Resumen
La capacidad de formar biopelículas y la presencia de receptores Fc representan dos de los factores de virulencia fácilmente identificables en las cepas de Staphylococcus. El primero además de facilitar la colonización de superficies, puede incorporar proteínas del hospedero, lo que se traduce en mimetismo ante el sistema inmune, lo cual es magnificado por la presencia de receptores Fc que incorporan inmunoglobulinas a la superficie de la bacteria.
Ambos factores de virulencia se evaluaron en 57 cepas de Staphylococcus (29 S. aureus y 28 S. epidermidis) aisladas de casos clínicos y en 64 cepas de S. epidermidis aisladas de individuos sanos. La biopelícula se evidenció mediante tinción con safranina del tubo de cultivo y los receptores Fc mediante hemaglutinación de eritrocitos del grupo A sensibilizando previamente las bacterias con suero anti grupo sanguíneo A.
Los receptores Fc se identificaron en el 79% de las cepas de S. aureus y en el 89 % de S. epídermídis aisladas de casos clínicos y solo en el 41% de las aisladas de individuos sanos. La producción de biopelícula se evidenció en el 45% y el 32% de S. aureus y S. epidermidis respectivamente aisladas de casos clínicos, y en el 74% de las cepas aisladas de individuos sanos.
La gran proporción de individuos sanos con cepas con potencialidad para colonizar superficies internas, llama la atención en la necesidad de extremar las medidas de asepcia en procesos de venipunción y en la implantación de catéteres. ]]>
Staphylococcus aureus, S. epidermidis, biopelícula, receptores Fc.
Abstract
Biofilm production and the presence of Fc receptors in Staphylococcus are virulence factors easily detected in vitro. The former allows colonization of internal surfaces and incorporates host proteins, that protect the bacteria from the immune system. This effect is increased with the presence of Fc receptors that cover the bacteria with immunoglobulins. However in a recent paper, we demonstrated that Staphylococcus with this factors were efficiently phagocitated by poly morphonuclear leukocytes.
Both, biofilm production and the presence of Fc receptors, were evaluated in 57 strains of Sta phylococcus (29 S. aureus and 28 S. epidermidis) and 64 strains of S. epidermidis isolated from health persons. The biofllm was evidenced by safranin staining in the culture tubes. The Fc receptors were tested by haemagglutination, using A type erythrocytes that attached to homologous anti group A antibodies previously linked to the Fc receptors of the bacteria.
Fc receptors were evidenced in 79% of the strains of S. aureus and 89 % of S. epidermidis from clinical cases, and only in the 41% of S. epidermidis from healthy persons. Biofilm was detected in 45% of S. aureus and 32% of S. epidermidis from clinical cases, and in 74% of S. epidermidis from healthy persons.
The high proportion of healthy persons with strains potentially able to colonize internal surfaces emphasizes the need to follow aseptic techniques when drawn when using in dwelling catheters.
Key words
Staphylococcus aureus, S. epidermidis, biofilm, Fc receptors. ]]>
Introducción
La especie del género Staphylococcus tradicionalmente involucrada con patología en humanos ha sido S. aureus, que a la vez es la especie tipo del género (1). Es coagulasa positiva, prueba que unas tres décadas atrás era un criterio importante para segregar las cepas aisladas de muestras clínicas de pacientes, como podría ser por ejemplo un hemocultivo. Según la prueba de coagulasa esas cepas pueden ser positivas, lo que posiblemente corresponde S. aureus y en esa época se pensaba en un organismo virulento, potencialmente patógeno y posiblemente relacionado con el cuadro clínico en estudio; en tanto que si ese aislamiento correspondía a una cepa de Staphylococcus coagulasa negativa (SCN) se asumía que podría tratarse de un contaminante de piel y posiblemente era S. epidermidis, un habitante normal de piel (2, 3).
Ese criterio descrito anteriormente ha cambiado drásticamente, pues el aumento de una población con algún factor de riesgo para infecciones por agentes oportunistas como los SCN ha llevado a un incremento de este tipo de infecciones. Entre esos factores de riesgo figuran los pacientes con tratamientos antineoplásicos, para tolerar transplantes, de soporte en enfermedades de fondo desgastantes, o bien pacientes que deben ser cateterizados por periodos prolongados o bien que sufren del síndrome de inmunodeficiencia adquirido e incluso son secundarias a bacteremias debidas a procesos odontológicos (4). Estas condiciones han hecho que las infecciones severas debidas a SCN sean cada vez más importantes; por ejemplo, se describe que del 74 al 92% de las bacteremias nosocomiales son causadas por cepas SCN (1).
