Resumen
Se investigó la actividad del citocromo lA2 según sus siglas en inglés (CYP 1A2) en una población estudiantil de la Universidad de Costa Rica. Dicha enzima, de localización básicamente hepática, es importante en el metabolismo de una serie de fármacos de interés clínico, así como en la activación de sustancias pro-cancerígenas. El estudio utilizó como droga sonda la cafeína y una razón de sus metabolitos, detectados en orina, para la valoración de la actividad del CYP 1A2. La población estudiada, 93 sujetos provenientes principalmente de la provincia de San José, muestra una distribución unimodal sin diferencias en cuanto a sexo o edad, como es de esperar. Los valores de la razón de la "CYP lA2" oscilan entre 0,61 y 9,0 con un promedio de 4,4. Las variaciones que pueden mostrar los individuos en los niveles plasmáticos de fármacos con este tipo de metabolismo, si las hay, no deberán atribuirse simplemente a las diferencias metabólicas hepáticas o a la edad. Deberán buscarse en otros factores que puedan cambiar el metabolismo y la respuesta terapéutica como una hepatopatía, tabaquismo, consumo de anticonceptivos, fármacos inductores o inhibidores y grupo étnico. Para tratar de responder estas inquietudes se están realizando en este momento otras investigaciones. Además, la actividad hepática del CYP 1A2 no debe considerarse, por si sola, como un factor de riesgo que incline la balanza del cáncer hacia uno u otro sexo. (Rev Costarric Cienc Med 2002; 23: 25-31)
Palabras clave: actividad CYP 1A2, sustancias cancerígenas.
]]>
The activity of the citocromo 1A2 was investigated according to its initials in English (CYP 1A2) in a student population of the University of Costa Rica. This enzyme, of basically hepatic localization, is important in the metabolism of a series of drugs of clínical interest, as well as in the activation of pro-cancerigenic substances. The study used like drug sounds out the caffeine and a reason of its metabolites, detected in urine, for the valuation of the activity of the CYP 1A2. The studied population, 93 coming fellows mainiy of San José's county, it shows a distribution unimodal without differences as for sex or age, like it is of waiting. The values of the reason of the CYP 1A2 oscillate between 0,61 and 9,0 with an average of 4,4. The variations that the individuals can show in the plasmatic levels of drugs with this metabolism type, if there are them, they won't simply be attributed to the hepatic metabolic differences or the age. They will be looked for in other factors that can change the metabolism and the therapeutic answer as a hepatic pathology, tobacco, consumption of contraceptive, inductions or inhibitors drugs and ethnic group. To try to respond these restlessness they are being carried out other investigations at this time. Also, the hepatic activity of the CYP 1A2 should not be considered, for if alone, as a factor of risk that inclines the scale of the cancer toward one or another sex.
Key Words: CYP 1A2 activity, cancerigenic substances
Introducción
El estudio de los diferentes citocromos es un tema muy avanzado en otros países, pues se reconoce la función de estos, en el mantenimiento de las concentraciones de medicamentos en la sangre y su relación con el efecto terapéutico. Además, el estudio de las vías metabólicas y/o citocromos que afectan a un medicamento es primordial cuando se emplean dos o más de ellos, pues este conocimiento permitiría excluir la posibilidad de que se presenten interacciones metabólicas ya sean de inhibición o de inducción. El estudio de los citocromos a cobrado relevancia ya que algunos de ellos presentan polimorfismos e introducen variaciones en la población con respecto al grado de biotransformación de un determinado medicamento o xenobiótico, lo que explica, en parte, las variaciones en la respuesta individual a los medicamentos.
El CYP 1A2 es una enzima importante en el metabolismo de una serie de medicamentos de uso clínico como: teofilina, clozapina, imipramina, tamoxifeno, acetaminofén, ciomipramina, fluvoxamina, amitriptilina, warfarina y propranolol entre otros (1,2) y representa el 13% de la cantidad total de citocromo detectado en el hígado (3,4). Además, esta enzima puede estar sujeta a fenómenos de inducción, aumento de su actividad, por fármacos como rifampicina, primidona, carbamazepina, fenobarbital y por factores ambientales como el humo del cigarrillo (5). También su actividad puede ser inhibida o reducida por medicamentos como fluvoxamina, ciprofioxacina, norfloxacina y anticonceptivos orales (6, 7). En resumen esta es una de las enzimas más importantes relacionada con el metabolismo de medicamentos. Este es el primer informe realizado en una muestra de una población universitaria, en el cual se evalúa la actividad de CYP 1A2.
