El fenómeno de "swarming" se caracteriza por la formación de una película de crecimiento que se extiende a partir de las colonias y en algunos casos las bacterias pueden tornarse filamentosas e hiperflageladas. Este trabajo describe las características ultraestructurales del fenómeno de "swarming" en C. oceanicum y C. beijerinckii, estudiadas al microscopio electrónico de rastreo y transmisión. La primera especie presenta una película de desplazamiento de aspecto complejo y los bacilos en la periferia son filamentosos e hiperflagelados, en tanto C. beijerinckii muestra colonias en forma de cabeza de medusa con bacilos cortos hiperflagelados. Esta constituye la primera descripción ultraestructural de tal fenómeno en las dos especies analizadas.
Palabras clave ]]>
The swarming phenomenon is characterized by a growth film which spreadsout from the colonies. In some cases, during this phenomenon the bacteria change their normal morphology to long hiperflagelated bacilli. This paper describes for the first time the uftrastructural characteristics of the swarming behavior of C. oceanicum and C. beijerinckii analyzed under transmission and scanning electron microscopy. The first species showed a complex film of growth with long hiperflagelated bacilli. C. beijerinckii showed a medusa-like colonies with short and hiperflagellated bacilli.
Key words
Clostridium, Swarmer phenomenon, ultrastructural, electronic microscopy.
Introducción
Una de las características más relevantes de algunas bacterias es el fenómeno de "swarming", el cual se presenta cuando una bacteria se ha cultivado en un medio líquido y luego se transfiere a un medio sólido. En este último se presenta el mencionado fenómeno, caracterizado macrocópicamente por el desplazamiento de las bacterias que forman una película sobre la superficie del medio de cultivo y se extiende hasta cubrir toda la placa e incluso cubre las colonias de otras bacterias (1, 2). El género en que mejor se ha estudiado este fenómeno es Proteus, cuyo fenómeno de "swarming" se caracteriza por la formación de círculos concéntricos a partir del punto de inoculación, que le brindan un aspecto de diana a la colonia. Este patrón puede observarse fácilmente cuando se inocula la bacteria en el centro de un plato de cultivo (1-4).
Lo más sorprendente de este fenómeno ocurre a nivel microscópico, pues los bacilos, que provenían del medio líquido y que usualmente miden aproximadamente 3 µm de largo y presentan menos de 10 flagelos peritrichos, se transforman en formas filamentosas gigantescas de cerca de 100 µm de longitud y exhiben más de 1000 flagelos (4-5). Los círculos concéntricos de la colonia se deben a que una vez diferenciados los bacilos, esas formas gigantes hiperflageladas se desplazan sobre el medio, alejándose de la colonia inicial y formando la película de crecimiento característica. Pero luego de un tiempo, se detienen y se dividen activamente, lo que aumenta la densidad de la película y forma una especie de terraza. Este proceso de transformación, migración y consolidación se sigue repitiendo hasta cubrir toda la superficie disponible del medio de cultivo (1, 3, 6). ]]>
El fenómeno de "swarming", al menos en Proteus se ha asociado con la expresión de factores de virulencia, como hemolisinas, enzimas proteolíticas y ureasa, entre otros (7-9); la misma capacidad para desplazarse sobre una superficie se convierte en un mecanismo importante para invadir y colonizar un epitelio, como puede ser el caso del tracto urinario (7,9).Este comportamiento se ha descrito en otros géneros como Serratia, Vibrio, Bacillus y Clostridium (5). En bacterias anaerobias el fenómeno de "swarming" se describe como una de las características distintivas y en el caso de Clostridium esta propiedad se consigna sólo para algunas especies (10). A pesar de lo frecuente que resulta esta característica en el género Clostridium son pocas las descripciones ultraestructurales realizadas sobre este fenómeno en el mencionado género (11). En nuestro caso, la aplicación de tal propiedad ha permitido incrementar el aislamiento de C. tetani en muestras de suelo (12, 13) y además, informar de su presencia al menos en 10 especies en las que previamente no se había descrito (9).
