Crecimiento y composición bioquímica de Thalassiosira pseudonana (Thalassiosirales: Thalassiosiraceae) bajo cultivo semi-continuo en diferentes medios y niveles de irradiancias Growth and biochemical composition of Thalassiosira pseudonana (Thalassiosirales: Thalassiosiraceae) cultivated in semicontinuos system at different culture media and irradiances
Thalassiosira pseudonana is a marine Bacillariophyta commonly used as live feed in mariculture. The growth rate and biochemical composition of microalgae are highly influenced by environmental factors such as, irradiance and nutrient availability. The aim of this study was to investigate the influence of three ]]>
2.s) and two culture media (Algal and Humus) on growth and biochemical composition of this diatom. The microalga was grown semicontinuously at a daily renewal rate of fresh media of 30%, 37‰ salinity, 25±1ºC and constant aeration (200mL/min). The cell densities (cel/mL) and contents of protein, lipid, carbohydrate, chlorophyll a, total carotenoids, and fatty acids, showed significant differences (p<0.05) between treatments. During steady-state phase, the maximal cell density, and lipid and carbohydrate contents were of 4.62x106cel/mL, ]]>
2.s. Moreover, highest protein contents (45.0±5.05%) and total carotenoids (0.5±0.01%) were obtained in Algal medium at 180μE/m2.s. Chlorophyll a (0.93±0.04%) was higher at low irradiances in Algal medium. In both media, the fatty acids unsaturation degree was lower with increasing irradiance, being eicosapentaenoic acid, 20:5 n-3 (EPA) most represented (6.20%) in Algal medium at 60μE/m2.s. This strain of T. ]]>
showed multiple physiological responses to changes in culture conditions, and may be cultivated with an alternative medium, which reduced the operating costs and allowed a high nutritional biomass production value for animals under culture.
Thalassiosira pseudonana es utilizada como alimento en acuicultura, pero su valor nutricional ]]>
2.s) y dos medios de cultivo (Algal y Humus) fueron las condiciones en las que se determinó el crecimiento y componentes bioquímicos de T. pseudonana. En Humus a 180μE/m2.s se obtuvieron las máximas densidades celulares ]]>
6cel/mL) y mayores concentraciones de lípidos y carbohidratos, con porcentajes de 20.3±2.28 y 16.6±2.43, respectivamente. A 180μE/m2.s en Algal se observaron los mayores valores de proteínas (45.0±5.05) y carotenoides totales (0.5±0.01). El contenido de clorofila a fue favorecido por baja intensidad de luz, principalmente en Algal, con máximos de 0.9±0.04%. El grado de insaturación de los ácidos grasos disminuyó por incremento de la irradiancia en ambos medios, estando mayoritariamente ]]>
2.s. Los resultados muestran múltiples respuestas fisiológicas de T. pseudonana frente a cambios en las condiciones de crecimiento, las cuales pueden ser aprovechadas para mejorar su valor nutricional como alimento de organismos cultivados, utilizando medios de cultivo alternativos, que disminuyan los costos en ]]>
Palabras clave: Thalassiosira pseudonana, acuicultura tropical, ácidos grasos, autóctona, cultivo semicontinuo. ]]>
La disponibilidad de nutrientes y luz son los principales factores que influyen directa y separadamente sobre la fisiología del fitoplancton. Mientras los nutrientes son necesarios para la síntesis de biomasa, la irradiancia y calidad de luz determina la cantidad de energía disponible para actividades metabólicas. Las alteraciones fisiológicas que ocurren en el metabolismo celular, bajo condiciones limitantes para el crecimiento de las microalgas, son diferentes y dependen, principalmente, de la especie, de la cepa y de los factores ambientales ]]>
Los pigmentos fotosintéticos en su doble rol como componentes de biomasa y como sistema productor de energía son afectados cualitativa y ]]>
et al. 2005, Solovchenko et al. 2008, Vílchez et al. 2011) o para mejorar la calidad nutricional de microalgas que son utilizadas comúnmente en acuicultura (Meseck et al. 2005, ]]>
et al. 2012).
