X2= 8.7 P = 0.003
* Coag = Coagulasa, Pos = positivo, Neg = negativo
Indica los valores tomados para el cálculo
Resumen
El aumento en la prevalencia de cepas de Staphylococcus coagulasa negativas (SCN) en infecciones sistémicas está asociado con factores de riesgo, como el grado de inmunosupresión debido a cáncer, transplantes, SIDA, u otras condiciones como el uso de catéteres intravenosos y prótesis. Por esa razón, una reacción de coagulasa negativa en un aislamiento clínico de estafilococus no puede ser garantía de inocuidad, lo que hace necesario otras pruebas de escrutinio. La presencia de receptores Fc para inmunoglobulinas en la superficie de Staphylococcus es un factor de virulencia importante. Estos receptores pueden demostrarse mediante hemaglutinación usando una combinación apropiada de anticuerpos y antígenos, como un anti A y eritrocitos del grupo A. Las bacterias son sensibilizadas con esos anticuerpos, los cuales se pegan por su extremo Fc a los receptores localizados en la superficie de la bacteria. Estas bacterias sensibilizadas se incuban con los eritrocitos grupo A y se lee la actividad hemaglutinante.
Usando esa prueba se evaluaron 100 cepas de Staphylococcus aisladas de muestras clínicas (hemocultivos y abscesos) y de personas sanas. Se encontró una diferencia estadística entre la presencia de receptores Fc y el origen de las cepas, la mayoría (91%) de las cepas que provenían de casos clínicos mostraron receptores Fc, 25 (45%) de esas cepas fueron SCN y 21 (84%) ellos mostraron receptores Fc . Estos datos sugieren que la evaluación de receptores Fc podría servir como prueba de tamizaje para juzgar la posible virulencia de las cepas coagulasa negativas de Staphylococcus. (Rev. Cost. Cienc. Méd. 1998; 19 (1,2):49-56)
Palabras clave
Staphylococcus,receptores fc, coagulasa negativa, factores de virulencia
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The increasing prevalence of coagulase-negative Staphylococcus (CNS) in systemic infections is associated with risk factors such as immunocompromised state due to cancer, transplant therapy, AIDS, or the increasing use of intravascular catheter or prosthetics devises. For this reason, a coagulase-negative test from a clinical isolate of staphylococci could not be a guarantee of non-virulent, being necessary the performance of another screening test. The presence of Fc receptor for human immunoglobulins at the surface of Staphylococcus constitutes an important virulence factor. The presence of these receptors can be shown by haemagglutination test using an appropriate combination of antibodies and antigens, such as anti-A and Group A red cells. Bacteria sensitized with those antibodies are incubated with group A red cells to measuring their haemaggutination activity.
Using this test, 100 strains of Staphylococcus, isolated from clinical samples and from healthy persons were evaluated. The presence of Fc receptors showed a statistical difference with the origin of the strain, the majority (91%) of strains from clinical samples showed those receptors. Twenty five (45%) of the clinical isolates were CNS and 21 (84%) of them showed Fc receptors. These data suggest that the presence of Fc receptor could be a additional factor to judge the possible virulence of coagulase-negative Staphylococcus.
Key words
Staphylococcus coagulase negative, Fc receptors, virulence factors.
Introducción
El género Staphylococcus fue descrito hace más de 100 años y actualmente incluye unas 32 especies. Los miembros de este género son cocos Gram positivos, la mayoría aerobios y la especie tipo es S. aureus, que es coagulasa positiva. También son coagulasa positivas las especies S. schleiferi ssp coagulans, S. intermedius, S. delphini, y algunas cepas de S. hyicus. Sin embargo, en patología de humanos la especie más importante y prevalente ha sido S. aureus, por lo cual la prueba de coagulasa ha servido para diferenciarla de las otras especies consideradas como flora normal y por ende no patógenas, entre éstas la más predominante es S. epidermidis (1). ]]>
S. aureus es considerado uno de los patógenos clásicos, se involucra en una amplia gama de manifestaciones clínicas que incluyen lesiones de piel tipo furúnculos, celulitis, impétigo, síndrome de piel escaldada y contaminación de heridas, a partir de las cuales puede diseminarse, vía sanguínea, a otros sitios anatómicos, por lo que también se asocia con septicemias, pneumonía, ostiomielitis, endocarditis, pericarditis, cervicitis, meningitis y abscesos en órganos internos, e infecciones de tracto urinario; además, se relaciona con intoxicaciones alimentarias (1). En la década de 1980 emergieron nuevos problemas relacionados con este agente: primero el síndrome de choque tóxico, asociado con cepas productoras de una toxina no conocida hasta ese momento (2) y que por su modo de acción hoy es clasificada como un superantígeno (3). Luego aparecieron las cepas resistentes a la meticilina, una penicilina utilizada contra las cepas beta-lactamasa positivas (4).Sin embargo, los problemas infecciosos asociados con el género Staphylococcus se han complicado más con el incremento de cuadros asociados a las otras cepas de Staphylococcus coagulasa negativas (SCN), otrora consideradas como no patógenas. Este es el resultado del incremento en el empleo de prótesis sintéticas e intervenciones con implementos invasivos como catéteres, al lado del incremento en la población inmunosupresa, ya sea secundaria a infecciones, como el SIDA, transplantes o terapia antineoplásica (5). Por ejemplo, se describe que del 74 al 92% de las bacteremias nosocomiales son causadas por cepas SCN (1).
