Resumen

Candida albicans es el hongo relacionado con el mayor número de cuadros clínicos y morbilidad. Su prevalencia ha aumentado con el incremento de la población con factores predisponentes. Entre sus factores de virulencia se asocia la producción de tubo germinativo y de enzimas como la fosfolipasa. Se estudiaron 66 cepas aisladas de muestras clinicas (piel, uñas, mucosa oral, pulmonares, sangre y orina), a cada una se le evaluó el perfil bioquímico, producción de tubo germinativo, clamidosporas, sensibilidad a la cicloheximida y la actividad de fosfolipasa. Todas las cepas produjeron tubo germinativo, micelio sumergido y crecieron a 37°C. Solo dos fueron sensibles a la cicloheximida y el 79% produjeron clamidosporas. La actividad de fosfolipasa fue alta o intermedia en 21% y 43% respectivamente. Las cepas provenientes de piel y anexos tenían poca actividad de fosfolipasa, en tanto que las de sitios internos alta actividad, lo que demuestra que esta enzima puede favorecer la penetración del hongo.

Palabras claves

Candida albicans, virulencia, patogenicidad, fosfolipasa. ]]> Abstract

Candida albicans is the most frequent pathogenic fungus associated with clinical infections. These infections have become more frequent as the population of immunossuppresed patients increased. Virulence factors of C. albicans include germ tube growth and phopholipase production. We studied 66 strains from clinical specimens (skin, nail, oral cavity, respiratory secretions, blood and urine). Each strain was evaluated by means of biochemical profile, germ tube production, chlamidospore production, growth at 37°C, actidione sensitivity and phospholipase activity. All strains produced germ tubes, micelium and growth at 37°C. Only two strains were sensitive to actidione. Phospholipase activity was high in 21% of the strains and intermediate in 43%. The strains from skin and nail had little phospholipase activity, while strains isolated from blood, respiratory secretions and corporal fluids had high activity phospholipase, suggesting a role for phospholipase in fungal spread in tissues.

Key words

Candida albicans, virulence, pathogenic fungus, phospholipase
 

Introducción

Candida albicans es un hongo micelio-levaduriforme, constituyente de la flora indígena del ser humano y se encuentra normalmente en tracto gastrointestinal y genital femenino (1). Se asocia a cuadros patológicos en los que usualmente el hospedero presenta algún factor predisponentes, en el cual hay inhibición de los mecanismos de defensa celular o tisular permitiendo que organismos normalmente comensales, como C. albicans, invadan y causen infecciones. Entre los factores predisponentes se incluye el tratamiento con drogas inmunosupresoras, antibióticos de amplio espectro, drogas anticancerígenas, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) (2), diabetes mellitus y deficiencias nutricionales (3). También el uso de catéteres y procedimientos quirúrgicos se incluyen como factores de riesgo, pues estos representan la puerta de entrada para el hongo a tejidos u órganos internos (1).

Además de C. albicans, el género incluye más de 100 especies. Al menos 10 de ellas se asocian con cuadros clínicos; no obstante, C. albicans es considerada la más patogéna y se relaciona con más cuadros graves e incluso mortales, que el resto de los hongos que usualmente se aislan en el laboratorio clínico (1).

Este agente es capaz de invadir tejidos y evadir la fagocitosis; lo cual, denota un arsenal amplio de factores de virulencia, que se manifiestan en infecciones a en tejidos profundos. Entre esos factores se citan proteinasas (4-6), esterasas (7), proteasas asparticas secretoras (8), la capacidad de adherencia a las superficies de las células de hospedero (9, 10), la producción de tubo germinativo (11-13) y fosfolipasas (12, 14). Esta última la enzima es capaz de catalizar la hidrólisis de fosfolípidos, el mayor componente de las membranas celulares, lo que facilita su penetración a la célula (15); por lo que hay una fuerte correlación entre la presencia de esta enzima y el potencial de patogenicidad de C. albicans (16). La actividad de la fosfolipasa se pone de manifiesto inoculando el hongo en un medio de cultivo rico en fosfolípidos, como lo es un medio enriquecido con yema de huevo; en el cual la hidrólisis de los fosfolípidos se detecta por la formación de un halo de precipitación alrededor de las colonias de Candida. Willianson et. al (17) semicuantificaron la actividad de fosfolipasa mediante un índice resultante del diámetro de la colonia entre el diámetro del halo de actividad. Según ese índice, catalogan las cepas en las que presentan baja actividad si el índice es mayor de 0,61, en actividad intermedia con índice entre 0.41 y 0,6 y con alta actividad sí éste es menor de 0,40.