Por otro lado, las diatomeas planctónicas representan uno de los principales grupos autotróficos en ecosistemas marinos y fuente importante de alimento para sustento de la acuicultura. Diatomeas del género Thalassiosira son ]]>
et al. 2011) debido a su alto contenido de ácidos grasos poliinsaturados (AGPs); sin embargo, las cantidades producidas por esta microalga, no satisfacen las necesidades del sector acuícola, que evidencia un vertiginoso crecimiento a nivel mundial (Mischke & Zimba 2004), haciéndose necesario desarrollar sistemas de cultivos masivos con calidad bioquímica y/o valor nutricional estable, además de mínimos riesgos ]]>
et al. 2005, Guzmán-Murillo et al. 2007), debido a los considerables costos que implica la producción de alimento vivo.
En la ]]>
A fin de contribuir con el conocimiento de las respuestas fisiológicas de la cepa T. ]]>
, aislada de aguas tropicales, ante cambios en las condiciones de su entorno, se propuso evaluar el efecto combinado de la irradiancia y del medio de cultivo sobre su crecimiento y composición bioquímica; buscando además, incrementar la variedad de especies microalgales, con calidad nutricional, que puedan servir de alimento a larvas de organismos superiores en la cadena trófica que son producidos en criaderos de países tropicales.
Materiales y Métodos
Microorganismo seleccionado y condiciones de cultivo: La cepa (CCPUDO-39) de T. pseudonana, aislada de la costa oeste en la Península de Araya, estado Sucre, ]]>
2.s) en dos medios de cultivo, uno denominado Algal, pH=7.97±0.05 (Fábregas et al. 1984) de uso frecuente en acuicultura y el otro, un fertilizante comercial de bajo costo (Humus líquido® a pH ]]>
cuadro 1. Ambos medios de cultivo se prepararon a una concentración de 4mmoles/L de nitrato.
Cultivos de la diatomea, previamente aclimatados durante 10 días y en fase de crecimiento exponencial, sirvieron para inocular (2.0x105cel/mL) los matraces de vidrio contentivos del agua de mar con las condicionesarriba señaladas. Cuando los cultivos alcanzaron la fase de crecimiento exponencial, se procedió a realizar recambios diarios del 30% de su volumen total, es decir, el retiro del 30% del volumen total del cultivo, seguido de la reposición del mismo volumen, con su respectivo medio fresco.
Crecimiento poblacional: Desde el inicio de los recambios, y cada 24 horas, se tomaron muestras (1mL), por triplicado de cada tratamiento, y se fijaron con 50µL de una solución de lugol al 10% para realizar el recuento celular por microscopia de luz, utilizando un hematocitómetro Neubaüer de 0.01mm de profundidad. Con los datos obtenidos se elaboraron las curvas de crecimiento y a partir de éstas se determinaron las tasas instantánea de crecimiento, siguiendo las recomendaciones en Madigan et al. (1999).
Determinación de la composición bioquímica: Cuando los cultivos alcanzaron la fase de estabilización (caracterizada por no observar variaciones en las tasas de crecimiento), se tomaron muestras de 5mL, por triplicado en cada una de las variables estudiadas, las cuales se centrifugaron. El pellet celular obtenido se utilizó para realizar análisis del contenido de proteínas (Lowry et al. 1951), lípidos (Bligh & Dyer 1959, Marsh & Weinstein 1966) y carbohidratos (Dubois et al. 1956) totales, utilizando como estándares albúmina bovina, tripalmitina y D-glucosa, respectivamente. Para determinar el perfil de ácidos grasos, los extractos lipídicos, por triplicado, fueron transesterificados, en ésteres metílicos siguiendo las recomendaciones de Sato & Murata (1988). Los ésteres metílicos de ácidos grasos previamente obtenidos fueron separados y cuantificados utilizando un cromatógrafo de gases-espectrómetro de masas (GC-MS) Hewlett Packard Series G1800B, acondicionado con una columna Omegawax TM 250 de sílica fundida (Supelco) de 30x0.25mm de diámetro interno. Los ácidos grasos presentes en las muestras se identificaron mediante la comparación de los espectros de masas con los espectros contenidos en la biblioteca de espectros de masas NIST98, NBS75K y una biblioteca creada con 28 estándares de metil-ésteres de ácidos grasos (Sigma Chemical Company). Adicionalmente, se confirmó la identificación de los ácidos grasos mediante la comparación de los tiempos de retención de las muestras con los registrados para una mezcla comercial de metil-ésteres de ácidos grasos poliinsaturados (Sigma). También se determinó el contenido celular de clorofila a y carotenoides totales siguiendo la metodología en Strickland & Parsons (1972).
