Studies on some reproductive traits in Equisetum species are scarce and valuable to understand species distribution. Therefore, a detailed study of the sporogenesis process and spore development in E. bogotense ]]>
Equisetum; however, sporogenesis in E. bogotense is synchronous and this condition has been observed so far only in E. giganteum, a tropical genus also found in Colombia.
Los estudios sobre ]]>
Equisetum. Por eso, hemos realizado un análisis detallado del proceso de esporogénesis, desarrollo de las esporas, ultraestructura de procesos que tienen lugar durante la meiosis, formación de la pared esporal, orbículas y eláteres de E. bogotense, en especímenes procedentes del Cauca, Colombia. Los estudios se efectuaron mediante microscopía fotónica, electrónica de transmisión (TEM) y de barrido (SEM). Los ]]>
E. bogotense ]]>
E. bogotense es sincrónica, similar a la de E. giganteum, otra especie de distribución tropical que también crece en Colombia.
Palabras clave: esporogénesis, esporas, exosporio, orbículas, perisporio, ultraestructura del esporodermo. En las regiones montañosas de Colombia se encuentran tres especies de Equisetum L.: E. bogotense Kunth., E. giganteum L. y
E. myriochaetum Schltdl. & Cham. (Triana-Moreno & Murillo 2005, Murillo et al. 2008), citadas también para Centroamérica y Sudamérica (Moran 1995). E. bogotense crece en toda América tropical, desde Costa Rica hasta la Argentina (Tryon & Tryon 1982); es una planta palustre, de ambientes lóticos, lénticos y humedales que crece en zonas despejadas o protegidas, ]]>
E. bogotense es más común en las zonas de mayor altitud (Triana-Moreno & Murillo 2005, Murillo et al. 2008).
Los trabajos en el género Equisetum son abundantes y diversos. Pryer et al. (1995), Pryer et al. (2001), Des Marais et al. (2003), Guillon (2004, 2007), Carlquist & Schneider (2011), Kaufman et al. (1973), Chen & Lewin (1969), Ernst (1990), Epstein (1999), Holzhuter et al. (2003), Currie & Perry (2007, 2009) y Law & Exley (2011), entre otros, han analizado aspectos taxonómicos, sistemáticos, evolutivos y estructurales, además de la capacidad de Equisetum de biomineralizar sílice y acumularla en diversas partes del cuerpo vegetal.
Los estudios de aspectos reproductivos son más escasos y se relacionan con el desarrollo de los esporangios y la esporogénesis (Hawkins 1907), el proceso de maduración de las esporas, el patrón de depósito de las capas del esporodermo y la presencia de clorofila en las esporas (Beer 1909), la morfología y evolución de esporangióforos y ejes en relación con el origen y disposición de estas estructuras (Page 1972), aspectos ultraestructurales de la germinación de las esporas (Gullvǻg 1968, Olsen & Gullvǻg 1973), caracteres de forma, tamaño y color de las esporas en relación con su viabilidad en especies e híbridos (Duckett 1970), distribución de los orgánulos, en especial plastidios y mitocondrias, durante la meiosis (Bednara & Rodkiewicz 1985, Bednara et al. 1986), maduración de los esporangios, aspectos ultraestructurales de la esporogénesis y morfogénesis de la pared de las esporas y los eláteres (Uehara & Kurita 1989), ultraestructura de los eláteres y la pared de las esporas (Tryon & Lugardon 1991), así como la disposición de los microtúbulos del tapete durante la esporogénesis y formación de cámaras plasmodiales alrededor de las tétradas y esporas (Uehara & Murakami 1995). Finalmente, Roshchina et al. (2004), evaluaron la utilidad de la técnica de microscopía confocal en el estudio de la fisiología de las esporas y Rincón et al. (2011) investigaron la ontogenia de estróbilos y esporangios y la esporogénesis de E. giganteum. ]]>