Tal cambio en la prevalencia de cuadros asociados con cepas SCN lleva a restar importancia a la prueba de coagulasa como factor para discriminar entre cepas virulentas y no virulentas en muestras clínicas; pues las cepas SCN que podrían ser miembros de la flora normal y que aparecerían como simples contaminantes en una muestra clínica, hoy pueden ser patógenos importantes (1, 3, 5). En tal sentido, se busca evaluar factores de virulencia en las cepas SCN, como la capacidad para formar "biofilms" (6, 7) o detectar sus componentes ya sea por pruebas serológicas o genéticas (7, 8). Sin embargo, otro posible factor de virulencia que podría evaluarse fácilmente es la capacidad de las cepas SCN para fijar inmunoglobulinas (Ig) por el extremo Fc en su superficie, lo cual le serviría como camuflaje, y le permitiría evadir la respuesta inmune (3).
Algunas cepas de Staphylococcus aureus y de Streptococcus epidermidis han desarrollado proteínas de pared que actúan como receptores para el extremo Fc de las Ig. Las dos proteínas más estudiadas de este tipo son la proteína A en S. aureus y la proteína G en Streptococcus pyogenes (9). Se emplean como herramienta para separar o marcar las IgG (10). La presencia de tales receptores se ha evaluado mediante hemaglutinación (HA) empleando la prueba descrita en 1991 (11). En esta técnica se utilizan eritrocitos de carnero sensibilizados con IgG anti eritrocitos de carnero, de forma tal que las inmunoglobulinas adheridas a los eritrocitos exponen el extremo Fc, que se adhiere a los receptores Fc en la superficie de la bacteria, lo que provoca que la unión bacteria-eritrocito sensibilizado se manifieste por una hemaglutinación (HA). El objetivo de este trabajo fue demostrar la presencia de receptores Fc empleando una modificación del método descrito anteriormente, en cepas de Staphylococcus aisladas de casos clínicos severos y de flora normal.
Material y métodos
Cepas:
Se estudiaron 100 cepas de Staphylococcus, 56 fueron aisladas de muestras clínicas o de materiales de autopsia en los cuales la causa de muerte se relacionaba con esta bacteria. Como cepas control se aislaron 28 cepas de piel del antebrazo derecho de individuos sanos y 16 de garganta de adolescentes sanos, tomados de un trabajo previo (12).
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Se modificó la técnica de Yanrada et al (11), incubando las bacterias (30min/37°C) con suero anti eritrocitos humanos del grupo sanguíneo A. Las bacterias luego se lavaron tres veces por centrifugación (5000 rpm/10 min) para eliminar las Ig no adheridas. Estas bacterias se consideran "sensibilizadas con anti A". Para poner de manifiesto la Ig adherida a las bacterias sensibilizadas, se incubaron con una suspensión de eritrocitos A, lo que induciría una reacción de HA. Esta reacción se realizó en placas de microtítulo de fondo en U, para ello se adicionó 50 µl de las bacterias sensibilizadas por pocillo y 50 µl de una suspensión de eritrocitos al 5%, se incubó la mezcla de reacción (30min/37°C) y se dejó sedimentar para evaluar el patrón de hemaglutinación. Se consideró como título de la HA al recíproco de la mayor dilución que mostró una HA evidente. Para titular la concentración de receptores Fc en las células, se emplearon diluciones dobles del antisuero.
Metodología
La hemaglutinación, que en este contexto representa la expresión de receptores para el extremo Fc de Ig en la superficie de la bacteria, se correlaciona estadísticamente con el origen de la cepa, pues de 56 cepas provenientes de testigos, 51 (91%) dieron una reacción de hemaglutinación, en tanto de las 44 cepas aisladas de individuos sanos, solo 26 (59%) dieron esa reacción. Tal diferencia arroja un valor de X2 de 14,23, para un p=0,0001 (Cuadro 1).
Al correlacionar la actividad de coagulasa de esas cepas con la presencia de receptores Fc, según el origen de las cepas, se encuentra que la mayoría de las cepas coagulasa positivas (97%), aisladas de casos clínicos presentan receptores Fc. La misma tendencia se observa con las cepas de SCN aisladas de casos clínicos, pues representaron el 45% de las cepas aisladas de esas muestras y 21 de ellas (84%) presentaban receptores Fc. Se esperaría la situación opuesta con las cepas provenientes de controles; sin embargo, 19 de 28 cepas coagulasa negativas (68%), aisladas de testigos también presentaban receptores Fc, lo cual puede deberse al tipo de personas sanas seleccionadas como testigos. En las cepas testigos no se encontraron coagulasa positivas (Cuadro 2).