Ese incremento en la importancia de las cepas SCN ha obligado a buscar pruebas sencillas que permitan identificar rápidamente los posibles factores de virulencia en esas cepas. Entre esos factores de virulencia figura la capacidad para formar biopelículas (4-6) o bien la presencia de receptores Fc, que le permiten a la bacteria fijar inmunoglobulinas (lg) por el extremo Fc, lo cual le serviría como camuflaje, permitiéndole evadir la respuesta inmune (7).
En el primer caso, la capacidad para formar películas sobre superficies inanimadas se puede investigar fácilmente mediante métodos de tinción que permitan poner en evidencia la biopelicula formada en las paredes de los tubos de ensayo donde se cultiva la bacteria (4, 5) o se trata de detectar los componentes de esa película ya sea por pruebas serológicas o genéticas (5, 6).
En cuanto a los receptores para inmunoglobulinas, se conoce que algunas cepas de Staphylococcus aureus y de Streptococcus pyogenes han desarrollado proteínas de pared que actúan como receptores para el extremo Fc de las Ig. Las dos proteínas más estudiadas de este tipo son la proteína A en S. aureus (8) y la proteína G en Streptococcus pyogenes (9) y se emplean como herramienta para separar o marcar las IgG (9). La presencia de tales receptores se ha cuantificado mediante hemaglutinación (HA) empleando la prueba descrita en 1991 para microscopia electrónica (10) y modificada para análisis macroscópico (11).
El objetivo de este estudio fue evaluar la prevalencia de la capacidad para expresar receptores Fc y formar biopelículas en cepas de Staphylococcus aisladas de casos clínicos severos y de flora normal de individuos sanos.
Materiales y métodos ]]>
Cepas:Se evaluó la capacidad para producir biopelícula y la presencia de receptores Fc en 57 cepas de Staphylococcus aisladas de casos clínicos (Hospital Nacional de Niños y Hospital San Juan de Dios) 29 correspondieron a S. aureus y 28 a S. epidermidis. Además, se estudiaron 64 cepas de S. epidermidis aisladas de individuos sanos, sin relación alguna con ambientes nosocomiales. Las cepas de individuos sanos se aislaron de la piel del ante brazo izquierdo; para ello se utilizó una torunda estéril humedecida en solución salina, con la cual se restregó un área de aproximadamente 2 cm2 en la región utilizada normalmente para la venipunción. Las torundas se colocaron en caldo nutritivo e incubaron por 24 horas a 350C y luego esos caldos se inocularon por rayado en platos de agar sangre para aislar las posibles cepas de Staphylococcus. Los factores de virulencia evaluados también se investigaron en la cepa Cowan 1 de S. aureus.
Evaluación de la capacidad para formar bio-película:
Cada cepa se inoculó en un tubo con 5 ml de caldo tripticasa soya e incubó por 24 horas a 37 °C. Luego se vació el contenido del tubo y se le agregaron 4 ml de safranina al 2% y se dejó en reposo durante 5 minutos, nuevamente se vació el tubo. La biopelícula se adhiere a las paredes del tubo y se tiñe con la safranina, por lo cual se detecta debido a esa coloración, lo que se confirma microscópicamente como la presencia de materiales adheridos a las paredes del tubo (4,5).
Titulación de receptores Fc:
Se empleó la modificación de la técnica de Yamada et al (7) descrita previamente (11), para lo cual se incuban las bacterias (30min/370C) con suero anti eritrocitos humanos del grupo sanguíneo A. Las bacterias luego se lavan tres veces por centrifugación (5000 rpm/10 min) para eliminar las Ig no adheridas. Estas bacterias se consideran "sensibilizadas con anti A". Para poner de manifiesto la Ig adherida a las bacterias sensibilizadas, se incuban con una suspensión de eritrocitos A, lo que induciría una reacción de HA. Esta reacción se realiza en placas de microtítulo de fondo en U, para ello se adiciona 100 µl de las bacterias sensibilizadas por pocillo y 1000 µl de una suspensión de eritrocitos al 5%, se incuba la mezcla de reacción (30min/370C) y se deja sedimentar para evaluar el patrón de hemaglutinación. Se considera como título de la HA al recíproco de la mayor dilución que muestre una HA evidente. Para titular la concentración de receptores Fc en las células, se emplean diluciones dobles del antisuero.
Resultados ]]>
Discusión
La capacidad de Staphylococcus para producir biopelícula se ha asociado con infecciones nosocomiales, dado que estas cepas pueden colonizar superficies de catéteres o prótesis, formando microcolonias a partir de las cuales pueden liberarse las bacterias al torrente sanguíneo, manteniendo bacteremias por periodos prolongados, lo que se asocia con abscesos en diferentes órganos e incluso con endocarditis.
