Resumen

Leucocitos polimorfonucleares humanos (PMN) expuestos a la alfa hemolisina (AH) de Escherichia coli manifestaron quimioluminiscencia (QL), amplificada mediante el uso de luminol. Los parámetros cinéticos de la QL mostraron semejanza a los de la respuesta quimioluminiscente de PMN al ionóforo de calcio A23187. Dado que las respuestas de PMN a AH y al A23187 se inhiben de manera similar cuando se preincuban con A63612, un derivado del ácido hidroxámico e inhibidor de la lipooxigenasa, es probable que ambas compartan un mecanismo común, el cual es activación de la síntesis de leucotrienos, debida a la entrada de calcio a la célula causada por la hemolisina y el ionóforo. La QL en respuesta a AH es inhibida además por el DMSO, el cual reacciona con radicales hidroxilo producidos por la activación del metabolismo del araquidonato. Esto es evidencia adicional de la relación entre la QL causada por AH y A 23187, y el metabolismo del araquidonato.

Palabras clave ]]> Leucocito polimorfonuclear, Quimioluminiscencia, Alfa hemolisina

Abstract

Escherichia coli alpha hemolysin (AH) evoked a luminol-amplified chemiluminescence (CL) response from human polymorphonuclear leukocytes (PMN). Analysis of kinetic parameters of the PMN CL response to AH established similarities with that of PMN to the calcium ionophore A23187. PMN CL responses to both AH and A23187 were equally decreased by preincubating PMN with A63612, a hidroxamic acid derivative and lipooxigenase inhibitor, showing that the CL response to both hemolysin and ionophore share a common mechanism, probably activation of leukotriene synthesis, due to calcium entry into the cells brought about by AH and A23187. In addition, the CL response of PMN to AH was lowered by the hydroxyl radical scavenger dimethyl sulfoxide, further suggesting arachidonate metabolism is involved in the CL response.

Key words

polymorphonuclear leukocytes, chemiluminescence, alpha hemolysin
 

Introducción

La hemolisina alfa (AH) es una exotoxina secretada por la mayoría de las cepas de E. coli causantes de infecciones extraintestinales ( 1 ). AH es un factor de virulencia, que puede encontrarse junto con otros atributos en las cepas patógenas, a saber, resistencia a la acción lítica del suero, y la presencia de fimbrias de tipo S ( 2, 3 ).

AH se sintetiza como una prohemolisina, y es acilada post - traduccionalmente (4 ), modificación que la convierte en una lipoproteína. Posee, entre otros, un dominio con secuencias repetidas que contienen glicina y especializado en ligar Ca⁺², hecho que explica la dependencia de calcio de la toxina. La acilación de AH y la formación del complejo con iones calcio trae como consecuencia un cambio conformacional que la faculta para insertarse en la membrana de células blanco (5), formando poros funcionales hidrofílicos de vida media limitada (6). Estos poros permiten el movimiento de cationes a través de la membrana, a favor de sus gradientes de concentración. El movimiento iónico despolariza la membrana de la célula blanco, causa alteraciones fisiológicas, y contribuye a agravar progresivamente las lesiones de la membrana hasta ocasionar pérdida de viabilidad en varios tipos de células, entre ellas eritrocitos (7), células endoteliales (8), células epiteliales (9) y leucocitos polimorfonucleares neutrófilos (PMN) ( 10), así como macrófagos (11). Las respuestas de leucocitos expuestos a AH son de mucho interés porque la hemolisina los ataca preferentemente (12) y la disfunción fagocítica resultante puede facilitar el establecimiento y la diseminación de la bacteria hemolítica (12,13).