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| HA< 1:2 | | |
| HA> 1:4 | | |
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| Hemaglutinación (Receptores Fc) | Coag Pos* | Coag Neg* | Coag Pos | Coag Neg |
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| HA <1:2 | 1 | 4 | 0 | 9 |
| HA >1:4 | 30 | 21 | 0 | 19 |
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Indica los valores tomados para el cálculo
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CUADRO 3| Hemaglutinación | Cepas Coag Pos* | Cepas Coag Neg* |
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| HA <1:2 | 1 | 13 |
| HA >1:4 | 30 | 40 |
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La alta proporción de cepas SCN aisladas de cuadros clínicos importantes hace obsoletos los criterios clásicos de emplear la prueba de coagulasa como tamizaje, para juzgar si una cepa de Staphylococcus proveniente de una muestra clínica, por ejemplo en un hemocultivo, se trata de un contaminante de la flora normal de piel del paciente o de un patógeno. Este hallazgo debe evaluarse con otras características del paciente, entre ellas, el posible grado de inmunosupresión y el tiempo de estancia hospitalaria, entre otros (3). Tal cambio obliga a buscar otros enfoques que permitan discernir el posible nivel de virulencia de las cepas SCN y en ese sentido la presencia de proteínas receptoras de Ig en la superficie bacteriana puede ser una opción.
Las proteínas receptoras de Ig representan un factor de virulencia anti fagocítico, pues le permiten a la bacteria enmascararse, recubriéndose con las Ig del huésped, lo que representa un mecanismo de evasión, que le permite pasar inadvertida ante el sistema inmune del huésped, e impide la fagocitosis (13, 14).
Obviamente la presencia de estas proteínas receptoras de Fc constituyen un factor de virulencia importante para esas cepas (15). Los datos mostrados en este trabajo ilustran esa hipótesis en el caso de cepas de SCN aisladas de muestras clínicas. No obstante, una proporción importante de las cepas aisladas de piel de individuos sanos mostró la presencia de receptores Fc (Cuadro 2), lo cual puede deberse al tipo de personas muestreadas, pues la mayoría eran adultos que laboraban en el área de la salud. La flora normal de estas personas podría ser diferente de la flora de individuos de áreas no relacionadas con la salud. Un ejemplo similar fue obtenido al evaluar la flora de piel de familiares de pacientes que sufrían de acné, ya que su flora incluía cepas con patrones de resistencia antimicrobiana similares a la flora de los pacientes que usualmente estaban bajo tratamiento antimicrobiano (16). Por lo tanto, es importante evaluar la proporción de SCN con receptores Fc en individuos sanos, no relacionados con el área hospitalaria.
Por otra parte, no es posible hacer conclusiones de la correlación general, entre coagulasa y presencia de receptores Fc. Se deben subdividir las cepas según su origen en casos clínicos y testigos, como se muestra en el cuadro 3. La proporción de las cepas provenientes de casos, ya sea coagulasa positivas o SCN se distribuye en ambos factores de la comparación, lo que invalida este tipo de análisis si se pretende juzgar la inocuidad de las cepas SCN. Otra condición importante, en este sentido, fue que de la piel de los testigos no se aislaron cepas coagulasa positivas. Por lo tanto, es importante correlacionar la presencia de receptores Fc con el origen de las cepas, independientemente del tipo de coagulasa que presenten. Obviamente las cepas coagulasa positivas, que en la mayoría de los casos se trata de S. aureus, podrían constituir los agentes responsables del cuadro clínico, en tanto el hallazgo de receptores Fc en cepas SCN brinda un elemento más para juzgar su posible nivel de virulencia. En conclusión la presencia de receptores Fc permite identificar cepas con un grado de virulencia que podrían ser importantes en la clínica, independientemente de su actividad de coagulasa.
Los datos mostrados en este trabajo indican que la evaluación de receptores Fc, mediante una prueba de hemaglutinación, adaptada al sistema de antígenos y anticuerpos empleados en el banco de sangre para la determinación de grupos sanguíneos, representa una buena opción adicional para ayudar a juzgar la importancia clínica de las cepas de SCN.
Referencias ]]>
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16. Bolognia JL, Edelson RL. Spred of antibiotic-resitant bacteria from acne patients to personal contacts a problem beyond the skin ? Lancet 1997;350:972-3. [ Links ]
1. Facultad de Microbiología, Unidad de Microscopia Electrónica (UME) y Centro de Investigación en Enfermedades Tropicales (CIET), Universidad de Costa Rica, San José, Costa Rica.
2. Servicio de Anatomía Patológica, Hospital Nacional de Niños, San José, Costa Rica. ]]>