Las orbículas fueron descubiertas por Rosanoff (1865) en polen de Leguminosas mimosoideas. Von Ubisch (1927) las describió en células del tapete de especies de Oxalis L. (Oxalidaceae) y fue el primero en señalar semejanzas en la naturaleza de esos corpúsculos con la exina de los granos de polen. Rowley (1962) introdujo el término corpúsculos de Ubisch y señaló que su forma podía ser variable. ]]>
et al. (1961). Madjd & Roland-Heydacker (1978) y Abadie & Hideux (1979) distinguieron entre corpúsculos de Ubisch (huecos) y orbículas (macizas pero deformables y generalmente esféricas), aunque consideraron ambos tipos compuestos por esporopolenina. Heslop-Harrison (1968, 1971) usó inicialmente el término placas y posteriormente se inclinó por el de orbículas. Hesse (1986) les atribuyó un valor diagnóstico similar al de la ornamentación, sobre la base ]]>
et al. 1998, Vinckier & Smets 2002, Ueno 1960a, 1960b, Yamazaki & Takeoka 1962). Con menos referencias, en briófitos fueron tratadas por Zajac (1995) y en helechos principalmente por Lugardon (1981), Tryon & Tryon (1982), Passarelli (2007) y Passarelli et al. (2010). ]]>
Este trabajo es un aporte al conocimiento de la esporogénesis, desarrollo de las esporas y aspectos de la ultraestructura de la pared esporal, eláteres y orbículas de E. bogotense. Se presentan estudios detallados de ultraestructura de los principales sucesos ocurridos durante la meiosis, maduración de las esporas, morfología de la pared esporal y de los eláteres, y se ]]>
Materiales y Métodos
En los meses de julio y ]]>
E. bogotense en el municipio de Puracé- Coconuco, Cauca a 2° 20’29” N - 76° 29’45” W y 2 416m de altitud. El material de referencia se depositó en los Herbarios del Departamento de Biología de la Universidad del Valle (CUVC) y del Instituto de Biología de la Universidad de Antioquia (HUA) (002 Eb-Rincón). Los estróbilos del eje principal y las ramificaciones fueron ordenados por etapas de maduración; se establecieron ]]>
diez estróbilos y tres esporangióforos por cada estróbilo.
Para las observaciones con microscopio fotónico y MET el material se fijó en glutaraldehído al 2.5% en buffer fosfato, pH 7.2 y 0.2M por 48h. Se lavó en el mismo buffer y se ]]>
Las secciones ultrafinas de 70-80nm para MET, se obtuvieron con cuchilla de diamante y se contrastaron con acetato de uranilo y citrato de plomo durante 40min y 5min respectivamente; se observaron con un microscopio JEOL JEM-1011 en el Laboratorio de Microscopía Electrónica de la Universidad Nacional de Colombia, sede Palmira.
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Para las observaciones con MEB el material se fijó y posteriormente deshidrató en 2.2 dimetoxipropano según Halbritter (1998) y se efectuó el secado a punto crítico con un desecador SAMDRI®-795. Los esporangióforos y las esporas se colocaron sobre una cinta conductiva de carbono de doble cara y fueron recubiertas con oro en una ionizadora DENTON VACUUM DESK IV durante 5min. Se observaron con un microscopio JEOL JSM-6490LV de la Escuela de Materiales de la Universidad del Valle (Cali). ]]>
Los términos utilizados para las esporas están en Lellinger (2002) y Punt et al. (2007). El término banda de orgánulos se utiliza según Brown & Lemmon (2001a), el de cámaras plasmodiales según Rincón et al. (2011) y orbículas, ]]>
et al. (2010).
Resultados
Los estróbilos ]]>
E. bogotense alcanzan una longitud de 1.2 (±0.5)cm, y los de las ramas laterales 0.5(±0.3) cm. Presentan numerosos esporangióforos, constituidos por el escutelo, una estructura peltada que lleva de cinco a seis esporangios sésiles y que está unida por el manubrio al eje del estróbilo (Fig. 1 A-B). ]]>
En el interior de los esporangios inmaduros se encuentran, densamente dispuestas, las células madres de las esporas (esporocitos), que se caracterizan por presentar un núcleo central voluminoso, un nucléolo y cromosomas condensados (Fig. 1 C). El citoplasma es relativamente escaso y tiene aspecto granular por la existencia de ]]>
Fig. 1 D-E).