Comparando el fenómeno de "swarming" de Proteus con el de Clostridium, este último sólo tiene en común la película de desplazamiento, la cual puede ser desde una capa fina y delicada, casi imperceptible al ojo desnudo, como ocurre en C. tetani (11), hasta un tipo caracterizado sólo por unas proyecciones a partir de la colonia, lo cual se ha denominado "colonias en cabeza de medusa", propio de C. sporogenes (10) y C. beijerinckii (9). Otras especies son capaces de hacer una película de superficie compleja con un arreglo de estriaciones en arabesco, este tipo se presenta en C. oceanicum. El objetivo de este trabajo es hacer la primera descripción de las características ultraestructurales de C. beijerinckii y C. oceanicum lo que constituye su primera descripción ultraestructural.
Materiales y métodos
Se analizaron 7 cepas de C. oceanicum y 3 de C. beijerinckii aisladas de suelos de la ciudad universitaria Rodrigo Facio, San José, Costa Rica. Todas las cepas presentaban el fenómeno de "swarming" (9). Las cepas habían sido mantenidas en el medio de cultivo "caldo de carne cocida" prereducido antes de esterilizar (PRAS) y en el mismo fueron inoculadas e incubadas durante 24 horas a 37°C. Luego se extrajo una gota con jeringa tipo tuberculina y se inoculó en el centro de una placa de agar sangre e incubó en anaerobiosis (GasPak, BBL Microbiology System, Cockeysville Md, USA) durante 24 horas a 37°C (11).
Para el análisis al microscopio electrónico de rastreo (MER, Hitachi S570) se cortaron secciones triangulares del agar, que incluyeran el centro y la periferia de la colonia. Para microscopio electrónica de transmisión (MET, Hitachi H-7100) se cosechó el cultivo resuspendiendo las bacterias en glutaraldehido (GA, calidad ME) al 2,5% en amortiguador de fosfatos (0,1 mM, pH7,2). La fijación de las muestras, los lavados y la deshidratación se hicieron en períodos de dos minutos en un horno doméstico de microndas a un 20 % de su potencia. Para evitar el recalentamiento durante la irradiación, las muestras se colocaron en frascos de 5 ml de capacidad, que a su vez se colocaron en beakers de 500 ml con cubos de hielo (3).
Una vez deshidratados los especímenes destinados a MER se secaron en terbutil alcohol y los especímenes para MET se impregnaron rejillas recubiertas con membrana de formvar con la suspensión de las bacterias, para realizar un sombreado con platino en un ángulo de aproximadamente 300 y se analizaron al MET con un voltaje de aceleración de 100KV.
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Macroscópicamente las colonias de ambas especies, luego de 18 horas de incubación a 37°C en anaerobiosis, presentan una zona central compacta, correspondiente al crecimiento denso a partir del inóculo inicial, luego a partir de la periferia se inicia el desplazamiento en grupos, en el caso de C. oceanicum formando una película continua y en el caso de C. beijerinckii haciendo la colonia en forma de cabeza de meduza.
Al MET, mediante muestras sombreadas con platino se observa que los bacilos que inician ese desplazamiento son hiperflagelados, como es característico en el fenómeno de "swarming"; las figuras 1 y 2 corresponden a C. oceanicum y C. beijerinckíi, respectivamente.
Al MER las diferencias entre las dos especies se hacen más obvias, pues en C. oceanicum el desplazamiento en la periferia de la colonia es dado por bacterias filamentosas agregadas en empalizadas (Fig. 3). En tanto en el centro de la colonia predominan los bacilos. En C. beijerinckii tanto en la periferia como en el centro de la colonia predominan las formas cortas y aún en la periferia no se aprecia ningún arreglo en particular; los grupos de bacterias aparecen desordenadas (Fig. 4).
Figs. 1 y 2. Micrografías electrónicas de transición obtenidas mediante sombreado con platino, de Clostridium oceanicum y C. beijerinckii, respectivamente. En ambas micrografías se aprecian bacilos hiperflagelados. Barra = 1 (µm)
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Figs. 3 y 4. Micrografía electrónica de rastreo obtenidas en la periferia de las colonias de Clostridium oceanicum y C. beijerinckii, respectivamente. El área del recuadro en la parte inferior de cada figura corresponde a la parte superior de la micrografía, ampliada diez veces. En C. oceanicum se aprecian las formas filamentosas características; mientras C. beijerinckii muestra solo formas cortas, similares a las encontradas en el centro de la colonia.