Algunos investigadores han planteado que las proteinasas y fosfolipasas de C. albicans podrían ser el blanco para reducir su actividad y así bajar la virulencia, sin destruir al hongo (14). Otros factores como la producción de tubo germinativo se han asociado con la capacidad invasiva del hongo, ya que le permite penetrar en el tejido y evadir la fagocitosis (11, 13). ]]> Por otra parte la población con factores de riesgo para infecciones oportunistas, entre las que se incluye la candidiasis, ha aumentado secundariamente al progreso en el tratamiento de enfermedades crónicas debilitantes, de transplantes y al aumento de la sobrevida de pacientes con neoplasias. Sin embargo, en Costa Rica no se ha investigado sistemáticamente la presencia de factores de virulencia en las cepas de C. albicans, las cuales se aislan rutinariamente en nuestros hospitales, por lo que se planteó este estudio.
 

Materiales y métodos

Se estudiaron 66 cepas de C. albicans aisladas de muestras tomadas de diferente regiones anatómicas de pacientes en el Hospital Calderón Guardia. Las cepas aisladas fueron cultivadas en agar glucosado de Sabouraud y se evaluó su perfil bioquímico empleando los sistemas API 20C (BioMérieux) o Vitek (BioMérieux). También se investigó la capacidad para producir tubo germinativo a las tres horas, la producción de clamidosporas por la técnica de Dalmau (18), su crecimiento en Agar Cicloheximida y en Agar Glucosado de Sabouraud a 37ºC. La producción de fosfolipasa se evaluó mediante el índice de actividad descrito por Willianson (17). La técnica consiste en cultivar la cepa en Agar Glucosado de Sabouraud conteniendo NaCl 1 M y CaCl₂ 0,005 M, al cual después de autoclavar se le agregó un 2% de yema de huevo (Bacto Egg Yolk enrichment 50%, 4 ml en 100 ml de agar). De este medio se depositaron 4,5 ml en placas de Petri de 60 mm de diámetro. En cada placa se inoculó una alícuota de 10 µl de una suspención de levaduras. A los 7 y 10 días de incubación a 37 °C, se midió la zona de precipitación alrededor de la colonia y se calculó el índice de actividad con la formula: diámetro de la colonia / diámetro de precipitación con la colonia
 

Resultados

Las cepas de C. albicans analizadas se distribuyeron según el sitio anatómico o tipo de muestra, de la siguiente manera: 33 de las cepas (50%) provenían de tracto respiratorio, 14 cepas (21%) de muestras dérmicas fundamentalmente piel y uñas, 13 cepas (20%) provenían de mucosa oral y 6 (9%) eran de líquidos corporales como orina o sangre. Todas las cepas produjeron tubo germinativo a las tres horas, micelio sumergido y crecieron a 37ºC. Solo dos cepas fueron sensibles a la cicloheximida, una de esputo y otra de una uña de la mano. Cincuenta y dos cepas (70%) produjeron clamidosporas a los 7 días. En el cuadro 1 se muestra la distribución de las cepas según el origen de la muestra y la actividad de la fosfolipasa. El 21% de las cepas presentó una actividad alta, pues presentaron un índice de 0.4 o menor, en tanto que, 43% tenían actividad intermedia o sea entre 0,41 y 0,60 y el 36% presentaron poca actividad con índices mayores de 0,61.
 