En esta etapa de maduración, la pared del esporangio está ]]>
Fig. 1 F). La interna, con hasta tres estratos celulares, formará el tapete, y sus células tienen contornos rectangulares o cuadrangulares, núcleo central grande, ]]>
Fig. 1 F). Una capa media uniestratificada se sitúa entre las dos descritas y está integrada por células aplanadas, con núcleo de posición central, citoplasma escaso y vacuolas grandes.
El citoplasma de las ]]>
Fig. 1 F), es decir, aparecen oscuros cuando los atraviesan los haces de electrones en el microscopio electrónico de transmisión. A medida que el esporangio madura el tapete pierde la integridad histológica y forma un plasmodio que invade la cavidad del esporangio entre los esporocitos, separándolos (Fig. 1 G). La invasión del tapete acelera el proceso de maduración de ]]>
Fig. 1 H). En esta etapa el tapete recubre toda la cavidad esporangial rodeando por completo a los esporocitos en las cámaras plasmodiales. La membrana nuclear de los esporocitos en profase se desintegra por completo, los cromosomas se hacen más evidentes, mientras que las mitocondrias y los plastidios se disponen periféricamente rodeando la zona donde se localizan los cromosomas (Fig. 1 H). Esta disposición de los ]]>
Fig. 2 A), pero una vez que los cromosomas inician la separación, durante la anafase I, los orgánulos se agrupan en la placa metafásica formando la banda de orgánulos. Al final de la interfase la banda se localiza entre los dos núcleos hijos (Fig. 2 B) y en ella se ]]>
Fig. 2 B). Estas características se aprecian también en las observaciones con MET (Fig. 2 C).
Durante la meiosis II, la banda de orgánulos mantiene su posición pero se torna más compacta y es difícil determinar la posición relativa de los plastidios y las mitocondrias (Figs. 2 D-F). A la disyunción de los cromosomas y la formación de los cuatro núcleos hijos le sigue la ]]>
Fig. 2 G). Las mitocondrias, en cambio, mantienen la posición, indicando los sitios de separación de las esporas. En estos sitios numerosas vesículas con material poco electrodenso se depositan en la parte media de este agregado mitocondrial (Fig. 2 H) y posteriormente se fusionan iniciando la formación de la placa celular (
Fig. 3 A). Con la agregación y fusión constante de vesículas, la placa celular se desarrolla de manera simultánea dividiendo a la célula en cuatro esporas inmaduras que se disponen tetraédricamente al final de la meiosis II (Fig. 3 B). Las tétradas pasan por varias etapas de maduración hasta la formación de las esporas adultas, que permanecen juntas en la misma cámara plasmodial pero se separan progresivamente hasta quedar en cámaras plasmodiales individuales.
Las esporas inmaduras son esféricas, con esporodermo poco definido, núcleo eucromático en posición central, uno o dos nucléolos, citoplasma con retículo endoplasmático denso, numerosos plastidios y mitocondrias (Fig. 3 C). ]]>
El tapete plasmodial presenta abundante retículo endoplasmático, numerosos plastidios y cuerpos multivesiculares, que ocasionalmente se observan en las cámaras plasmodiales (Figs. 3 D). En esta etapa también termina de diferenciarse la pared definitiva del esporangio formada ahora sólo por dos estratos celulares. El externo será la pared definitiva del ]]>
Fig. 3 E). Una vez que las esporas han madurado, el tapete plasmodial degenera y las esporas quedan libres en la cavidad esporangial.
En las observaciones de esporangios frescos sin teñir con la técnica de DIC se observa que las esporas pasan por varias etapas de maduración, con notable aumento de la vacuolización a medida que crecen. Inicialmente el núcleo se encuentra en posición central y está rodeado por varias vacuolas (Fig. 3 F) que posteriormente se fusionan formando una sola vacuola central que ocupa la mayor parte del citoplasma y desplaza ]]>
Fig. 3 G). Hay escasos plastidios alrededor del núcleo, que migran hacia el centro de la espora al finalizar el proceso de maduración (Fig. 3 H).
