Resumen

La determinación de la actividad de las colinesterasas en sangre en trabajadores agrícolas es un valioso indicador de exposición a plaguicidas organofosforados y carbamatos. La actividad debe medirse antes y después de la aplicación de estos productos. Los resultados indican la magnitud de la exposición y así proporcionan una base para aconsejar las medidas a tomar, particularmente en el caso de actividades muy deprimidas. Para propósitos de bio-verificación, es recomendable el análisis de la acetilcolinesterasa eritrocítica y de la colinesterasa plasmática.

En este estudio se determinaron valores de referencia de la actividad de colinesterasa plasmática y eritrocítica en mujeres, hombres y niños y niñas, costarricenses aparentemente sanos, sin exposición previa a plaguicidas, empleando métodos cinéticos basados en la reacción de Ellman. El intervalo de referencia obtenido para la actividad de colinesterasa plasmática en 139 mujeres y 134 hombres con edades entre 17 a 75 años fue de 3 700 a 9 700 UI/L y 4 500 a 9 900 U/L, respectivamente. En 50 niñas (de 6 a 13 años) fue de 3 820 a 9 100 UI/L y en 50 niños (de 6 a 13 años) fue de 4 660 a 9 160 UI/L. Los intervalos de referencia obtenidos para la actividad de colinesterasa eritrocítica corregida por hemoglobina en mujeres, hombres, niñas y niños fueron de 26,1 a 40,9 UI/g Hb; 26,2 a 41,8 UI/g Hb; 24,6 a 37,7 UI/g Hb y 25,9 a 39,3 UI/g Hb, respectivamente.

Se recomienda emplear los valores de la actividad colinesterasa plasmática y eritrocítica (corregida por hematocrito o hemoglobina) obtenidos en esta investigación como intervalos de referencia nacionales. (Rev Cost Cienc Med 2000; 21(3-4):.........) ]]>  

Palabras clave

colinesterasa plasmática, colinesterasa eritrocítica, valores de referencia, plaguicidas, organofosforados, carbamatos.
 

Abstract

Determination of blood cholinesterase activity is a valuable indicator of exposure to carbamate and organophosphorus pesticides. The activity can be measured before and after application of these pesticides. The results indicate the extent of exposure and hence provide the basis for advice on measures to be taken, particularly in the case of highly depressed activity levels. For biomonitoring purposes, determination of both erythrocyte acetylcholinesterase and plasma butyrylcholinesterase activity is recommended.

In this study, reference values for plasma and erythrocyte cholinesterase activities were determined on apparently healthy Costa Rican females, males and children of both sexes, without occupational exposure to known cholinesterase-inhibitors. Kinetics methods based on Ellman's colorimetric technique were used.

Plasma cholinesterase activity ranged from 3 700 to 9 700 U/L in females (17 to 75 years, n = 139); from 4 500 to 9 900 U/L in males (17 and 75 years, n = 134), in girls (6 to 13 years, n = 50) ranged from 3 820 to 9 100 UI/L and in boys (6 to 13 years, n = 50) ranged from 4 660 to 9 160 UI/L.

Erythrocyte cholinesterase activity corrected for hemoglobin in females, males, girls and boys ranged (95% percentile range) from 26,1 to 40,9 UI/g Hb; 26,2 to 41,8 UI/g Hb; 24,6 at 37,7 UI/g Hb and 25,9 to 39,3 UI/g Hb, respectively.

The use of these reference values for the costarrican population is recommended. ]]>  

Key words

plasma cholinesterase, erythrocyte cholinesterase, reference values, plaguicides, organophosphates, carbamates.
 