Discusión
En el género Clostridium el fenómeno de "swarming" es más común de lo que ha sido informado y cuyas escasas descripciones hacen sólo referencia al aspecto macroscópico (10). En algunas especies como C. tetani el aspecto macroscópico de la película de "swarming" es una característica distintiva y se mantiene de un pasaje a otro en las diferentes cepas lo que ayuda a su identificación presuntiva desde el primo aislamiento. En otras especies, como es el caso de C. oceanicum, la película de desplazamiento varía notoriamente de un pasaje a otro; usualmente presenta un patrón caracterizado por una película tenue que cubre casi toda la placa, pero que difiere de C. tetani por presentar una superficie rugosa; también desarrolla una película de superficie compleja dado por la aparición de estriaciones en arabesco; este último aspecto resulta notoriamente característico para esas cepas de esta especie. En el caso de C. beijerinckii el fenómenos de "swarming" exhibido se describe como colonias en cabeza de medusa, lo cual es similar en C. sporogenes (10).
En algunas especies de Clostridium el fenómeno de "swarming" puede presentar solo células cortas, similares a las células encontradas en cultivos líquidos, pero con la diferencia de ser hiperflageladas, como es el caso de C. beijerinckii; mientras que en otras especies, las células de la periferia de la colonia son gigantescas e hiperflageladas, como las descritas aquí para C. oceanicum, característica que también se observa en C. tetani. Por lo tanto, la caracterización morfológica del fenómeno de "swarming" podría ser una característica fenotípica que podría utilizarse para orientar la identificación de algunas especies del género Clostridium.
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1. Belas R. The swarming phenomenon of Proteus mirabilis. lntercellular communication and multicellular interactions may provide clues to this 100 years-old mystery. ASM News 1992;58:15-22. [ Links ]
2. Hernández F, Rodríguez E. El fenómeno de "swarming" y otros tipos de desplazamiento bacteriano. Rev Cost Cienc Med 1993;14:45-51. [ Links ]
3. Login GR, Dvorak AM. The microwave tool book. A practical guide for microscopists. Boston, USA. Beth Israel Hospital. 1994, p. 161. [ Links ]
4. Williams FD, Scharzhoff RH. Nature of the swarming phenomenon in Proteus. Ann Rev Microbiol 1978;32:101-122. [ Links ]
5. Rauprich O, Matsushita M, Weijer CJ, Siegert F, Esipov SE, Shapiro JA. Periodic phenomena in Proteus mirabilis swarm colony development. J Bacteriol 1996;178:6525-38. [ Links ]
6. Bisset KA, Douglas CWI. A continuos study of morphological phase in the swarm of Proteus. J Med Microbiol 1976;9:229-31. [ Links ]
7. Allison C, Hughes C. Closely linked genetic loci required for swarm cell differetiation and multicellular migration by Proteus mirabilis. Mol Microbiol 1991;5:1975-82. [ Links ]
8. Allison C, Lai H, Hughes C. Co-ordinate expression of virulence genes during swarm-cell differentiation and population migration of Proteus mirabilis. Mol Mícrobiol 1992;6:1583-91. [ Links ]
9. Jim T, Murray RGE. Further studies of swarmer cell differenciation of Proteus mirabilis PM23: a requirement for iron and zinc. Can J Microbiol 1988;34:588-93. [ Links ]
10. Cato EP, George WL, Finegold SM. Genus Clostridíum, Praxzmowki, 1880. p. 1141-1203. In: Sneath PHA. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Vol 2. Baltimore: William & Wilkins, 1986, p. 1141-1200. [ Links ]
11. Hernández F, Rodríguez E. The swarming phenomenon of Clostridium tetani. Rev Biol Trop 1993;41:857-9. [ Links ]
12. Hernández F, Rodríguez E, Umaña M, Vargas P. lsolation of swarmer clostridia from soil. Rev Biol Trop 1997;45:1243-1245. [ Links ]
13. Hernández F, Rodríguez E, Vargas P, Umaña, M. Clostridium tetani en suelos de la ciudad universitaria Rodrigo Facio. Rev Cost Cienc Med 1996;17:34-8. [ Links ]
1. Unidad de Microscopía Electrónica, Universidad de Costa Rica, San José, Costa Rica.
2. Dirección Actual: Hospital Militar Central, Santa Fé de Bogotá. D. C. Colombia.
3. Facultad de Microbiología, Universidad de Costa Rica, San José, Costa Rica.
* Correspondencia. ]]>