Las esporas ya desarrolladas tienen un núcleo en posición ]]>
Fig. 4 A-B). Con la maduración de las esporas y degradación del tapete plasmodial, la pared del esporangio se abre permitiendo la liberación de las esporas (Fig. 4 C). ]]>
El exosporio se forma por el depósito de capas de esporopolenina que determinan dos zonas homogéneas de material granular que se diferencian en textura y contraste. El exosporio carece de orbículas y el seudoendosporio se localiza inmediatamente debajo del exosporio, formando una capa irregular de material fibroso a granular electrodenso, que se deposita al final de la maduración de la espora y limita internamente con la membrana celular. Aparecen ]]>
Fig. 4 D). El perisporio es delgado, de 0.15-0.16μm y está constituido por una fina capa de esporopolenina electrodensa que se localiza por encima del exosporio. Externamente presenta abundantes orbículas esféricas de diámetro variable, entre 0.11 y 0.38μm, constituidas por ]]>
Fig. 4 D). En la superficie externa, el perisporio está ornamentado, es muriforme, rugado, con pliegues finos y afilados, bajos, discontinuos, que se distribuyen irregularmente delimitando aréolas completas o incompletas y con abundantes orbículas (Fig. 4 E). En tanto que el exosporio es de apariencia rugulado o verrucoso y con microperforaciones superficiales (
Fig. 4 F).
Los eláteres, vistos con MET, están constituidos por dos capas de material fibrilar: una interna delgada, formada con fibrillas orientadas paralelamente al eje mayor de la estructura y una externa más gruesa y menos electrodensa de material fibrogranular y con abundantes orbículas sobre la cara externa (
Fig. 4 G). Los eláteres se unen a la espora, junto con el perisporio, en la zona de la abertura esporal; una región del exosporio de forma biconvexa, localizada en el sitio de unión de las esporas en la tétrada, es decir en la cara proximal de las esporas (Fig. 4 H).
Discusión
La esporogénesis, la morfología de los esporocitos, el proceso de formación de la pared esporangial, el tapete, los eláteres y el tipo de esporodermo adulto fueron analizados en especímenes de E. bogotense procedentes de las áreas montañosas de Colombia. La esporogénesis es ]]>
E. arvense L. (Uehara & Kurita 1989) y E. giganteum (Rincón et al. 2011), mientras que para E. fluviatile L. se conoce esporogénesis asincrónica (Lehmann et al. 1984). ]]>
La morfología de los esporocitos, el proceso de formación de la pared esporangial y el tapete de E. fluviatile, E. arvense, E. giganteum y E. bogotense son similares (Lehmann et al. 1984, Uehara & Kurita 1989, Rincón et al. 2011), lo que sugiere que los procesos ontogenéticos que llevan a la formación de la pared esporangial y disposición de los esporocitos premeióticos en el esporangio son condiciones típicas de Equisetum y no caracteres específicos.
Lehmann et al. (1984) y Uehra & Kurita (1989) caracterizaron los esporocitos de E. arvense y E. fluviatile y describieron una ultraestructura típica de células con alta actividad metabólica, con presencia de un profuso retículo endoplasmático, gran cantidad de plastidios, mitocondrias, cuerpos multivesiculares y en la pared, múltiples canales de intercomunicación de hasta 0.2μm de diámetro, más amplios que típicos plasmodesmos y sin desmotúbulos, tal como se ha visto aquí para E. bogotense, una condición que no sería exclusiva de las equisetáceas ya que ha sido observada en células madres de los granos de polen de varios táxones de angiospermas y gimnospermas en el momento de iniciarse la microsporogénesis y que se relacionarían con la sincronización del desarrollo o bien con fenómenos de citomixis (Heslop-Harrison 1966, Cresti et al. 1992, Bellucci et al. 2003, Guzicka & Wozny 2005, Ghaffari 2006, Mursalimov & Deineko 2011).