Introducción

Los plaguicidas han tenido un impacto importante en la agricultura y otras áreas, sin embargo, el uso indiscriminado de estas sustancias ocasiona contaminación de aguas, suelo, aire y alimentos, teniendo un efecto negativo sobre la vida silvestre y el hombre (1, 2)

Los organofosforados y los carbamatos producen una toxicidad similar y se asocia con la inhibición de la acetil-colinesterasa, enzima responsable de la interrupción de la actividad biológica del neurotransmisor acetilcolina (3). Dentro de las colinesterasas se incluyen la acetilcolinesterasa (E.C.3.1.1.7) o colinesterasa eritrocítica (AColE) y la acilcolina acilhidrolasa (E.C.3.1.1.8) o colinesterasa plasmática (ColP). La enzima plasmática tiene importancia clínica en la detección de pacientes con formas atípicas de esta enzima, disfunción hepática o intoxicación con plaguicidas (4). En contacto con plaguicidas la actividad de ColP disminuye más rápidamente que la AColE, por lo que la primera es un índice muy sensible para prevenir intoxicación. La determinación de la actividad de la AcolE es importante en los sistemas de vigilancia de intoxicaciones crónicas, por permanecer disminuida mayor tiempo y se considera mejor índice de exposición, ya que se determina la misma enzima que actúa en el tejido nervioso y es menos afectada que la ColP por otras condiciones (3, 4).

Para el control de las intoxicaciones por pesticidas es necesario desarrollar sistemas de vigilancia epidemiológica que permitan monitorear y detectar oportunamente la exposición. Debido a la variación interindividual de la actividad de las colinesterasas, se recomienda determinar el nivel basal de cada individuo antes de su exposición a pesticidas. Sin embargo, en nuestro medio generalmente no se cuenta con este nivel y se hace necesario comparar los valores posexposición con los de referencia. Por lo anterior, es necesario establecer el intervalo de referencia de una población no expuesta, para decidir si se separa preventivamente al individuo del contacto con plaguicidas. Los valores de referencia que se han utilizado en nuestro medio, proceden de literatura extranjera, de poblaciones con estructuras socioeconómicas, sociopolíticas y de salud diferentes a las que se presentan en Costa Rica, así como con diferencias genéticas, que podrían influir en los niveles de colinesterasas. Por esta razón se consideró necesario establecer valores de referencia para ColP y AcolE en población costarricense; lo que podría contribuir a disminuir la morbilidad y mortalidad en zonas agropecuarias. En el presente estudio, se determinaron valores de referencia de ColP y AcolE por métodos espectrofotométricos de verificación continua para hombres, mujeres, niños y niñas en población costarricense. También se realizaron determinaciones de ambas enzimas en población expuesta.
 

Materiales y métodos ]]> 1- Métodos para determinar actividad de ColP y AColE

Para la determinación de la actividad de ambas enzimas se emplearon reactivos de la casa Biotec Internacional, San José, Costa Rica. Ambos métodos se basan en la reacción de Ellman (5, 6). Las pruebas se llevaron a cabo a 30 ºC en un espectrofotómetro Shimadzu UV-160 (Shimadzu, Kioto, Japón).

2- Población

Se obtuvieron muestras de sangre de 273 adultos aparentemente sanos, todos los cuales manifestaron no haber estado en contacto con plaguicidas y cuyas edades oscilan entre 17 y 75 años. De acuerdo a las recomendaciones de la Federación Internacional de Química Clínica, para determinar intervalos de referencia empleando métodos no paramétricos, el mínimo de muestras adecuado es de 120 (7). En este caso se analizaron muestras de 134 hombres y 139 mujeres todos eran residentes del área metropolitana de Costa Rica, y habían acudido como donadores a Bancos de Sangre de los Hospitales de la Caja Costarricense de Seguro Social (CCSS). Los individuos manifestaron no ingerir medicamentos, ni contraceptivos orales, ni presentar enfermedades crónicas. Además se analizaron 100 muestras de menores entre 6 y 13 años (50 niños y 50 niñas), cuyos padres manifestaron que los niños no habían estado expuestos a plaguicidas.

Además se analizaron muestras de trabajadores de plantaciones de banano expuestos principalmente a clorpirifos y etoprop (ambos organofosforados): 45 de aplicadores de plaguicidas y 44 de otros tipos de trabajadores expuestos a plaguicidas en forma directa (embolsadores, recolectores) o indirecta (asesores).

Las muestras de sangre con EDTA se obtuvieron y analizaron el mismo día de la extracción. Para la determinación de la actividad de ColP se utilizó plasma y para la de AColE sangre total. También se determinó el hematocrito (Hto) y la concentración de hemoglobina (Hb) por el método de cianometahemoglobina, para corregir los valores de AColE (ya que esta se encuentra en la membrana del eritrocito) y expresarla en actividad enzimática por mL de glóbulos rojos (corregida por Hto) o en actividad por gramo de Hb (corregida por Hb).