Una de las consecuencias de la exposición de PMN a la hemolisina es la estimulación del metabolismo oxidativo, que resulta en producción de radicales libres; estos se pueden detectar midiendo, en un contador de centelleo o en un luminómetro, la luz quimioluminiscente (QL) emitida durante la reacción de los radicales con moléculas varias (proteínas, lípidos, otros radicales). La señal quimioluminiscente se amplifica mediante la adición de luminol (o-aminoftalhidrazida) al medio de reacción (13); el luminol reacciona con radicales (superóxido e hipoclorito, peroxinitrito, peróxidos e hidroxilos), oxidándose y emitiendo fotones, lo que amplifica el rendimiento cuántico de la reacción (14-16). A pesar de que la producción de radicales libres es normal durante el proceso de fagocitosis, su activación prematura por parte de AH aumenta la probabilidad de daño tisular debida a los mismos radicales libres (17), y, en conjunto con alteraciones en la fisiología celular, pueden conducir a defectos en quimiotaxis, ingestión y actividad bactericida (13). ]]> Existe abundante información en la literatura acerca de los estimulantes, particulados o solubles, que activan el metabolismo oxidativo en PMN, y la QL resultante (15,18-21); aunque la QL no cuantifica los diferentes tipos de radicales, el patrón de respuesta quimioluminiscente es característico para diferentes estimulantes, ya sean particulados, como zimosán opsonizado, o solubles, como acetato de forbol miristato (PMA, o factor promotor de tumores), péptido quimiotáctico (FMLP, o formil-metionil, leucil, fenilalanina), o el ionóforo de calcio A23187 (16). La comparación de QL inducida por la hemolisina con aquella causada por otros estimulantes puede proporcionar información acerca de cómo la hemolisina activa el metabolismo oxidativo en PMN. De hecho, la investigación presentada en este trabajo evidencia que la alfa hemolisina estimula el metabolismo oxidativo de PMN de una manera similar, aunque no idéntica, a la del ionóforo de calcio A23187.
 

Materiales y Métodos

Cepas de Escherichia coli

Las cepas usadas en esta investigación fueron donadas por el Dr. R.A. Welch (U. of Wisconsin, Madison, WI), y son derivadas de Escherichia coli DH1. La cepa hemolítica WAM 589 se transformó con el plásmido pWAM04, (plásmido pUC 19, en el cual se subclonaron los genes de hemolisina, hly CABD, provenientes del plásmido pSF4000). La cepa control WAM 675 no es hemolítica y fue transformada con el plásmido pUC 19 desprovisto de genes de hemolisina. La cepa control WAM 783 es la DH1 transformada con un derivado del plásmido pWAM04, que posee una deleción en el gen hlyC, el cual codifica la información necesaria para la acilación de la pro HlyA (4). En consecuencia, WAM 783 secreta una hemolisina no acilada, incapaz de insertarse en membranas de la célula blanco.
 

Sobrenadantes de cultivos bacterianos.

Se usaron sobrenadantes crudos de cultivos de la cepa WAM 589 como fuente de hemolisina y sobrenadantes crudos de las cepas WAM 675 y 783 como controles, a diluciones elevadas con respecto a los volúmenes de reacción (más de 1:200).

Las cepas de Escherichia coli se cultivaron en caldo Luria-Bertani (LB), con ampicilina (100 µg/ml) para seleccionar las cepas WAM 589 y 675, y cloramfenicol (20 µg/ml) para seleccionar la cepa WAM 783. Vol?menes de 100 ml de caldo LB se inocularon con 1-3 ml de un cultivo estacionario de la cepa correspondiente ( incubado a 37° C durante 8-12 horas), luego de lo cual se incubaron a 37° C con agitación (200 rpm) en un incubador rotatorio G25 ( New Brunswick, Edison, NJ). Se tomaron muestras de 10-15 ml de los cultivos cuando éstos alcanzaron una densidad óptica (D.O.) de 0,3-0,4 ( 600 nm) y las bacterias se sedimentaron por centrifugación (7 min, 800 x g) en una centrífuga Sorvall SS1 (Dupont Instruments, Wilmington, DE). El sobrenadante se esterilizó por filtración a través de una membrana estéril con porosidad de 0,4 µm (Millipore) , y se mantuvo en hielo previo a su utilización.
  ]]> Determinación de actividad hemolítica