El tapete de E. bogotense, inicialmente celular y luego plasmodial, es similar al descrito para otras especies de Equisetum (Uehara & Kurita 1989, Lugardon 1990, Uehara & Murakami 1995) y para otros táxones de plantas (Pacini et al. 1985, Pacini 1997, Cresti et al. 1992, Furness & Rudall 1998, 2001, Furness 2008). Rincón et al. (2011) señalaron que en E. giganteum el tapete plasmodial invade sólo parcialmente la cavidad del esporangio cuando los esporocitos inician la meiosis I. En E. bogotense, el tapete pierde su integridad histológica en una etapa más temprana del proceso de esporogénesis e incluso es posible que la invasión del tapete estimule la maduración y posterior división reduccional de los esporocitos. En la meiosis I los esporocitos de E. bogotense están totalmente rodeados por el tapete plasmodial, encerrados en las cámaras plasmodiales individuales, de modo similar a lo descrito para E. arvense (Uehara & Kurita 1989) y E. flluviatile (Lehmann et al. 1984), mientras que en E. giganteum el tapete invade totalmente la cavidad de los esporangios hasta la formación y maduración de las tétradas (Rincón et al. 2011). Los movimientos del tapete y la formación de las cámaras plasmodiales también son similares a lo descrito para Psilotum nudum (L) P. Beav. (Psilotaceae) por Parkinson (1987). La posibilidad de que estas cámaras sean resultado del proceso de fijación fue descartada tanto en E. giganteum (Rincón et al. 2011) como en E. bogotense. Se las considera estructuras fundamentales para el desarrollo de las tétradas en maduración y es posible que intervengan sustancias complejas como mucílagos, que facilitarían el paso de los cuerpos multivesiculares que se observan ocasionalmente durante la esporogénesis de E. bogotense. Rincón et al. (2011) observaron que una vez que el tapete se desintegra sólo permanece una capa de células de apariencia picnótica, más o menos adherida a la pared del esporangio, condición que también se vio en E. bogotense aunque esa capa ya se observa antes de la degradación completa del tapete. No existen referencias sobre esta capa “remanente” para otras especies de Equisetum.
Los procesos relacionados con el movimiento de los orgánulos, la formación de la banda de orgánulos y su posterior separación entre las cuatro esporas resultantes al final de la meiosis son características de la meiosis espórica típica de las plantas y se han ]]>
Equisetum. ]]>
Esta banda de orgánulos permitiría el reparto equitativo de estos elementos celulares entre las células posmeióticas y además, dado que se presenta por lo general en especies con esporogénesis o microsporogénesis de tipo simultáneo, podría evitar interferencias entre los husos meióticos durante la meiosis II (Bednara et al. 1986). En plantas con esporogénesis simultánea hay depósitos y agregados de vesículas con material poco ]]>
et al. 1984, Bednara & Rodkiewicz 1985, Bednara et al. 1986, Brown & Lemmon 1990, Brown & Lemmon 1991b) una condición que también ese observó en E. ]]>
.
A diferencia de licófitos y helechos, las células de la pared del esporangio maduro de E. bogotense presentan diferentes grados de engrosamiento en todas sus caras pero no diferenciales en forma de “U”, por lo que es posible que la pared esporangial de Equisetum no ]]>
et al. 2011).
Marengo (1949), Marengo & Badalamente (1978) y Raghavan (1989) describieron los cambios citoplasmáticos durante la ]]>
Equisetum con los grupos megafílicos.
No existe acuerdo en el nombre que debe aplicarse a la delgada capa de material fibrogranular que separa la membrana citoplasmática del exosporio en las esporas maduras de Equisetum. Uehara & Kurita (1989) la llaman intina en el caso de E. ]]>
; Kedves & Párdutz (1998) generalizan el término endosporio, mientras que Lugardon (1990) y Tryon &Lugardon (1991) utilizan seudoendosporio para diferenciarla del endosporio propiamente dicho que, en Equisetum se formaría cuando la espora inicia la germinación (Gullvǻg 1968, Lugardon 1990, Tryon & Lugardon 1991). Aquí se designa esta capa como seudoendosporio, debido a que se forma al final de la esporogénesis y no durante la germinación de las esporas, como el endosporio. Así, ]]>