Los datos de crecimiento y composición bioquímica se analizaron a través de análisis de varianza de dos vías, considerando los niveles de irradiancia y los medios de cultivo como factores. Los datos fueron transformados a logaritmos de base diez, +10, para obtener homogeneidad de varianzas y distribución normal de los datos, siguiendo recomendaciones en Sokal & Rohlf (1995), además se aplicaron en casos necesarios las pruebas a posteriori de Scheffè.
Resultados
Crecimiento poblacional: En ambos medios de cultivo, T. pseudonana inició su fase de estabilización al noveno día de recambio en las dos menores irradiancias (60 y 120μE/ m2.s) y al décimo primer día de recambio a 180μE/m2.s (Fig. 1A, 1B y 1C). Las irradiancias, los medios de cultivo y la interacción de ambos influyeron significativamente (p<0.05) sobre el crecimiento de la diatomea, en los que se observó mayores densidades celulares (4.6±0.37x106cel/mL) a 180μE/m2.s en Humus; sin embargo, en este mismo medio pero a irradiancias de 60 y 120μE/m2.s, se registraron las menores densidades celulares, con valores de 1.9±0.24 y 1.2±0.16x106cel/ mL, respectivamente. Las tasas instantáneas de crecimiento variaron entre 0.45 y 0.56div/día sin mostrar diferencias significativas (p>0.05) entre las distintas condiciones de cultivo.
Bioquímica: Se observaron diferencias en el contenido de proteínas totales (p<0.05) cuando la diatomea fue cultivada en los dos medios a las diferentes irradiancias. El máximo contenido proteico (44.9±5.05%, Fig. 2A) se obtuvo a la mayor irradiancia evaluada y en el medio Algal. El contenido de lípidos totales de T. pseudonana (Fig. 2B) mostró diferencias significativas (p<0.05) entre los diferentes medios e irradiancias. Esta macromolécula alcanzó su mayor contenido (20.3±2.28%) en Humus a 180μE/m2.s; mientras que el menor porcentaje (7.8±1.62%) se observó en medio Algal a 60μE/m2.s. Se determinó interacción entre los factores (p<0.05), el cual deja en evidencia, un efecto sinérgico entre el medio Humus y la irradiancia, en función de una mayor concentración de lípidos. ]]>
Los carbohidratos totales (Fig. 2C) sólo mostraron diferencias significativas (p<0.05) entre las irradiancias; obteniéndose las mayores concentraciones de 16.7±2.43 y 15.7±0.74% a 180 y 120μE/m2.s, respectivamente, lo cual evidencia que ambas irradiancias ejercen efectos similares sobre la acumulación de carbohidratos en esta microalga.
Los AGPs representaron entre el 8.02 y 17.13% del total de ácidos grasos en T. pseudonana (Cuadro 2), encontrándose diferencias significativas (p<0.05) en las concentraciones de éstos, bajo las diferentes condiciones de cultivo ensayadas. El principal ácido graso poliinsaturado sintetizado fue el 20:5 n-3 (AEP), con mayores concentraciones de éste en medio Algal a 60 y 120μE/m2.s (6.2 y 6.03% respectivamente), mientras que en medio Humus se observó disminución en la biosíntesis de AEP a medida que se incrementó la irradiancia de los cultivos. El 20:4 n-6 (AA) fue sintetizado en mayor porcentaje en medio Algal a 180μE/ m2.s (2.16%), mientras que de los AGPs con C16, el más abundante fue el 16:3, con porcentajes máximos a la menor irradiancia en medio Algal (3.78%). Se detectaron cantidades relativamente pequeñas (entre 0.22 y 0.3%) de ácido docosahexaenoico, 22:6 n-3 (ADH), observándose un incremento de su concentración a medida que se incrementaba la irradiancia. Los contenidos totales de ácidos grasos saturados y monoinsaturados fueron observados en proporciones similares en Algal a las diferentes irradiancias, mientras que en Humus se observó mayor concentración de los saturados. El 16:1 n-7 fue el componente representativo del grupo de los ácidos grasos monoinsaturados (AGMs) con valores máximos de 16.53% en Algal a 60μE/m2.s y 20.46% en Humus a 120μE/m2.s, seguido del 18:1 n-9, el cual fue mayoritariamente acumulado a 60μE/m2.s tanto en Humus como en Algal con porcentajes de 9.98% y 13.21%, respectivamente. Dentro del grupo de los ácidos grasos saturados (AGSs) se observó como predominante al 16:0 con porcentajes entre 18.79% y 31.37%. El 14:0 mostró los máximos valores a 60μE/m2.s en Humus. También se evidenció mayor contenido del 18:0 cuando la microalga fue cultivada a 180μE/m2.s, tanto en Algal (12.73%) como en Humus (16.18%).