A cada ml de diluciones dobles seriadas de sobrenadante bacteriano crudo y estéril en solución salina 0,85% con calcio (10 mM CaCl₂) se añadió 1 ml de suspensión al 1% de eritrocitos de carnero suspendidos solución salina, y se incubaron a 37° C durante 1 h. Al finalizar la incubación, se añadió a cada dilución 2 ml de solución salina fría; se centrifugó a 700 x g por 5 min en una centrífuga Sorvall GLC-2B (Dupont Instruments, Wilmington, DE) y se leyó la D.O. del fluido sobrenadante a  545 nm para estimar la liberación de hemoglobina. Se determinó la dilución de sobrenadante que causó 50% de lisis eritrocitaria mediante interpolación en papel semilogarítmico en el cual se había trazado una curva patrón de hemólisis (por lisis hipotónica, en agua destilada) obtenida independientemente con el mismo lote de eritrocitos. El título hemolítico se definió como el inverso de la dilución de sobrenadante de cultivo bacteriano que causó 50% de hemólisis (HU50/ml). Dado que los ensayos con células se efectuaron en amortigüador HC (descrito a continuación), se hicieron titulaciones de sobrenadantes hemolíticos en el mismo. El título hemolítico no varió con respecto al obtenido en solución salina con calcio.
 

Obtención de leucocitos polimorfonucleares neutrófilos (PMN).

Se usó sangre venosa heparinizada obtenida de voluntarios sanos, la cual se estratificó en tubos de ensayo sobre medio Mono Poly (ICN-Flow) y se centrifugó de acuerdo a instrucciones del fabricante. Se recogió la banda de PMN y éstos se lavaron usando 20 ml de amortigüador HEPES sin calcio (HNC: HEPES 10 mM, NaCl 144 mM, KCl 5 mM, Glucosa 5,5 mM , gelatina para cultivo de tejidos 0,5% p/v, pH 7,4).

Los PMN se resuspendieron luego en solución de NH₄Cl (al 0,83% en HEPES 10 mM, pH 7,4) durante 7 min a 37° C, para lisar eritrocitos contaminantes. Los PMN se lavaron una vez más con HNC y se resuspendieron luego en 1 ml de amortigüador (0,8 ml de HNC + 0,2 ml de amortigüador HEPES con calcio, o HC, de composición idéntica a HNC, pero adicionado de 1 mM Ca Cl₂ y con 0,1% gelatina, pH 7,4). El conteo de células en la suspensión se efectuó usando una cámara para contar células (Hemacytometer).
 

Medición de quimioluminiscencia.

Las mediciones se efectuaron usando un luminómetro de seis canales (Berthold LB 9505C, Berthold Instruments, Wildbad, Alemania) asistido por computadora, y con programas suministrados por el fabricante. El volumen de reacción en las cubetas del luminómetro fue de 500 µL, conteniendo amortiguador (HC o HNC según se indica), 50-100 µL de suspensión celular (0,5-1 x 10 ⁶ PMN /mL) y 10^{– 8} M luminol. La suspensión celular se mezcló primero con el luminol, y se leyó el nivel basal de QL durante 5-10 min. La medición se inició inmediatamente después de la adición de sobrenadante de cultivo bacteriano o de otros estimulantes. En algunos experimentos, los PMN se preincubaron por 5-15 min con diferentes concentraciones del inhibidor de lipooxigenasa A63612, un derivado de ácido hidroxámico (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). La QL se midió en cuentas por minuto (cpm), y el luminómetro proporcionó un registro continuo de las reacciones, del cual se obtuvieron también parámetros cinéticos. Los valores basales de quimioluminiscencia se restaron de todos los valores experimentales.
  ]]> Resultados

Los resultados presentados en el cuadro 1 evidencian que PMN expuestos a alfa hemolisina activaron su metabolismo oxidativo. La respuesta de QL aumentó de manera directamente proporcional a la dosis hemolítica hasta alcanzar un valor pico máximo de 21 480 cpm a 1,5 HU50/ml, pero sin embargo disminuyó a dosis hemolíticas mayores de 2,0 HU50/ml, alcanzando solo un 10% del valor del pico máximo a 4 HU50/ml. La repuesta quimioluminiscente de los PMN depende de la presencia de calcio extracelular, ya que en PMN resuspendidos en amortiguador sin calcio (HNC) alcanza solo un 5-10 % del valor máximo (datos no ilustrados). Los PMN no mostraron respuesta de QL a los sobrenadantes control de las cepas WAM 675 y WAM 783.