Materiales y métodos
La investigación cumplió con los lineamientos y requerimientos que exige la Vicerrectoría de Investigación de la Universidad de Costa Rica (NE-42297-273, número de proyecto inscrito). Para el análisis de esta enzima se seleccionaron 93 voluntarios, de entre la población de estudiantes de las Escuelas de Enfermería y Medicina; así como asistentes y personal docente del Departamento de Farmacología de la Universidad de Costa Rica, reclutados entre el período de 1998 al 2000. Todos los voluntarios dieron su aprobación por escrito firmando una carta de consentimiento informado. No se tomaron en cuenta sujetos que estaban expuestos a factores que modifican la actividad del CYP1A2 y podrían introducir un sesgo en los resultados finales; a saber: medicamentos (anticonceptivos, primidona, teofilina), fumado de cigarrillos y consumo frecuente de carne a la parrilla. En el caso de las mujeres no se tomó en cuenta para los cálculos las mujeres consumiendo anticonceptivos, pues incluso anticonceptivos con bajos niveles hormonales pueden reducir la actividad del CYP1 A2. Durante el interrogatorio ningún voluntario refirió una enfermedad hepática o de cualquier tipo que se conozca altere la actividad del CYF>1 A2. ]]>
El estudio utilizó como droga sonda la cafeína. Esto con el fin de determinar cuantitativamente los metabolitos de cafeína producidos por los diferentes voluntarios, lo cual se relaciona con la actividad particular de la enzima en los sujetos de estudio. A los voluntarios se les solicitó, dos días antes de realizar la prueba, no ingerir ninguno de los siguientes medicamentos: Cheracol, Cafergot, Migretil, Avamigran, Tonopam, Hemicraneal, Tiamina plus y Neuraigina, ni bebidas como café, té negro, chocolate, Coca Cola, Kino Kola, mate y Pepsi Cola ya que podrían contener cafeína, lo que causaría interferencias en el estudio. Para controlar el cumplimiento de no ingestión de medicamentos o bebidas con cafeína antes de la prueba, los sujetos debieron entregar una muestra de orina antes de consumir la cafeína para el estudio. Esta muestra de orina llamada orina blanco (ver en análisis), que se obtuvo después de dos días de ayuno de cafeína, fue analizada por el procedimiento descrito más adelante y si se encontraron en el cromatograma picos correspondientes a los metabolitos de cafeína el sujeto fue descartado del estudio, pues sería una indicación de que no cumplió a cabalidad con los requerimientos de la investigación. Además, a todos los participantes se les impartió una conferencia acerca de la investigación y los requisitos que se exigían con el fin de motivarlos a cumplir adecuadamente.Para que una sustancia sea utilizada como sonda para la determinación de un citocromo tiene que cumplir varias características como son: inocuidad, alta biodisponibilidad y ser metabolizada en alto grado por la enzima que se pretende estudiar. Todas estas características las cumple la cafeína. Además, es una de las pocas sustancias con una biodisponibilidad cercana al 100%. Por estas razones es muy utilizada en la determinación del CYP 1A2 (8 - 11).
En la mañana del día de la prueba los voluntarios debieron consumir 150mg de caFeína pura grado USP con suficiente agua. Previo a ello debieron obtener unamuestra de orina, de la primera orina de la mañana, de 10 ml (orina blanco). Durante las próximas 56 horas pos, ingesta de cafeína se recolectó toda la orina. Seguidamente, de una aliquota ajustada a pH 3-4 con ácido acético se tomaron 50 µl, que se mezclaron con 50 µl de sulfato de amonio, solución saturada, y con 20 µl de 4-acetamidophenol (lmM) como estándar interno. Después, se mezcló por 10 segundos, en el nivel uno, en un vortex (Genie 2, Scientific lndustries INC, USA). Los metabolitos de cafeína producidos por la enzima se extrajeron con 2ml de una mezcla de cloroformo/2-isopropanol (80:20V/V) y se agitó por 5 min en el vortex (nivel l). A continuación se centrifugó a 2500 g (angle centrifuge, Hamilton Bell Co. USA) por cinco minutos. Se separó la fase orgánica (parte inferior) y se evaporó a sequedad en una corriente de nitrógeno gaseoso a 40°C. La fase fue reconstituida con 0,5ml de ácido acético al 0,05%. 20 µl de la fase reconstituida fueron inyectados en un cromatógrafo de líquidos Shimadzu (bomba LC-6A, detector UV/V SPD2A y chromatopac C-R3A, Japón). La fase móvil consistió de una mezcla de ácido acético 0,05%/metanol (93:7V/V). Los metabolitos de cafeína fueron eluidos isocraticamente a 1 ml/min. La longitud de onda utilizada fue de 280 nm. La columna de separación fue una Beckman Ultrasphere ODS, de 25 cm x 4.6 mm x 5 µm, con una precolumna en línea; Ultrasphere C18 2 cm x5 µm (Alltech 96279 IL, USA). Los metabolitos de cafeína analizados se listan en el cuadro 1.