E. bogotense consiste de seudoendosporio, exosporio y perisporio.
El exosporio adulto está constituido por dos capas de similar espesor, aunque la capa interna es más electrodensa que la externa. Esta condición coincide con lo descrito para E. arvense ]]>
E. ramosissimum Desf. y E. palustre L. (Lugardon 1990, Tryon & Lugardon 1991). Uehara & Kurita (1989) utilizaron los términos exina interna y exina externa para referirse a las dos capas del exosporio, términos que aquí no se han utilizado por considerarlos más adecuados para granos de polen. Entre el exosporio y el perisporio de E. bogotense se observó ]]>
E. ramosissimum y E. palustre y por Kedves & Párdutz (1998) en E. arvense y considerada por éstos últimos como parte del exosporio. Las observaciones efectuadas en E. bogotense coinciden con estos autores; además esta capa de material es la responsable de la ]]>
E. bogotense.
Las orbículas de E. bogotense son cuerpos esféricos macizos formados por esporopolenina, que se originan a partir del tapete y se depositan juntamente con el perisporio, mientras que el ]]>
et al. (2010) las describieron en especies de Blechnum (Blechnaceae) y pese a diferencias en el tamaño, las designaron orbículas ]]>
Platycerium Desv., Drynaria (Bory) Sm., Christiopteris Copel. y Polypodium L. (Tryon & Lugardon 1991). Por lo observado en E. bogotense y otras especies del género, corresponde aplicar el término orbículas, dado que éstas se forman a ]]>
Tryon & Lugardon (1991) clasificaron los eláteres de ]]>
Equisetum en dos tipos según la forma del ápice: truncada, como el que se presenta en E. bogotense y atenuada como en E. hyemale e indicaron que están constituidos por dos capas fibrilares: una interna con fibrillas en disposición longitudinal y otra externa con fibrillas dispuesta transversalmente y menos electrodensa. Esta caracterización de los eláteres también fue descrita por Uehara & Kurita (1989) para E. ]]>
y por Lugardon (1990) para E. ramosissimum y E. palustre. Los autores mencionados coinciden en que los eláteres se unen al perisporio en la zona de la apertura esporal. Conclusiones previas sobre la morfología, ultraestructura y la disposición de los eláteres en relación al perisporio de E. bogotense se han confirmado aquí y es similar a las descripciones hechas para otras especies de Equisetum.
Agradecimientos
Los autores agradecen a las siguientes instituciones y personas: Instituto de Biología de la Universidad de Antioquia (UdeA), ]]>
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*Correspondencia a: Edgar Javier Rincón-Baron. Grupo de Estudios Botánicos y Docente del Instituto de Biología, Universidad de Antioquia (UdeA), calle 67 No. 53-108, Medellín, Colombia; ejrbaron@gmail.com Gerardo Andrés Torres. Unidad de Microscopía Electrónica, Profesor Departamento de Biología. Carrera 2 # 1A-25, Urbanización Caldas, Universidad del Cauca (UNICAUCA), Popayán, Colombia; gantorres@gmail.com Cristina Hilda Rolleri. 1) Laboratorio de Estudios de Anatomía Vegetal Evolutiva y Sistemática (LEAVES), Facultad de Ciencias Naturales y Museo, Universidad Nacional de La Plata, 64 entre 120 y diagonal 113, B1904 DZB, La Plata. 2) Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Buenos Aires, Argentina; crolleri@fcnym.unlp.edu.ar, tinar@speedy.com.ar 1. Grupo de Estudios Botánicos y Docente del Instituto de Biología, Universidad de Antioquia (UdeA), calle 67 No. 53-108, Medellín, Colombia; ejrbaron@gmail.com 2. Unidad de Microscopía Electrónica, Profesor Departamento de Biología. Carrera 2 # 1A-25, Urbanización Caldas, Universidad del Cauca (UNICAUCA), Popayán, Colombia; gantorres@gmail.com 3. 1) Laboratorio de Estudios de Anatomía Vegetal Evolutiva y Sistemática (LEAVES), Facultad de Ciencias Naturales y Museo, Universidad Nacional de La Plata, 64 entre 120 y diagonal 113, B1904 DZB, La Plata. 2) Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Buenos Aires, Argentina; crolleri@fcnym.unlp.edu.ar, tinar@speedy.com.ar