3- Análisis estadístico

Para establecer los intervalos de referencia se utilizaron métodos paramétricos: promedio ± 2 desviaciónes estándar (DE) y métodos no paramétricos (percentiles) de acuerdo a las recomendaciones de la Federación Internacional de Química Clínica (IFCC) (7). Las comparaciones entre grupos se hicieron mediante análisis de variancias (ANOVA).

Resultados

1- Valores de referencia de ColP ]]> En 134 muestras de hombres los valores de ColP variaron entre 4 030 y 11 750 UI/L, con un promedio de 7 000 y una DE de 1 430 UI/L. En las 139 muestras de mujeres la actividad varió entre 3 385 y 10 610 UI/L, con un promedio de 5 818 y una DE de 1 378 UI/L. En los 50 niños los valores variaron entre 4 016 y 11 200 UI/L, con un promedio de 6 134 y una DE de 1 359 UI/L. Para las 50 niñas la actividad fue de 3 606 a 10 900 UI/L, con un promedio de 6 202 y una DE de 1 489 UI/L.

Los intervalos de referencia para la ColP obtenidos por sistemas no paramétricos (percentiles) se presentan en el cuadro 1.

La comparación estadística mostró diferencia significativa (p<0,001) entre los valores obtenidos para hombres y con respecto a los otros tres grupos. Entre mujeres, niñas y niños no hubo diferencia significativa (p>0,05).

2. Valores de referencia de AColE sin corregir

La AColE en hombres varió entre 3 591 y 7 035 UI/L, con un promedio de 5 347 y una DE de 626 UI/L. En mujeres, el valor mínimo observado fue de 3 333 y el máximo de 6 471 UI/L, con un promedio de 4 573 y una DE de 603 UI/L, en niños los límites superior e inferior fueron de 3 254 y 5 818 UI/L, con un promedio de 4 075 y una DE de 565 UI/L. Para las niñas esos valores fueron de 3 364 y 6 035 UI/L, con un promedio de 3 998 y una DE de 552 UI/L.

En el cuadro 1 se presentan los intervalos de referencia para AColE obtenidos por sistemas no paramétricos (percentiles).

La compararación estadística mostró diferencia significativa (p<0,001) entre hombres y los otros tres grupos. Se encontró diferencia significativa (p < 0,001) entre mujeres y niñas y entre mujeres y niños. Entre niños y niñas no hay diferencia significativa (p > 0,05).

3. Valores de AColE corregida por Hto

En hombres el Hto varió entre 35 y 53 mL de glóbulos rojos (GR) por 100 mL de sangre (%), con un promedio de 46 y una DE de 2,95 %. La actividad de AColE corregida por Hto (AcolE/mL de GR por litro de sangre) varió entre 8,9 y 14,8 , con un promedio de 11,6 y una DE de 1,18 UI/mL GR. En mujeres el Hto varió entre 35 y 51, con promedio de 41 y una DE de 3,0 %. La actividad de AColE corregida por Hto varió entre 8,7 y 13,8, con un promedio de 11,1 y una DE de 1,19 UI/mL GR. En niños el Hto varió entre 32 y 45, con un promedio de 38 y una DE de 3,6 %. La actividad de AColE corregida por Hto varió entre 9,0 y 13,9 UI/mL GR, con un promedio de 10,8 y una DE de 1,19 UI/mL GR. En niñas el Hto varió entre 32 y 45, con un promedio de 38 y una DE de 3,5 %. La actividad AColE corregida por Hto varió entre 8,6 y 14,0 UI/mL GR, con un promedio de 10,6 y una DE de 1,2 UI/ mL GR.

En el cuadro 1 se muestran los intervalos de referencia para AColE corregida por Hto obtenidos por sistemas no paramétricos. ]]> La comparación estadística mostró diferencia significativa (p<0,001) entre hombres y los otros grupos. Entre mujeres, niñas y niños no se encontró diferencia significativa (p > 0,05).