De todos estos metabolitos se utilizaron para este análisis: l-MX, l-MU, 1-7DMU y el AFMU. Una razón molar de estos metabolitos descritos por la literatura internacional es la que se utiliza para calcular la actividad del CYP 1A2 (12 - 14).
La razón molar utilizada fue la siguiente (15,16):
CYPlA2= AFMU+1-MX+1-MU
1,7 DMU
Como fue una población universitaria la estudiada la mayoría de los voluntarios eran jóvenes con edades comprendidas entre 19 y 24 años. El promedio de la población estaba en 23,5 años (19 - 39 años) con una moda de 21 y una mediana de 22. El 54,8% de la población tenía una edad, en el momento del estudio, que oscilaba entre 19 y 22 años. La principal área de atracción de la Universidad de Costa Rica es la gran área metropolitana y eso se reflejó en la composición de los participantes, siendo más notoria la participación de la provincia de San José.
En el eje Y está representada la frecuencia para un determinado valor, es decir el número de veces que se repite ese valor. En el eje X se representa el resultado de la razón molar utilizada para calcular la actividad del CYP1A2. Los valores de la distribución de la razón del CYP1A2 oscilan entre 0,61 el más pequeño y 13,34 el más grande, con un promedio de 4,4. El 94,6% de la población estudiada presenta un valor entre 0,61 y 9,0, míentras el 52,7% de los valores de la razón analizada se sitúan entre 2,5 y 5,0.
El valor más pequeño, que presenta el grupo de las mujeres es de 0,61 y el más grande es de 8,75, mientras que el valor más pequeño en el caso de los hombres es de 0,88 y el más grande de 13,34. La distribución del CYP1A2 se normalizó al transformar los datos con logaritmos (17), según lo demuestra la prueba de Kolmogorov - Smirnov (D=0,098<0,111 =p>0,2). ]]>
Si se separa la distribución total en hombres y mujeres se observa que la cola de la derecha esta compuesta principalmente por valores de los hombres. Es decir, los valores mayores son de los hombres, lo que se demuestra en la segregación de valores por sexo mostrada en el cuadro 2.Utilizando una prueba de student para los valores normalizados no fue posible establecer una diferencia estadísticamente significativa para los promedios de los hombres y las mujeres (p>0,05).
También se estudió la relación entre la edad y la actividad de la enzima tanto para hombres como para mujeres. No se encontró ninguna correlación entre la edad (hombres y mujeres) y la actividad de la enzima, con respecto a una disminución en la actividad del CYP1A2, durante el periodo de estudiado.
Discusión
Para evitar el efecto inductor del humo del cigarrillo u otra sustancia y el efecto inhibidor sobre el CYP1A2 de los anticonceptivos, los voluntarios consumiendo estas sustancias no fueron tomados en cuenta para los análisis. Además, no se tomaron en cuenta personas cuyos padres no fueran nacidos en Costa Rica. La razón de los metabolitos de cafeína utilizada en el estudio es la que mejor refleja la actividad de la enzima y es la más empleada internacionalmente para este tipo de estudios.
El gráfico de la figura 1 muestra una distribución que se aleja de la normal, sobre todo por la cola hacia la derecha que presenta el gráfico. Según la prueba de Kolmogorov-Smirnov la distribución no era normal (D = 0,19 > 0,17; p < 0,01), pero cuando se le aplicaron logaritmos a los mismos valores y se graficó de nuevo se logró la normalidad. La distribución de la actividad del CYP1A2 en la población universitaria estudiada es unimodal. Estos hallazgos concuerdan con los obtenidos en otros países donde la mayoría de los estudios revelan que el CYP 1A2 no presenta polimorfismo, sino más bien una distribución de un solo pico (12, 14, 18), aunque otras distribuciones también han sido descritas (14). El promedio de la actividad del CYP1A2, encontrado en nuestro estudio, es de 4,4 similar al que revelan estudios europeos de 4,1 y 4,22 (14, 18) o canadienses de 4,7 (8). Esto puede ser el resultado de la mayor cantidad de personas de etnia blanca y descendientes europeos de la población de estudio.