La biopelícula representa una trama de carbohidratos o glicoproteinas compartida por las bacterias cercanas, que actúa como adherente a superficies en las cuales se forman microcolonias. Además, en esta matriz se incorporan proteínas del hospedero, lo que actúa como camuflaje para las bacterias, que son ocultadas a los mecanismos de defensa (5,6). Además, si esas bacterias también presentan receptores Fc podrán incorporar inmunoglobulinas, lo que incrementará aún más ese efecto de camuflaje (8,11).
Actualmente la búsqueda de pruebas simples que permitan juzgar el potencial de virulencia de las cepas de SCN representa una tarea importante, pues se trata de discriminar las cepas con mayor potencial patogénico de aquellas menos virulentas de la flora indígena (6). En este sentido, la prueba para poner de manifiesto la formación de biopelícula haciendo una tinción simple de ese material adherido al tubo donde se cultivó la bacteria, representa una técnica sencilla, que puede realizarse sin mayores dificultades.
El hecho de encontrar que más del 50% de las cepas analizadas, independientemente de su origen, presentan ambos factores de virulencia investigados llama la atención sobre el peligro potencial que representan, lo cual es más relevante para las cepas de S. epidermidis aisladas de individuos sanos; que además, fueron aisladas del sitio donde usualmente se hace la venipunción. Este hallazgo refuerza la necesidad de extremar los cuidados a la hora de realizar procedimientos que impliquen punción a través de la piel, lo cual cobra importancia en pacientes que deban someterse a cateterismo, pues de acuerdo con estos datos, la piel de un 74% de los individuos sanos estudiados presentaba cepas de S. epidermidís con capacidad para formar biopelícula, lo que significa con capacidad para colonizar superficies.
Referencias
1. Kloos WE, Bannerman TL. Staphylococcus and Micrococcus. 1995: 282-298. En: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH. Manual of Clinica, Microbiology. Gth ed. ASM Press, Washington DC. [ Links ]
2. Friedman RJ. Laboratory methods for studies of bacterial adhesion. J Microbiol Meth 1997;30:141-52. [ Links ]
3. Heilman C, Hussain M, Peters G, Gotz F. Evidence for autolysin mediated primary attachment of Staphyococcus epidermidis to a polystyrene surface. Mol Microbiol 1997;24:1013-24. [ Links ]
4. Schiliever PM, Shands kN, Dan BB, Schmid GP, Nishimura RD. Identification and characterization of an exotoxin from Staphylococcus aureus associated with toxic shock syndrome. J Infect Dis 1981; 143:509-516. [ Links ]
5. Salyers M, Whitt DD. Bacterial pathogenesis. A molecular approach. 1994 p.417. ASM Press, Washington DC. [ Links ]
6. Thomas VL, Sanford BA, Moreno R, Ramsay MA. Enzyme-linked Iectinsorbent assay measures N-acetyl-D-glucosamine in matrix of biofilm produced by Staphyococcus epidermidis. Curr Microbiol 1997;35:249-54. [ Links ]
7. Patrick CC. Coagulase-negative staphylococci: Pathogens with increasing clinical significance. JPediatr 1990; 116:497-507. [ Links ]
8. Lindmark R, Thorén-Tolling k, Sjöquist J. Binding of immunoglobulins to protein A and immunoglobulin levels in Mammalian Sera. J Immunol 1983; 135:25 [ Links ]
9. Kerstrom B, Brodin T, Reis K, Björck L. Protein G: A powerful tool for binding and detection of monoclonal and policlonal antibodies, J Immunol 1985; 135:2589-92. [ Links ]
10. Sauko Y, Matsumoto A, Vehira K, Suda T. lmmunoelectron Microscopy of Fc Receptors on the surface of Clinical Isolates of Streptococci . J Electron Microsc 1991 ;40: 176-80. [ Links ]
11.Hernández F, Rivera P. Receptores Fc en cepas de Staphylococcus. Rev Cost Cienc Med 1998;19:49-56. [ Links ]
1.Facultad de Microbiología, Universidad de Costa Rica, San José, Costa Rica.
2. Servicio de Anatomía Patológica, Hospital Nacional de Niños, CCSS, San José, Costa Rica.
3. Unidad de Microscopia Electrónica, Universidad de Costa Rica, San José, Costa Rica.
* Correspondencia: E. mail: hchavarr@cariari.ucr.ac.cr
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