4. Valores de referencia de AColE corregida por Hb

En hombres el valor de Hb varió entre 126 y 182, con un promedio de 158 y una DE de 10,7 g/L. La actividad de AcolE corregida por Hb (actividad AColE/g Hb por litro de sangre) varió de 25,3 a 43,8 con un promedio de 33,9 y una DE de 3,59 UI/g Hb. En mujeres el valor de Hb varió entre 113 y 175 con un promedio de 139 y una DE de 11,0 g/L. La actividad de AColE corregida por Hb varió entre 25,5 y 41,5 , con un promedio de 32,9 y una DE de 3,75 UI/g Hb. En niños el valor de Hb varió entre 110 y 160 con un promedio de 129 y una DE de 11,6 g/L. La actividad de AColE corregida por Hb varió entre 25,7 y 41,6 con un promedio de 31,4 y una DE de 3,8 UI/g Hb. En niñas el valor de Hb varió entre 100 y 150 con un promedio de 130 y una DE de 11,7 g/L. La actividad de AcolE corregida por Hb varió entre 22,4 y 40,2 con un promedio de 30,9 y una DE de 3,7 UI/g Hb.

El cuadro 1 muestra los intervalos de referencia para la AColE corregida por Hb obtenidos por sistemas no paramétricos.

La comparación estadística mostró diferencia significativa (p<0.001) entre hombres y los otros grupos. Entre mujeres, niñas y niños no se encontró diferencia significativa (p > 0,05).

5. Correlación entre ColP y AColE

Al realizar un análisis de correlación (373 individuos normales) entre ColP y AColE se demostró una amplia dispersión con un coeficiente de correlación (r) de 0,156 y un coeficiente de determinación (r²) de 0,024.

6. Correlación entre AColE sin corregir y corregida por Hto.

Se realizó un análisis de correlación entre AColE sin corregir y corregida por Hto (373 individuos normales). Se observó una correlación moderada (r = 0,783; r² = 0,612 ).

7. Comparación entre actividades de AColE corregida por Hb y corregida por Hto. ]]> El análisis comparativo entre AColE corregida por Hto y corregida por Hb (373 individuos) mostró muy buena correlación, r = 0,945 y r² = 0,893 y una ecuación de regresión lineal: Y = 0,309 X + 1,016.

8. Niveles de ColP y AcolE en trabajadores expuestos a plaguicidas

Se analizaron muestras de 44 trabajadores expuestos a plaguicidas en forma directa (embolsadores y recolectores) o indirecta (asesores y capataces). En este grupo las actividades de ColP variaron entre 2206 y 7446 UI/L, obteniendose un promedio de 4358 y una DE de 1214 UI/L. La AColE varió entre 2734 y 5278 UI/L, con un promedio de 4106 y una DE de 604 UI/L. Los valores de Hb variaron entre 106 y 168 g/L, con un promedio de 140 y una DE de 12,1 g/L. El Hto varió entre 34 y 51%, con un promedio de 43 y una DE de 3,3 %. El valor mínimo de AColE corregida por Hto fue de 7,1 y el máximo de 12,1 UI/mL GR; el promedio fue de 9,6 y la DE fue de 1,29 UI/mL GR.

Veinticinco trabajadores (57 %) mostraron actividades bajas de ColP y 15 (34 %) de AColE corregida por Hto, tomando como valor de referencia 4 500 UI/L y 9,0 UI/mL GR respectivamente. Del total de trabajadores, 36% mostró valores normales en ambas colinesterasas (incluyendo el cien por ciento de los de exposición indirecta) , 30% mostró valores disminuidos en ColP, 7 % en AColE corregida por Hto y 27 % en ambas. En relación a AColE, 18 (41%) de los trabajadores presentaron actividades de la enzima sin corregir menores a 4 000 UI/L. Al corregir por Hto se presentaron 15 individuos con valores menores a 9,0 UI/mL GR; de estos 14 presentaron actividades sin corregir menores al límite establecido (4 000 UI/L), mientras que uno presentaba actividad superior a este límite. Cuatro de las muestras con actividades sin corregir menores a 4 000 UI/L, presentaron valores corregidos por Hto superiores a 9,0 UI/mL GR. Al corregir por Hb, se obtuvieron 14 valores inferiores a 26,2 UI/g Hb, los cuales coincidían con los valores de AColE corregida por Hto. De las 15 muestras con AColE disminuida, ninguna presentó un porcentaje de inhibición superior al 20 % en relación al límite inferior del intervalo de referencia. Sin embargo, en la actividad de ColP se observaron disminuciones hasta de un 50%.