Cuando el histograma se separa en hombres y mujeres se observa que son los hombres los que cuentan con los valores más grandes (hombres x = 0,63; mujeres x = 0,54), pero la diferencia de los promedios de los valores normalizados no fue estadísticamente significativa (p >0,05). Esto induce a pensar que no existe diferencia real en cuanto a la capacidad metabólica del CYP1A2 en hombres y en mujeres. Otro factor importante del estudio es lo relacionado al efecto de la edad sobre la actividad de esta enzima, sobre todo pensando en una disminución del trabajo del CYP1A2 que pudiera relacionarse a mayores niveles en sangre de fármacos metabolizados por esta enzima. No se encontró ninguna correlación, entre hombres y mujeres, entre la edad y el valor de la actividad del CYP1A2, durante el período estudiado, ya que la juventud de los voluntarios no permitía un análisis más extenso. Probablemente si se estudiaran poblaciones de edades más extremas surgiría algún tipo de correlación. Sin embargo, científicos de otros países que han investigado poblaciones con edad muy extrema no han encontrado diferencias significativas entre la actividad del CYP1A2 y la edad (8). ]]>
Agradecimientos
Este estudio fue realizado gracias a la colaboración del Ministerio de Ciencia y Tecnología (MICIT) y del Consejo Nacional para Investigaciones Científicas y Tecnológicas (CONICIT). A los laboratorios Raven de Costa Rica por la donación de la Cafeína empleada en el estudio. A la señora Vilma Sandí asistente de laboratorio del Departamento de Farmacología de la Escuela de Medicina de la UCR.
Referencias
1- Gerhardt N, Jürgen F, Götz-Erik T. Psychopharmaka im Kindes-und Jugendalter. Editorial (Verlag) Gustav Fischer. Stuttgart, Alemania. 1998. Pag 105-106. [ Links ]
2- Charles L, Armstrong L, Goldman M y Lance L. Drug lnformation Handbook. Novena edición. LexiComp. 2001-2002. Pag 1377. [ Links ]
3- Li AP, Malle JR. Overview: Pharmacokinetic Drug-Drug Interactions en: Advances in Pharmacology. Editores: August Thomas, Anders W., Murad Ferid y Coyle Joseph. Editorial Academic Press, San Diego. 1997;43:1-6. [ Links ]
4- Anderson G. A mechanistic approach to antiepileptic drug interactions. Ann Pharmacother 1998; 32:554-63. [ Links ]
5- Kalow W, Tang BK. Caffeine as a metabolic probe: Exploration of the enzyme-inducing effect of cigarrette somoking. Clin Pharmacol Ther 1991; 49:44-48. [ Links ]
6- Brosen K. Drug interactions and the cytochrome P450 System. Clin Pharmacokinet 1995; 29 (Suppl 1): 20-25. [ Links ]
7- Abernethy, Todd. lmpairment of caffeine clearence by chronic use of low-dose oestrogen-containing oral contraceptives. Eur J Clin Pharmacol 1985;28:425-428. [ Links ]
8- Campbell M, Spielberg S, Kalow W. A urinary metabolic ratio that reflects systemic caffeine clearance. Clin Pharmacol Ther 1987;42:157-65.
9- Grant D, Bing-Kou T, Kalow W. Variability in caffeine metabolism. Clin Pharmacol Ther 1983; 33: 591-602. [ Links ]
10- Kalow W, Bing-Kou T. The use of caffeine for enzyme assays: A critical appraisal. Clin Pharmacol Ther 1993;53: 503 -514. [ Links ]
11- Bing-Kou T. An alternative test for acetylator phenotyping with caffeine. Clin Pharmacol Ther 1987; 42:509 -513. [ Links ]
12- Kalow W, Bing-Kou T. Use of caffeine metabolic ratios to explore CYP1A2 and xanthine oxidase activities. Clin Pharmacol Ther 1991; 50:508 -19. [ Links ]
13- Fuhr U, Rost KL Engelhardt R et al. Evaluation of caffeine as a test drug for CYP1A2, NAT-2 and CYP2E1 phenotyping in man by in vivo versus in vitro correlations. Pharmacogenetics 1996; 6: 159-176. [ Links ]
14- Catteau A, Bechtel YC, Poisson N et al. A population and family study of CYP1A2 using caffeine urinary metabolites. Eur J Clin Pharmacol 1995; 47:423-430. [ Links ]
15-Notarianni J et al. Caffeine as a metabolic probe: a comparison of the metabolic ratios used to asses CYP1A2 activity. Br J Clin Pharmac 1995; 39:65-69. [ Links ]
16- Denaro C et al. Validation of urine caffeine metabolite ratios with use of stable isotope-iabeled caffeine clearance. Clin Pharmacol Ther 1996; 59:284 -296. [ Links ]
17- Sachs L, Angewandte S. 7 edición Springer-Verlag, Alemania. 1992. [ Links ]
18- Rasmussen B, Brosen K. Determination of urinary metabolites of caffeine for the assessment of cytochrome P4501A2, xanthine oxidase and N-acetyltransferase activity in humans. Therapeutic Drug Monitoring 1996; 18:254-262. [ Links ]
* Depto. de Farmacoloqía, Escuela de Medicina, Universidad de Costa Rica. ]]>