Como se demuestra en el cuadro 2, los parámetros cinéticos de la QL de PMN en respuesta a alfa hemolisina son similares a los obtenidos cuando se les expone a 5 µM de ionóforo de calcio A23187, pero difieren en sus valores pico, integral y en la pendiente ascendente, de los registrados con PMN expuestos a 0,6 µM de ionóforo, lo que muestra que la semejanza entre la QL de la hemolisina y el ionóforo no es total.

El ionóforo A23187 permeabiliza la membrana celular y permite la entrada de iones calcio al citoplasma, activando el metabolismo de ácido araquidónico y la síntesis de leucotrienos en PMN (22), así como la producción de radicales y la QL (16, 21). En este estudio, la AH también causa la liberación de leucotrieno B4 en PMN, aunque la liberación es solo de un 9% comparada con la causada por el ionóforo A23187 (datos no ilustrados).

Si la respuesta quimioluminiscente en PMN expuestos a alfa hemolisina se asemeja a la causada por el ionóforo, ambas deberían disminuir si los PMN se preincuban con inhibidores de la lipooxigenasa, enzima que cataliza la primera reacción en la vía de síntesis de leucotrienos. En efecto, los resultados que se ilustran en el cuadro 3 señalan que la preincubación de PMN con un inhibidor de la lipooxigenasa inhibe por igual la QL causada por A23187 y por AH, sugiriendo que la activación de la lipooxigenasa es un efecto común de la acción del ionóforo y la hemolisina en PMN. La inhibición de la QL ejercida por A63612 no es total, lo que significa que existe otro componente de QL que no se origina en el metabolismo de araquidonato, o que la inhibición de la lipooxigenasa no llega a ser total.

El dimetil sulfóxido (DMSO) reacciona con radicales hidroxilo (23), los cuales podrían producirse durante metabolismo de araquidonato (24). En el cuadro 4 se demuestra el efecto inhibitorio del DMSO en la respuesta QL de PMN a alfa hemolisina, que alcanza un 50 % de inhibición a 112 mM. Nuevamente se aprecia que la inhibición no es total, lo que sugiere que un componente de la QL no es susceptible de inhibición por parte de DMSO.
 

Discusión

Poco después de la investigación original de Cavalieri y Zinder (13) que demostró una respuesta de QL en PMN expuestos a la alfa hemolisina, Jorgensen et al (25) publicaron sus resultados demostrando que la hemolisina provocaba la entrada de calcio al citoplasma de eritrocitos de manera análoga, pero no idéntica, a la causada por el ionóforo de calcio A23187. Este compuesto ha sido usado frecuentemente para estimular la síntesis de leucotrienos en PMN (22), la cual se asocia a una respuesta de QL en PMN (16). De la misma manera que el A23187, la hemolisina causa la producción de leucotrienos en PMN (8). En esta investigación se efectuó un estudio comparativo entre las respuestas de QL de PMN a la alfa hemolisina y A23187, asumiendo, con base en datos no publicados, que la entrada de calcio al citoplasma de PMN es el activador directo o indirecto de la síntesis de leucotrienos, y, por tanto, de la respuesta quimioluminiscente.