También se analizaron muestras de 45 trabajadores bananeros expuestos directamente a plaguicidas (aplicadores), los cuales mostraban actividades de ColP menores al límite inferior del intervalo de referencia. La ColP varió entre 1 200 y 4 000 UI/L con un promedio de 2 685 y una DE de 819 UI/L. La AColE varió entre 2 837 y 5 192 UI/L, el promedio fue de 4 266 y la DE de 556 UI/L. La Hb presentó valores entre 114 y 169 (promedio = 151 y DE = 10,8 g/L). El Hto varió entre 33 y 49 % (promedio = 43,9 y DE = 3,1 %). La AColE corregida por Hto varió entre 8,1 y 12,3 UI/mL GR, con un promedio de 9,75 y una DE de 1,18 UI/mL GR. Trece trabajadores presentaron actividades de AColE sin corregir inferiores a 4 000 UI/L. Al corregir por Hto, se presentaron 15 casos con valores menores a 9,0 UI/mL GR y al corregir por Hb, 16 casos presentaron valores inferiores a 16,2 UI/gHb, 15 de los cuales mostraron valores corregidos por Hto inferiores a 9,0 UI/mL GR y uno con valor igual a 9,0 UI/mL GR. De los 13 casos con valor de AcolE sin corregir menor de 4 000 UI/L, 11 presentaron valores menores a 9,0 UI/mL GR y menores a 26,2 UI/g Hb al corregir por Hto y hemoglobina respectivamente. Los dos restantes mostraron valores superiores a estos límites. Además hubo cuatro casos que presentaron actividades sin corregir superiores a 4 000 UI/L, los cuales sin embargo, al corregir por Hto y Hb presentaron valores menores a los límites señalados.
 

Discusión

Muchos de los plaguicidas más tóxicos de uso común en Costa Rica son del tipo organofosforado y carbamato los cuales inactivan la colinesterasa (4, 8). A los trabajadores expuestos a organofosforados se les da seguimiento para identificar a las personas sobreexpuestas y retirarlas temporalmente de la exposición antes de que presenten la sintomatología característica de la sorbreestimulación del sistema nervioso que incluye: dolor de cabeza; vértigo; náusea; ansiedad; irritabilidad; inquietud; debilidad; temblor; calambres abdominales; diarrea; transpiración excesiva; sialorrea; descarga nasal excesiva; visión borrosa; encogimiento de la pupila; descoordinación; contracciones; frecuencia cardiaca más lenta; confusión; incontinencia; hipertensión y en casos severos dificultad para respirar. Afortunadamente, la actividad enzimática disminuye antes de que las personas presenten manifestaciones clínicas y como el organismo constantemente elabora nuevas cantidades de colinesterasa, si una persona sobreexpuesta se retira de la exposición, las colinesterasas se regenerarán (8-10).

Lo ideal es contar con el valor del nivel basal antes de la exposición, para una adecuada interpretación. Ya que en nuestro medio este sistema es difícil de establecer, es recomendable al menos una determinación antes de la exposición. Desafortunadamente, es común encontrar trabajadores expuestos a plaguicidas a quienes no se les ha determinado nivel basal. En este caso, la opción disponible es usar un intervalo de referencia obtenido de personas no expuestas. Al comparar las actividades de las enzimas en trabajadores con el intervalo de referencia se considera que cualquier trabajador con niveles por debajo del mismo debe ser retirado de la exposición y se le debe repetir la prueba semanalmente hasta que el nivel se mantenga constante (9).