El nivel de irradiancia y los medios de cultivo influenciaron la composición pigmentaria. En Algal, el contenido de clorofila a fue significativamente (p<0.05) más alto (0.9±0.04%) durante la exposición a menor intensidad luminosa, mientras que los carotenoides totales mostraron una tendencia inversa a la clorofila a (Cuadro 3), siendo significativamente más altos a la mayor irradiancia en ambos medios de cultivo, obteniéndose las máximas concentraciones (0.5%±0.01) en Algal.
Discusión
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Los cambios en los parámetros físicoquímicos de los cultivos microalgales pueden modificar la cinética de crecimiento y el valor nutricional de estos microorganismos, por lo que la producción de biomasa, contenido pigmentario, proteínas, carbohidratos y lípidos entre otros, son parámetros útiles para medir la productividad microalgal así como el estado fisiológico de las células. Los resultados obtenidos muestran que la cepa CCPUDO-39 de T. pseudonana bajo estudio, ]]>
2.s en ambos medios de cultivo. La estabilidad en las concentraciones de biomoléculas y en la densidad celular puede atribuirse a la renovación de nutrientes, lo cual promueve en los cultivos una fisiología similar a la registrada durante la fase exponencial de cultivos discontinuos (Fábregas et al. 1995).
Para maximizar la productividad celular en cultivos semicontinuos es necesario establecer inicialmente las condiciones idóneas para cada especie, y la tasa de renovación representa un factor clave en dichos sistemas de cultivo (Fábregas et al. 2000). Algunos ensayos realizados previamente, demostraron que la tasa ]]>
et al. (1997), lo cual permitió obtener durante la fase de estabilización en ambos medios de cultivo a 180μE/m2.s, densidades celulares superiores y tasas específicas de crecimiento similares a las reportadas por Mansour et al. (2005). A pesar de que el crecimiento de T. pseudonana en Humus a 60 y ]]>
2.s fue bajo, el efecto combinado de éste, con el incremento de la irradiancia permitió la mayor producción de biomasa.
De acuerdo a los resultados obtenidos, el medio Algal fue superior comparado con Humus en variables como contenido de proteínas, producción de algunos ]]>
et al. 2007). Young ]]>
et al. (2008) establecen que cultivos microalgales deficientes de nitrógeno, son más fotosensibles, posiblemente atribuido a limitaciones en la síntesis de ]]>
Además, también están las diferencias en las concentraciones de fósforo entre ambos medios, siendo más abundante en Algal; limitación de este elemento, causa disminución en la eficiencia del transporte de electrones y con ello, daños a la ]]>
et al. 2008), los cuales, a pesar de no poseer fósforo en su estructura, su síntesis requiere de este elemento (Hou et al. 2007). Esto podría explicar las diferencias encontradas en el contenido de proteínas, lípidos, carbohidratos, pigmentos y biomasa de T. pseudonana ]]>
Thalassiosira weissflogii (Liu et al. 2011).
En otro orden de ideas, la influencia de los niveles de irradiancia en interacción con las diferentes fuentes y concentraciones de nutrientes, ejercen un marcado efecto sobre la composición bioquímica microalgal, ya que ]]>
et al. 1999) que es aprovechada para crecimiento y síntesis proteica, cuando son óptimos los niveles de nutrientes e irradiancia en los cultivos. El incremento en el contenido celular de proteínas por efecto de la irradiancia evidenciado en T. pseudonana cultivada en ]]>
Tetraselmis tetrathele (De la Peña & Villegas 2005), Navicula incerta (Uriarte et al. 2006) y Chlorella vulgaris (Seyfabadi et al. 2011).