La QL provocada por A23187 en PMN proporciona un gráfico en forma de campana, al igual que la QL en respuesta a hemolisina, pero la respuesta al ionóforo alcanza niveles mucho más elevados (50 000 cpm), para decaer lentamente a concentraciones de 5-10 µM (datos no ilustrados). La QL causada por la hemolisina alcanza un m?ximo menor (aprox. 20 000) y decae rápidamente al aumentar la dosis hemolítica (cuadro 1). Es posible que la QL de PMN en respuesta a la hemolisina sea menor debido al escape de metabolitos celulares a través de las lesiones en la membrana, en particular ATP, que es esencial como cofactor de la lipooxigenasa. Este escape de ATP, causado por la hemolisina, ha sido demostrado con anterioridad en PMN (12). Sin embargo, y como se ilustra en el cuadro 2, el paralelismo entre las respuestas quimioluminiscentes es suficiente para que los parámetros cinéticos sean similares cuando se comparan en PMN expuestos a 5 µM A23187 y 1,5 HU50/ml, lo cual evidencia mecanismos comunes de QL de PMN en respuesta al ionóforo y la hemolisina. En tanto que en amortiguador sin calcio las respuestas quimioluminiscentes tanto a ionóforo como a hemolisina son mínimas, se concluye que la entrada de calcio a la célula está íntimamente relacionada con la QL en respuesta a ambos. ]]> La hipótesis de que la activación de la lipooxigenasa es responsable de al menos parte de las respuestas de QL al ionóforo y a la hemolisina obtiene apoyo experimental por cuanto el inhibidor de la lipooxigenasa A63612 las inhibe de manera similar. Se demuestra entonces que la respuesta quimioluminiscente de PMN a hemolisina es consecuencia de la activación de lipooxigenasa. La QL es debida a los radicales formados durante la síntesis de leucotrienos, y por ello se asemeja a la causada por el ionóforo A21387.

Se ha propuesto que la hemolisina es un factor que aumenta la respuesta inflamatoria a la bacteria hemolítica, porque provoca la liberación de mediadores inflamatorios preformados y la síntesis de leucotrienos en células inflamatorias (8, 26). Causa además que los fagocitos liberen radicales libres, en razón sus efectos sobre la membrana del mismo fagocito (este estudio). Sin embargo, cabe preguntarse qué beneficio tendría para la bacteria el amplificar la respuesta inflamatoria, porque ello contribuiría en última instancia a su eliminación de los tejidos. Esta paradoja puede aclararse si se asume que la estimulación de fagocitos causada por hemolisina es consecuencia de su efecto, que sería la interferencia con la capacidad fagocítica y bactericida. Se ha demostrado que cepas de Escherichia coli hemolíticas sobreviven en presencia de neutrófilos (27), Arrieta, Hernández y García, sin publicar), y que las cepas bacterianas que causan cicatrización renal liberan más radicales libres al espacio extracelular (17).

Aumentos en el calcio citoplásmico de PMN, inducidos por la hemolisina, pueden, además de inducir la formación de radicales, causar defectos en el citoesqueleto, conducentes a su vez a defectos en la formación del fagosoma, el cual, al no cerrar adecuadamente, liberaría sus contenidos al exterior de la célula, incluyendo enzimas hidrolíticas. Junto con lo anterior, la hemolisina de por sí induce la degranulación de PMN (12, 28). Este fenómeno amplificaría el daño tisular, con formación de focos necróticos que servirían como nidos para la multiplicación y diseminación de la bacteria invasora.
 

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  ]]> CUADRO 4

1  Los PMN se expusieron a 1 HU 50/ml de AH en presencia de concentraciones variables de DMSO. Se ilustran resultados de un experimento representativo de cuatro que proporcionan resultados similares.
 

*Departamento de Bioquímica. Escuela de Medicina
Universidad de Costa Rica
  ]]> 1986 1 533-547 1987 2 227-230 1986 54 886-892 1991 351 759-761 1996 64 4665-4672 1986 52 63-69 1974 7 189-195 1986 10 333-335 1987 126 126 350-357 1982 36 455-461 1996 149 113-121 1989 169 737-754 1982 37 966-974 1985 126 482-488 1993 290 51-57 1983 28 568-579 1991 59 4168- 4172 1991 285 325-330 1995 19 741-748 1996 11 99-106 1997 53 927-935 1979 76 2148-2152 1979 64 1642-1651 1981 11 233-240 1983 21 717-727 1994 4611-4617 1989 271 205-213 1999 20 141-152