En Costa Rica no se contaba con valores de referencia de las actividades de colinesterasa en nuestra población, por lo que se utilizaban los valores establecidos en otros países. Mediante el presente estudio se obtuvieron valores de referencia de la actividad de ColP y de AcolE para hombres, mujeres, niños y niñas (de 7 a 13 años). ]]> Los valores obtenidos en este estudio para la ColP en la muestra de hombres y mujeres adultos costarricenses son más elevados a los informados en la metodología de la casa comercial Merck (2 400 a 8 300 UI/L para mujeres y 2 800 a 9 100 para hombres) (11). Sin embargo, los informados por la casa Boehringer-Mannheim son semejantes a los obtenidos (hombres: 4 300-10 500 UI/L; mujeres: 3 500 – 9 200 UI/L) (8). Los valores informados en menores colombianos (14-17 años) por Henao para AColE corregida por hemoglobina son de 30,5 ± 3,8 UI/g Hb (promedio ± DE) para varones y para mujeres de 30,6 ± 4,49 UI/g Hb (12); los cuales concuerdan con los obtenidos en este estudio para niños y niñas.

Con el empleo de los intervalos de referencia para tomar decisiones clínicas, es importante tener en mente que el resultado obtenido sin nivel basal puede conducir a decisiones erróneas ya que los trabajadores con niveles basales elevados pueden tener una disminución hasta un 30% de su nivel basal y mantenerse dentro del intervalo de referencia y segundo, los trabajadores que tienen normalmente niveles basales bajos pueden presentar disminuciones inferiores al 30% y ser separados de su puesto de trabajo.

Con base en los resultados del estudio de correlación entre ColP y AColE se concluye que no existe relación directa entre las actividades de estas dos enzimas, ya que la ColP es de origen hepático y la AColE se origina principalmente en médula ósea.

Para la verificación de rutina se recomienda la determinación de la AColE para detección de exposición a plaguicidas (8, 9). En este caso, se recomienda hacer una corrección ya sea por Hto o por Hb. A pesar de que hay una correlación moderada entre AColE sin corregir y corregida por Hto o Hb, debe evitarse informar la actividad de ésta sin corregir. Debido a que esta enzima se encuentra en membrana eritrocitaria, las actividades dependen del número de eritrocitos, por lo que en anemias los valores pueden estar disminuidos sin que haya inhibición. También se pueden presentar actividades normales en individuos expuestos a plaguicidas con Hto elevado. Estas posibles causas de error pueden obviarse expresando las actividades en UI/mL GR o por UI/g Hb. Ambos sistemas de corrección son adecuados, ya que desde el punto de vista de interpretación clínica proporcionan resultados semejantes. De 89 trabajadores expuestos a plaguicidas, en el 99% la interpretación clínica coincidió con ambos sistemas de corrección. Si se utiliza como referencia el valor de AColE corregido por Hto o por Hb, se observó que se presentaron 6 falsos positivos y 5 falsos negativos al emplear la AColE sin corregir .

Trabajadores con exposiciones repetidas y prolongadas pueden presentar disminución de ColP, de ColP y AcolE o únicamente de AColE. La primera condición se presenta con exposición reciente leve o moderada, la segunda con exposición continua (varios días) o con exposición aguda sustancial y la tercera refleja pos-exposición (13). Los resultados obtenidos con trabajadores expuestos a plaguicidas demuestran que las tres situaciones se presentan, sobre todo si no se cumplen las normas de seguridad establecidas para este tipo de trabajo.

Se recomienda emplear los valores de la actividad ColP y AColE (corregida por Hto o Hb) obtenidos como intervalos de referencia nacionales.
 

Agradecimiento

El desarrollo de esta investigación ha sido posible gracias al financiamiento de la Agencia Danesa para el Desarrollo Internacional (DANIDA), a través de la Organización Panamericana de Salud (OPS), a cargo de la ejecución del proyecto Aspectos Ocupacionales y Ambientales de la Exposición a Plaguicidas en el Itsmo Centroamericano (PLAGSALUD).
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*Universidad de Costa Rica, Facultad de Microbiología
Departamento de Análisis Clínicos. San José, Costa Rica. Tel. (506)-2075440.
correspondencia:  correo electrónico: mejimene@cariari.ucr.ac.cr
 
  ]]> Cuadro 1

  ^a Límite inferior , ^b Límite superior ]]> 1996 12 25-37 1986 28 619-627 1995 41 1814-1818 1989 746-751 1977 8 41-46 1987 33 1731-1735 1988 XXII 453-472 1991 California Department of Health Services 1988 1992 2 34 - 37 Merck 1990 1992 1, 2 71-72