio del kit Wizard Genomic DNA Purification de Promega. Los marcadores y cebadores utilizados fueron Bc-Rep-1 (5’-ATTAAAGTTTCACTTTAT-3’), Bc-Rep-2 (5’-TTTAATCAGTGGGG-3’) (Bartoszewicz et ál. 2013) y M-B1 (5’-TGTACATAAGACGAA- GCCC-3’) (Brumlik et ál. 2001). Las ]]>
2, 1 μM de cada oligonucleótido y 2 μl del ADN aislado. Los ciclos de amplificación usados para la rep-PCR fueron: desnaturalización inicial a 94ºC por 5 min, seguidos de 32 ciclos de 94ºC por 1 min, 42ºC por 1 min, y 72ºC por 1 min y 30 s; y una extensión final de 72ºC por 7 min. Los perfiles de bandas se separaron por electroforesis en geles de agarosa al 1,4% por 3 h a 50 V, y teñidos con bromuro ]]>
Resultados y Discusión
Aislamiento e ]]>
Se recolectaron 45 muestras de suelo de los municipios de Cúcuta, El Zulia, Los Patios, San Cayetano y Villa del Rosario, Norte de Santander. Los suelos muestreados fueron de textura predominante arcillosos–arenosos y con un rango de pH entre 4,5 y 9,7. Se seleccionaron 10 aislados por presentar las siguientes características: 1. Morfología predominante para B. thuringiensis (colonia mediana a ]]>
Los 10 aislados se identificaron como
B. cereus con BBL CRYSTAL, y debido a que B. cereus y B. thuringiensis son bioquímicamente idénticos, diferenciándose únicamente por la producción del cristal parasporal, se confirma que estos aislados pertenecen a esta especie. En la ]]>
B. thuringiensis, los aislados BtNS2, BtNS4, BtNS6, BtNS7, BtNS9 y BtNS10 poseen un 100% de similitud bioquímica con B. thuringiensis var. Kurstaki; el aislado BtNS8 mostró relación con B. thuringiensis, var. Israelensis; y los aislados BtNS1 y BtNS3 no presentan relación con las variedades comparadas.
Caracterización molecular. Las amplificaciones con el marcador Bc-Rep mostraron patrones con pocas ]]>
Figura 1). Las bandas ubicadas a 1700 y 1100 pb presentan mayor similitud entre los aislados, pero están ausentes en algunos de ellos, por esta razón también se consideran polimórficas.
Los patrones ]]>
Figura 2). Todos los aislados, menos BtNS1 y BtNS2, comparten una banda de 1400 pb, que también está presente en los controles
B. thuringiensis var. Tenebrionis, B. thuringiensis var. Berliner, B. thuringiensis var. San ]]>
B. thuringiensis var. Israelensis. Las bandas de 1000 y 500 pb están presentes en todos los aislados menos en el BtNS1.
Análisis ]]>
El análisis con el marcador Bc-Rep generó 4 clusters, donde los clusters I, II y III se agrupan con una similitud de 18%. El aislado BtNS7 no tiene ninguna similitud con todos los demás aislados y controles. En el cluster I los aislados BtNS4, BtNS5, BtNS6 y el control B. ]]>
var. Darmstadiensis com- parten un 100% de similitud. En el cluster II los aislados BtNS1 y BtNS2 tienen una similaridad de 80%. Los controles B. thuringiensis var. Tenebrionis y B. thuringiensis var. Berliner ]]>
73% de similitud con el control B. thuringiensis var. San diego (Figura 3). ]]>
El análisis filogenético para los aislados nativos y controles con el marcador MB1 gene- ró 4 clusters. Todos los aislados presentan una similaridad de 58%. En el cluster I el aislado BtNS6 y el control B. thuringiensis var. Aizawai comparten un 72% de similaridad. En el cluster II se agrupan 10 muestras con un coeficiente de similitud del 77%. Los aislados BtNS1 y BtNS8 comparten una similaridad de 97% entre sí, y un 89 y 87% con los controles B. thuringiensis var. Berliner y B. ]]>
var. San diego, respectivamente. Los aislados BtNS4 y BtNS5 tienen un 100% de similitud, y los 2 comparten un 94% con el aislado BtNS3. En el cluster III los aislados BtNS9 y BtNS11 comparten 100% de similitud; y estos 2 con B. thuringiensis var. Israelensis tienen un 82% de similaridad. En el cluster IV solo se encuentra el aislado BtNS10 que comparte un 71% de similitud con los ]]>
Figura 4).
La rep-PCR es una técnica útil para estudios de variabilidad genética en aislados de B. thuringiensis provenientes de diversas fuentes, que ofrecen ]]>
En este trabajo la rep-PCR mostró clara- mente distintos patrones de amplificación para todas las cepas, con pocas bandas comunes entre algunos aislados y controles. El análisis filogenético con Bc-Rep ]]>
B. thuringiensis inclusive, ]]>
B. thuringiensis mediante rep-PCR con el marcador Bc-Rep, obtuvieron una similitud de 12% entre las variedades israelensis y aizawai de
B. thuringiensis. Este porcentaje de similitud es semejante al obtenido en este trabajo, 18%, a partir de los mismos cebadores y entre las mismas variedades de B. thuringiensis.
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El marcador MB1 permitió mayor con- fiabilidad en el agrupamiento de los aislados, y generó una similitud del 58%. Brumlik et ál. (2004) también utilizaron MB1 para caracterizar diferentes especies del grupo de B. cereus (
B. cereus, B. anthracis y B. thuringiensis) y obtuvieron un coeficiente de similitud entre todos los aislado del 30%. En este trabajo el porcentaje de similitud con MB1 fue mayor, 58%, debido a que solo fueron ]]>
B. thuringiensis, identificados bioquímicamente.
Finalmente este trabajo mostró que la mayoría de los aislados presentaron diferentes patrones de bandas a pesar de haber sido aislados en la ]]>
B. thuringiensis y el alto poder de discriminación que poseen los marcadores Bc-Rep y MB1, que permiten establecer diferencias a nivel interespecifico. A pesar de esta variabilidad genética, presentada entre los aislados de
B. thuringiensis, se observó que tanto el marcador Bc-Rep como MB1, permitieron el agrupamiento de los aislados BtNS4 y BtNS5 con el control B. thuringiensis var. Darmstadiensis. Estos aislados podrían ser analizados mediante bioensayos o caracterización de genes cry y cyt, para probar su potencial como bioinsecticidas contra ]]>
Literatura Citada
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*Correspondencia: Correo electrónico: he.galvis@mail.udes.edu.co *Grupo de Investigación Biogen, Universidad de Santander, Cúcuta, Norte de Santander, Colombia. Autor para correspondencia. **Grupo de Investigación Majumba, Universidad Francisco de Paula Santander, Cúcuta, Norte de Santander, Colombia.