Los mayores porcentajes de ]]>
et al. 1997, Solovchenko et al. 2008), sirviendo como fuente primordial de energía ante condiciones estresantes (Fábregas
et al. 2004). Por otro lado, tanto el contenido de lípidos totales, así como la modificación en la calidad de los mismos se ve influenciada por la intensidad de luz. Algunas especies como Phaeodactylum tricornutum, Pavlova sp. y Nannochloropsis spp. son conocidas como grandes productoras de AEP a bajas irradiancias (Khotimchenko & Yakovleva 2005, Patil et al. 2007), mientras que ]]>
Skeletonema costatum ha sido conocida como poca productora de AEP a bajas intensidades de luz (Guihéneuf et al. 2009).
Pratoomyot et al. (2005) reportan en Thalassiosira sp. como principales ácidos grasos al 16:0; ]]>
2.s. Un perfil similar fue encontrado en esta investigación, aunque los máximos de AEP (6.20 %) se obtuvieron a 60μE/m2.s en Algal, evidenciándose una tendencia a su disminución, con el incremento de la irradiancia en ambos medios, mientras que las concentraciones de ADH apenas fueron detectadas. Este comportamiento permite sugerir sobre el incremento en los porcentajes de ácidos grasos ]]>
Basova (2005) menciona que los cambios en los porcentajes de ácidos grasos microalgales están relacionados con las proporciones de las diferentes clases de lípidos los cuales pueden variar entre 2 y 44% dependiendo de ]]>
La ]]>
et al. 2002, Carvalho et al. 2009), esto coincide con los resultados evidenciados en esta investigación. Masuda et al. (2003) indicaron que bajas irradiancias, inducen en las células el incremento de pigmentos fotosintéticos tales como clorofila a ]]>
et al. 2008).
En el caso de los carotenoides totales, su incremento en conjunto con la irradiancia han sido atribuidos a la síntesis de pigmentos fotoprotectores como las xantofilas, diadinoxantinas y diatoxantinas los ]]>
et al. 2002).
Los resultados demuestran que la cepa de T. pseudonana analizada presenta un margen amplio de adaptación, evidenciados por los patrones diferentes de ]]>
Agradecimientos
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Los autores expresan su agradecimiento al Consejo de Investigación de la Universidad de Oriente, por su financiamiento a través del proyecto CI.-2-030603-1282/06. Se agradece el apoyo brindado para los análisis de los ácidos grasos a: Elena Palacios, Olivia Arjona y Laura Carreón del CIBNOR, México. ]]>
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Aleikar Vásquez-Suárez. Universidad de Oriente, Instituto Oceanográfico de Venezuela, Departamento de Biología Pesquera, Laboratorio de Acuicultura, Extensión Plancton. C. P. 6101. Cumaná, estado Sucre, Venezuela; valeikar@yahoo.es. Miguel Guevara. Universidad de Oriente, Instituto Oceanográfico de Venezuela, Departamento de Biología Pesquera, Laboratorio de Acuicultura, Extensión Plancton. C. P. 6101. Cumaná, estado Sucre, Venezuela; miguevara2003@yahoo.es. Mayelys González. Postgrado en Biología Aplicada, Casa N° 13, Cerro del Medio, Universidad de Oriente, Núcleo de Sucre, C. P. 6101. Cumaná, estado Sucre, Venezuela; mayelysg@hotmail.com Roraysi Cortez. Universidad de Oriente, Instituto Oceanográfico de Venezuela, Departamento de Biología Pesquera, Laboratorio de Acuicultura, Extensión Plancton. C. P. 6101. Cumaná, estado Sucre, Venezuela; roraysi@yahoo.com Bertha Arredondo-Vega. Laboratorio de Biotecnología de Microalgas, Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste (CIBNOR), Apdo. postal 128, La Paz, Baja California Sur, C. P. 23000, México; kittybcs2005@yahoo.com.mx 1. Universidad de Oriente, Instituto Oceanográfico de Venezuela, Departamento de Biología Pesquera, Laboratorio de Acuicultura, Extensión Plancton. C. P. 6101. Cumaná, estado Sucre, Venezuela; valeikar@yahoo.es, miguevara2003@yahoo.es, roraysi@yahoo.com 2. Postgrado en Biología Aplicada, Casa N° 13, Cerro del Medio, Universidad de Oriente, Núcleo de Sucre, C. P. 6101. Cumaná, estado Sucre, Venezuela; mayelysg@hotmail.com 3. Laboratorio de Biotecnología de Microalgas, Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste (CIBNOR), Apdo. postal 128, La Paz, Baja California Sur, C. P. 23000, México; kittybcs2005@yahoo.com.mx