Discusión

C. albicans se encuentra como saprófito levaduriforme principalmente en mucosas. Sin embargo, es el hongo aislado más frecuentemente de casos clínicos y se considera la especie más patógena del género, a la cual se le atribuye el mayor número de muertes debidas a infecciones micóticas. Esta especie es resistente a la cicloheximida, por lo que este antibiótico se emplea como un factor selectivo en los medios de cultivo para su aislamiento. Sin embargo, en este informe se encontró que dos de las 66 cepas estudiadas (3,3%) fueron sensibles. Por lo tanto, el uso exclusivo de medios de cultivo con esta sustancia no se recomienda para el aislamiento de C. albicans a partir de muestras clínicas, pues podría, inhibir el crecimiento de algunas cepas sensibles; además, C. albicans es responsable del 60% de las candidiasis, pues el resto son causadas por otras especies del género, la mayoría de ellas es sensible a cicloheximida. ]]> Las candidiasis se desarrollan cuando ocurre un desequilibrio en la relación hospedero – parásito, que favorezca al hongo y le permita invadir otros tejidos más allá de las mucosas donde se mantiene como comensal. Además, sus factores de virulencia le llevan a evadir la respuesta inmune e incluso los tratamientos (2, 15). El factor de virulencia más eficiente en la penetración de tejidos es la producción de hifas (11). Por esa razón, la capacidad para producir tubo germinativo y por ende, desarrollar micelio, se considera uno de los factores de virulencia más importantes en este hongo (13). En la práctica, ésta característica es muy útil en el diagnóstico de laboratorio de esta micosis, ya que el hallazgo de un predominio de hifas en el examen directo es sugestivo de infección; en tanto, cuando predominan las formas de levadura se considera que corresponde a un estado saprófíto.

La capacidad de este hongo para producir hifas es uno de sus mecanismos de invasión; sin embargo, no es un factor suficiente para explicar su éxito como patógeno. Así, que en el proceso infeccioso intervienen otros mecanismos de virulencia, como la actividad de algunas enzimas que favorecen la lisis de membranas que normalmente actúan como barreras mecánicas (11). De esas enzimas, una de las más estudiadas es la fosfolipasa, cuya presencia tiene una fuerte correlación con la virulencia de las cepas de C. albicans; lo que se demuestra, por una letalidad aumentada en los ratones inoculación experimentalmente con cepas con alta actividad de la enzima en comparación con las cepas sin actividad de fosfolipasa (16).

Si se analizan los resultados de la actividad de la fosfolipasa de las cepas de este estudio, según el sitio del aislamiento clínico, se encuentra que todas las cepas aisladas de piel o uñas y que el 84,5 5% de las provenientes de mucosa oral, tenían baja actividad de la enzima; mientras que el 24,5% de las cepas aisladas de esputos y aspirados bronquiales y el 50 % de las aisladas de fluidos corporales, presentaron actividad alta de fosfolipasa. Esto podría correlacionarse en cierta medida con los diferentes estados de infección, ya que las candidiasis sistémicas son más frecuentes en pacientes neutropénicos; en tanto, las candidiasis dérmicas y orales son más frecuentes en pacientes con deficiencias en la actividad de células T; lo que implica, diferentes mecanismos de defensa alterados en los pacientes con esas manifestaciones clínicas, que a su vez, se pueden correlacionar con la expresión de la actividad de la fosfolipasa.

Solo 4 de las cepas estudiadas presentaron un índice de actividad de fosfolipasa de 1, o sea, que no manifestaron la enzima (una de aspirado bronquial, otra de líquidos corporales y dos de uñas), lo que sugiere que la capacidad de C. albicans para causar patología es multifactorial y que no depende exclusivamente de uno o varios factores de virulencia (5). En conclusión, la patogenicidad se debe a la interacción de determinantes epidemiológicos tanto del hospedero como del parásito; obviamente, en este caso, serían más importantes aquellas alteraciones del hospedero que favorezcan al hongo, que por antonomasia se considera un patógenos oportunista.
 

Agradecimientos

Queremos agradecer a Juan Diego Castro, asistente del Laboratorio de Micología por su ayuda técnica y a la Vicerrectoría de Investigación de la Universidad de Costa Rica por el financiamiento de la investigación (proyecto 430-95-235)
 

Referencias

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  ]]> Cuadro 1

*Correspondencia:
Sección de Micología Médica, Facultad de Microbiología, Universidad de Costa Rica.
  ]]> 1991 1992 35 53-56 1978 1990 28 3 -14 200015 ^s4 ^s4 4 238-244 1983 129 431-438 1996 64 2936-2940 2001 69 ^s1 ^s1 1 405-412 2000 573 241-249 1998 1 ^s2 ^s2 2 117-122 1991 34 293-296 2000 43 ^s7-8 ^s7-8 7-8 273-279 1981 144 565- 569 1992 35 9-16 1991 34 217-220 1985 131 1217-1221 1986 24 415-417 1995 3°